l’âge adulte ou au cours du développement, est étudiée dans des conditions basales. Le vecteur rétroviral est injecté dans le courant de migration rostral chez des animaux à P6 ou P60, puis 8 semaines plus tard le RABV est injecté dans le bulbe olfactif ; aucun test comportemental n’est donc réalisé dans cette expérience.
II.C.1.a Caractérisation des populations de cellules starters
Dans un premier temps, les populations de cellules starters des animaux injectés à P6 ou P60 ont été comparées. En effet, des différences entre ces deux populations pourraient constituer un biais lors de la comparaison de leurs connexions présynaptiques.
Les cellules starters sont majoritairement des cellules en grain : elles présentent une morphologie caractéristique, avec une longue dendrite apicale ramifiée. Les populations de cellules en grain formées à P60 ou à P6 sont comparables [Figure II.2]. Quelques cellules à axone court profondes et périglomérulaires doublement marquées peuvent aussi être observées. Dans la mesure où on cherche ici à étudier la connectivité des cellules en grain, les animaux dont la population de cellules starters est composée de moins de 85% de cellules en grain ont été exclus des analyses. Quantitativement, le nombre de cellules
starters semble légèrement plus élevé pour les animaux injectés à P60, et ceci malgré
l’injection d’un plus grand volume de vecteurs rétroviraux pour les animaux injectés à P6 (P6 : 800 nL par hémisphère ; P60 : 400 nL par hémisphère). Ces résultats pourraient s’expliquer par la plus grande difficulté à cibler le courant de migration rostral lors des chirurgies réalisées sur les souriceaux de 6 jours. Malgré cette légère tendance, les résultats entre les deux groupes ne sont pas significativement différents. La localisation des cellules
starters selon l’axe médio-latéral est similaire pour les deux populations : les cellules
semblent réparties selon une loi normale, avec une densité cellulaire plus importante entre 0,60 et 0,90 µm. Ces résultats sont cohérents avec le protocole expérimental, puisque l’injection du RABV a été réalisée à 0,75 µm selon l’axe médio-latéral, et la diffusion du vecteur viral est limité à une certaine distance (environ 200 µm ici). Enfin, la localisation des cellules starters selon la profondeur dans la couche des cellules en grain est quant à elle différente entre les deux populations. Les cellules formées à l’âge adulte sont localisées dans les zones plus profondes (Z3), tandis que celles formées au cours du développement néonatal sont situées plus superficiellement (Z1) ; ces résultats sont en accord avec de précédentes études, réalisées à l’aide d’outils différents [Lemasson et al. (2005); Kelsch et al. (2007); Mouret et al. (2008)]. Il sera donc important de prendre cette différence en considération lors de l’interprétation des résultats de connectivité.
Figure II.2 – Caractérisation des populations de cellules starters
(A) Images obtenues par microscopie confocale de cellules starters doublement marquées (DsRed+/GFP+, en jaune) formées à P60 (en haut) ou à P6 (en bas). Echelle : 50 µm. (B) Quantification du nombre de cellules starters pour les animaux injectés à P60 ou à P6 (test de Mann-Whitney, P = 0,31, n = 7). (C) Localisation des cellules starters selon l’axe médio-latéral (ANOVA à deux facteurs à mesures répétées, effet groupe : F1,12 = 0,70, P = 0,42, n = 7). (D) A gauche, coupe sagittale de bulbe olfactif montrant la délimitation des 3 zones de profondeur dans la couche des cellules en grain (Z1 : superficielle, Z2 : intermédiaire, Z3 : profonde). A droite, localisation des cellules starters selon la profondeur (test de Mann-Whitney, Z1 : P = 0,0043 ; Z2 : P = 0,65 ; Z3 : P = 0,0043, **P < 0,01, n = 5-6).
II.C.1.b Analyse qualitative des connexions présynaptiques
Les partenaires présynaptiques des cellules en grain formés à P60 ou P6 ont été com-parés selon leur nature, leur morphologie et les régions dont ils sont originaires [Figure II.3]. De nombreux neurones présynaptiques sont localisés dans le bulbe. Que ce soit pour les cellules en grain formées à P60 ou à P6, la majorité des neurones présynaptiques sont des cellules à axone court profondes. On retrouve aussi des cellules de Blanes, des cellules à axone court superficielles, ainsi que quelques cellules mitrales et à panache. Ces résul-tats sont cohérents avec ceux de précédentes études [Arenkiel et al. (2011); Deshpande et al. (2013)]. Les cellules en grain formées à P60 et à P6 sont aussi connectées par des fibres centrifuges en provenance de différentes régions corticales et sous-corticales. Ces neurones présynaptiques sont retrouvés essentiellement dans deux régions, l’AON et le cortex piriforme, comme cela a déjà été observé précédemment [Deshpande et al. (2013)].
Figure II.3 – Nature et localisation des neurones présynaptiques
(A) Que ce soit pour les cellules starters formées à P60 ou à P6, la majorité des neurones pré-synaptiques présents localement dans le bulbe olfactif sont des cellules à axone court (CACs) profondes ou superficielles, des cellules de Blanes, ainsi que des cellules mitrales ou à panache. Echelle : 20 µm. (B) Que ce soit pour les cellules starters formées à P60 ou P6, leurs parte-naires présynaptiques proviennent des mêmes régions corticales. AON : noyau antérieur olfactif ; MCPO : noyau magnocellulaire préoptique. I, II, III : couches du cortex piriforme. Echelle : 20
µm. (C) Caractérisation des neurones présynaptiques : les fibres en provenance de l’AON (en
haut) et du cortex piriforme (non représenté ici) sont majoritairement des cellules de projection (CamKII+), tandis que celles en provenance des noyaux HDB/MCPO peuvent être GABAer-giques (GAD65/67+) et/ou cholinergiques (ChAT+). Echelle : 50 µm.
Des résultats préliminaires montrent que dans le cortex piriforme et l’AON, ce sont principalement des neurones de projection qui contactent les cellules en grain [Figure II.3] ; on observe également dans ces régions quelques neurones GABAergiques. Les noyaux HDB/MCPO comprennent également une quantité importante de partenaires présynap-tiques, à la fois des neurones GABAergiques et cholinergiques. Dans une moindre mesure, on observe également des neurones dans la tenia tecta, l’amygdale corticale et l’hippo-campe ventro-latéral, en particulier dans le subiculum ventral et la région CA1. Dans la mesure où quelques cellules starters sont observées dans le bulbe olfactif accessoire, on peut imaginer que les fibres centrifuges provenant de l’hippocampe contactent en parti-culier les neurones de cette région [Mohedano-Moriano et al. (2012)].
En résumé, les cellules en grain formées à l’âge adulte et au cours du développement sont connectées par des populations neuronales similaires en provenance des mêmes ré-gions, à la fois localement dans le bulbe olfactif et à plus grande échelle dans les régions corticales et sous-corticales. Qualitativement, les connexions présynaptiques des deux po-pulations de cellules en grain sont donc semblables.
II.C.1.c Analyse quantitative des connexions présynaptiques
Dans un second temps, les connexions présynaptiques des cellules en grain ont été étudiées quantitativement [Figure II.4]. Dans le bulbe olfactif, le nombre de partenaires présynaptiques locaux des cellules en grain, c’est-à-dire essentiellement les cellules à axone court profondes dans la couche des cellules en grain (CCG), est plus important pour les néo-neurones formés à P60 que ceux formés à P6. En effet, pour les cellules en grain générées à P60, le ratio de connectivité moyen est d’environ 3, ce qui signifie qu’une cellule en grain est contactée par 3 cellules à axone court profondes ; le ratio de connectivité est près de 2 fois plus faible pour les cellules en grain formées à P6. Ces différences sont encore plus importantes pour les partenaires présynaptiques en provenance des régions du cortex olfactif. Que ce soit pour l’AON, les noyaux HDB/MCPO ou le cortex piriforme, les ratios de connectivité sont beaucoup plus élevés pour les cellules en grain formées à P60 que pour celles formées à P6 : en effet, pour la majorité des animaux injectés à P6, presque aucun neurone présynaptique n’est observé dans ces régions. En proportion, les cellules en grain formées à P6 sont donc contactées par un plus grand nombre d’interneurones bulbaires que celles formées à P60. Enfin, pour les animaux injectés à P60 et à P6, le nombre de neurones présynaptiques est bien proportionnel au nombre de cellules starters. Les connexions présynaptiques des cellules en grain formées à l’âge adulte sont donc beaucoup plus nombreuses, ce qui pourrait en partie expliquer le rôle spécifique de cette population neuronale dans l’apprentissage associatif.
Figure II.4 – Quantification des connexions présynaptiques
(A) Exemples de coupes sagittales de cerveaux pour des animaux injectés à P60 (à gauche) et à P6 (à droite). Les cellules en grain formées à P60 ou P6 sont marquées en rouge (DsRed+), les cellules starters sont marquées en jaune (DsRed+/GFP+) et les partenaires présynaptiques des cellules starters sont marqués en vert (GFP+). Echelle : 1 mm. (B) Connexions des cellules
starters formées à P60 ou P6 avec les interneurones présynaptiques présents dans la couche des
cellules en grain (CCG) (test de Mann-Whitney, P = 0,0041, **P < 0,01, n = 7). (C) Connexions des cellules starters formées à P60 ou P6 avec les neurones présynaptiques présents dans l’AON (test de Mann-Whitney, P = 0,012, **P < 0,01, n = 7). (D) Connexions des cellules starters formées à P60 ou P6 avec les neurones présynaptiques présents dans les noyaux HDB/MCPO (test de Mann-Whitney, P = 0,041, **P < 0,01, n = 7). (E) Connexions des cellules starters formées à P60 ou P6 avec les neurones présynaptiques présents dans le cortex piriforme (test de Mann-Whitney, P = 0,012, **P < 0,01, n = 7). (F) Graphiques représentant pour chaque groupe (P60 à gauche, P6 à droite) la proportion des différents partenaires présynaptiques des cellules starters (test de Mann-Whitney, CCG : P = 0,011 ; AON : P = 0,016 ; HDB/MCPO : P = 0,023 ; CtxPir : P = 0,0023, n = 7). (G) Corrélation entre le nombre de cellules starters formées à P60 ou P6 et le nombre de neurones présynaptiques totaux (test de Pearson, P60 : r