Caractérisation du mucilage fractionné

L’analyse en RMN 1H, 13C et DOSY ainsi que les résultats de SEC ont permis de caractériser la composition et la structure globale de la gomme de lin. Pour approfondir ces recherches, le mucilage va être fractionné par dialyse selon le protocole de Maquart et coll. utilisé pour produire un mélange d’oligosaccharides neutres[363]. Ainsi, le fractionnement de la gomme de lin a été effectué comme montré sur le chromatogramme de la gomme de lin (Figure 57) à 8, 14 et 50 kDa.

Caractérisation par Infra-Rouge à Transformée de Fourrier

En tout premier, l’analyse FT-IR du fractionnement de la gomme de lin permet de mettre en évidence une grande variation de la composition de la gomme de lin.

Figure 64 : Superposition des spectres infrarouges des fractions de la gomme de lin.

En effet, la bande ν(C-O) des éthers (1040-1032 cm-1) et éthers aliphatiques (1106-1098 cm-1) pourrait indiquer la présence de carbohydrates de faibles masses molaires dans les fractions MD8. La figure 64 montre une diminution de la bande caractéristique des liaisons O-H des alcools (3278-3256 cm-1), des ν(C-H) des carbones aliphatiques (2950-2850 cm-1) ainsi que celle des acides carboxyliques (1413-1385 cm-1)[346–348] avec l’augmentation des masses moléculaires observées par rapport aux

ν(C-4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 éther aliphatique 1200 1100 1000 900 Longueur d'onde (cm-1) 1500 1400 1300 1200 Longueur d'onde (cm-1) 2 1 2 1 O-H acide C-H C-O/C-N C-O C-O éther Transmi tt an ce rel ative (u.a) Longueur d'onde (cm-1) MD8 MD8-14 MD14-50 MD50

O) des groupements éther des polysaccharides. Ceci pourrait signifier l’élimination progressive de composés avec l’élévation des masses molaires.

La forte diminution νas(COOH) pour la fraction MD50 confirme que les hautes masses molaires sont majoritairement constituées de la fraction neutre de mucilage mais aussi que de plus faibles portions d’oses acides sont présentes. Cette quasi-disparition du pic des fonctions carboxyles dans cette longueur d’onde laisse apparaître un pic de νω (ω : balancement) des liaisons C-H des CH2.

Les bandes à 1700-1500 cm-1 ainsi que celles à 1500-1300 cm-1, représentant les νs et νas des carboxyles, montrent une inversion d’intensité pour entre les fractions MD814 et MD14-50. Sur le spectre IR de la fraction MD8, un épaulement à 1662 cm-1 apparait indiquant la vibration d’élongation de la liaison C=O des groupements carboxyles des acides aminés[364,365]. L’inversion constatée peut être due à une augmentation du taux de protéines pour la fraction MD14-50 par rapport aux autre fractions, laissant penser que les glycoprotéines peuvent être présentes dans cette fraction[198].

Détermination de la composition de la gomme de lin

Les résultats de la composition de la gomme de lin en fonction des masses molaires sont répertoriés dans le tableau 19.

Tableau 19 : Composition de la gomme de lin fractionnée par dialyse extraite des graines de lin en deux extractions de 30 min sur canal US (25 °C, 200 W mode pulse 50%). Composition présentée en pourcentage massique de masse sèche.

Composés ^{Teneur des différentes fractions de gomme de lin (%m)}

Mucilage MD8 MD8-14 MD14-50 MD50 Fraction de gomme 100,0 20,5 13,3 8,1 57,7 Fraction acide 12,8 ± 0,2 1,0 ± 0,1 1,7 ± 0,0 7,6 ± 0,0 18,5 ± 0,1 Fraction neutre 39,6 ± 0,9 7,5 ± 0,2 9,6 ± 0,3 13,3 ± 0,3 58,2 ± 1,9 Acide/neutre (u.a) 0,32 0,13 0,18 0,57 0,32 Protéines totales 11,5 ± 0,2 10,6 ± 0,1 12,4 ± 0,2 26,5 ± 0,9 8,1 ± 0,3 Humidité 7,8 ± 0,4 - - - - Cendres 36,7* 42,5 34,0 33,7 23,8 Fuc 1,74 ± 0,01 0,04 ± 0,00 0,05 ± 0,00 0,10 ± 0,00 2,76 ± 0,01 Ara 4,69 ± 0,04 0,16 ± 0,01 0,24 ± 0,00 0,74 ± 0,00 7,31 ± 0,02 Rha 6,31 ± 0,09 0,58 ± 0,02 1,57 ± 0,04 5,49 ± 0,04 8,34 ± 0,10 Gal 6,31 ± 0,05 0,53 ± 0,02 0,62 ± 0,00 1,05 ± 0,00 9,55 ± 0,02 Glc 3,83 ± 0,11 1,69 ± 0,06 5,91 ± 0,15 4,13 ± 0,15 2,13 ± 0,01 Xyl 13,22 ± 0,05 0,21 ± 0,02 0,37 ± 0,00 1,05 ± 0,00 20,67 ± 0,09 Man 0,06 ± 0,01 0,05 ± 0,02 0,20 ± 0,00 0,12 ± 0,00 0,03 ± 0,00 GalA 6,55 ± 0,46 0,37 ± 0,07 0,57 ± 0,00 1,69 ± 0,00 8,55 ± 0,05 GlcA 0,31 ± 0,26 0,08 ± 0,01 0,14 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,09 ± 0,00

*Taux de cendres déterminé par ATG, le reste par analyse des composés élémentaires

Le tableau 18 permet de mettre en évidence que la gomme de lin est constituée principalement de molécules de hautes masses molaires (MD50 = 57,7 %m) et de faible masses molaires (MD8 = 20,5 %m). L’augmentation du taux de protéines pour la fraction MD14-50 confirme l’hypothèse émise par l’étude des fractions de gomme de lin par FT-IR et ajoute un argument sur la

présence des glycoprotéines dans cette fraction. Le rapport fraction acide/neutre montre que les masses molaires au-dessus de 14 KDa, notamment celle à 14-50 kDa, contiennent les fortes proportions d’oses acides du mucilage. Ceci est en adéquation à la théorie de Warrand et nos observations en SEC et DOSY, sur la constitution de fractions acides de masses molaires moyennes (17-35 kDa) et élevées (650-870 kDa)[207].

Même à haute masse molaire le taux de cendres reste élevé tandis que la dialyse aurait dû éliminer les minéraux. Une partie des explications peut provenir du fait que les pectines réagissent avec des minéraux, notamment le calcium qui permet de créer les ponts calciques dans les parois cellulaires du lin, formant les pectates de calcium[114,115] emprisonné dans une structure appelée « boîte à œuf »[77,366]. La somme des constituants (carbohydrates + protéines + cendres) révèle, pour les fractions <50 kDa, la présence d’autres non analysés comme des huiles[200,279], des cires[187] ou encore des composés phénoliques[200,367].

Le dosage des monosaccharides permet de mettre en évidence la faible teneur en polysaccharides pour les fractions inférieures à 14 kDa où l’ose majoritaire est le glucose tandis que pour les fractions molaires plus élevées, le rhamnose (5,5 %m) et le xylose (20,7 %m) deviennent majoritaires pour les fractions MD14-50 et MD50 respectivement. Ainsi, les fractions <14 kDa ont une faible viscosité et le comportement rhéologique est fortement lié à celui des acides aminés et des autres composés. Quant à la solution comportant la fraction MD14-50, étant donné sa forte concentration en oses acides, aura un comportement newtonien. La fraction MD50 sera associée à un comportement à la fois newtonien et rhéofluidifiant[208] de haute viscosité lors de l’absence de sollicitation dû à l’enchevêtrement des chaînes linéaires de hautes masses molaires[217].

Analyse RMN des fractions dialysées

Les fractions de gomme de lin ont été analysées par RMN 1H et 13C afin de pouvoir mieux définir la composition et la structure en fonction des gammes de masses molaires étudiées.

Figure 65 : Superposition des spectres RMN a) 1H et b) 13C des fractions de gomme de lin (D2O).

MD50

MD14-50

MD8-14

MD8

La fraction MD8, contient une forte présence d’acides aminés et confirme que l’ose la plus présente est le glucose (5,18 ; 3,48/71,5 ; 3,66/73,54 ; 3,77/72,04 ; 3,71/62,47 ppm)[368]. La forte présence de glucose est expliquée par l’apparition, dans la gamme des composés phénoliques, des FeAG (7,18 ppm, 6,43 ppm) et CouAG (7,54 ppm) avec lesquelles ils se lient pour former les lignanes. La présence des lignanes sous forme complexe est démontrée aussi par la présence des pic de HMGA (1,34 ppm) et du SDG (6,60 ; 6,87 ; 3,98 ppm) et HDG (8,05 ppm)[200,201]. D’autres composés acides non-liés au glucose sont présents comme l’acide hydroxybenzoïque, l’acide formique qui laisse apparaître un pic de forte intensité à 8,46/173 ppm et l’acide tartarique. Si le glucose est bien présent dans la fraction MD8 la présence de rhamnose et de galactose, respectivement 2ème et 3ème constituants, sont visibles sur le spectre proton et sur les pics entre 78-76 ppm du spectre carbone. Par ailleurs, les acides aminés comme l’alanine (1,38 ppm) et le L-tryptophane sont détectés sur le spectre proton. Des pics pouvant correspondre aux groupements des acides aminés ou autre acides décrits précédemment sont révélés sur le spectre carbone.

L’ensemble des fractions <50 kDa montrent des profils similaires avec la présence de composés phénoliques, une quantité importante d’acide acétique (1,92 ppm), tartarique et de choline (3,21 ;57 ppm) ainsi que d’acide linoléique. Le spectre carbone de la fraction MD8-14 montre que la majorité de sa constitution en carbohydrates est formée de glucose. Cependant la proportion de composés phénoliques semble plus faible que pour les fractions MD8 et MD14-50. La fraction MD14-50 met en évidence sur les spectres 1H et 13C la plus grande concentration et diversité en polysaccharides. En effet, le xylose (4,44 ppm), l’acide galacturonique (3,90 ; 3,97 ; 4,00 ppm) sont visibles dans la partie des squelettes de carbohydrates et les protons anomériques montrent une grande variété d’oses : xylose (5,18), glucose (5,00 ppm), rhamnose (1,26 ;17,92 ppm), acide galacturonique (5,28 ppm) et l’arabinose (5,13 ppm). Le spectre proton de la fraction MD50 présente, quant à lui, des massifs signalant la présence d’oligomères de large distribution de masses molaires. Dans cette fraction, les pics des acides aminés et des composés phénoliques et autres composés (acide linoléique, choline) ne sont plus visibles. Par ailleurs, l’analyse RMN confirme le fait que la plupart des polysaccharides sont présents dans les fractions >14 kDa et notamment dans MD50 tandis que les macromolécules de lignanes sont extraites dans les fractions <50 kDa.

L’analyse des spectres DOSY des fractions de gomme de lin (Annexe 7) montre un déphasage des spectres avec l’augmentation de la température. Les gammes de diffusion à des températures de 298 et 333 K des fractions de gomme de lin sont présentées dans le tableau 20. L’examen des spectres montre que la vitesse de diffusion augmente pour chacune des fractions avec l’accroissement de la température. Le rapport de la vitesse de diffusion maximale sur la vitesse de diffusion minimale (RT) permet de donner un indicateur de la dispersion en taille des molécules. Ce ratio de dispersion pour chaque température étudiée augmente avec la taille des fractions observées (à 298 K, MD8 : RT = 5,3, MD50 : RT = 278). Le rapport entre R25 et R60 permet de donner une indication sur la contraction (Ic)

des molécules. Si Ic<1, les molécules vont se relâcher avec l’augmentation de la température. Si Ic=1 la température n’a pas d’effet sur le comportement des molécules et si Ic>1 les molécules se contractent avec la hausse de température.

Tableau 20 : Résultats des gammes de diffusion des fractions de gommes de lin étudiées par RMN DOSY à 298 K et 333 K dans le D2O. Nom ^{D (10} -6 m.s-1) RT=RMax/Min (u.a) Ic=R25/R60 25 °C 60 °C 25 °C 60 °C (u.a) MD8 Max 13,21 30,20 5,3 4,8 1,1 Min 2,47 6,33 MD8-14 Max 14,02 33,40 6,6 6,3 1,1 Min 2,12 5,34 MD14-50 Max 12,30 30,90 10,8 3,7 2,9 Min 1,14 8,33 MD50 Max 11,10 27,20 278 143 1,9 Min 0,04 0,19

Les résultats du tableau 20 mettent en évidence que la température n’affecte que peu le comportement des fractions MD8 et MD 8-14 tandis que les fractions plus élevées révèlent que les macromolécules tendent à se contracter avec l’élévation de la température. Ce phénomène est plus important dans le cas de la fraction MD14-50 que MD50. Dans la fraction MD14-50, la gomme de lin est constituée de polysaccharides et d’une forte fraction de protéines contrairement à la fraction MD50. Le phénomène observé peut donc être lié aux protéines. Afin de confirmer l’agrégation des chaînes macromoléculaires, une analyse en spectrofluorimétrie en température de la gomme de lin/NR va être présentée.