8.3 Observation temporelle de la dynamique ultrarapide
8.3.2 Application de l’ellipsom´ etrie au sondage de l’´ etat de mati` ere
O cromóforo rodamina B foi escolhido como reagente para os testes iniciais por apresentar baixa toxicidade, expondo a menos riscos de contaminação os envolvidos nos experimentos e gerando um resíduo de risco muito menor para o meio ambiente.
A Figura 22 mostra o espectro de excitação (absorção) e emissão de fluorescência para a rodamina B com indicações dos valores de máximo de absorção (554 nm) e máximo de emissão (575 nm) para a substância.
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Comparando-se este espectro de absorção com o espectro de emissão do LED (Figura 16), observa-se que o LED emite na região de excitação do fluoróforo, embora não exista coincidência entre os máximos de emissão do LED (fonte) e excitação da rodamina B (fluoróforo). Observa-se também que o filtro óptico utilizado apresenta uma boa taxa de transmitância (Figura 18) a partir de aproximadamente 600 nm. Esta faixa compreende uma parte do espectro de emissão da rodamina B, permitindo que as medidas analíticas sejam realizadas.
Figura 22 - Espectros de absorção e emissão para rodamina B.
Utilizando este fluoróforo, foram construídas curvas analíticas na faixa de 0,01 a 0,20 mg L-1 no fluorímetro proposto (Figura 23) e também em um espectrofluorímetro comercial utilizando o comprimento de emissão em 575 nm e de excitação em 554 nm (Figura 24). A curva construída com o fluorímetro desenvolvido apresentou um coeficiente de determinação de 0,9990, o qual é comparável ao obtido com o sistema comercial para a faixa estudada (R2=0,9971) e demonstra um desempenho adequado do sistema em termos de linearidade. O para o fluorímetro de LED proposto foi calculado um limite de detecção de 0,004 mg L-1 e um limite de quantificação de 0,012 mg L-1. Para o espectrofluorímetro de bancada foram calculados os limites de detecção de
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0,001 mg L-1 e de quantificação de 0,002 mg L-1. Apesar dos limites encontrados para o instrumento de LED proposto serem maiores que os encontrados para o espectrofluorímetro de bancada, pode-se considerar que estes estejam na mesma ordem de grandeza e que os valores encontrados são comparáveis, indicando que o instrumento proposto tem um desempenho próximo ao desempenho do espectrofluorímetro de bancada, levando em consideração o custo de construção e os materiais utilizados.
Figura 23 - Curva analítica para rodamina B adquirida com o fluorímetro construído
Figura 24 - Curva analítica para rodamina B obtida no fluorímetro em um fluorímetro comercial de bancada
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5.1.5 - Testes iniciais com Brometo de Etídio
Os resultados anteriores com rodamina B demonstram que o instrumento é capaz de detectar o sinal tão bem quanto um instrumento de bancada. Para o brometo de etídio foram realizados testes preliminares com o objetivo de averiguar se o equipamento é sensível o suficiente para detectar o composto e perceber a variação de fluorescência que acontece quando se adiciona o DNA.
Os espectros apresentados na Figura 25 foram obtidos para uma solução de 5,0 mg L-1 de brometo de etídio adquiridos com um espectrofluorímetro comercial. Pode-se observar a absorção e emissão do fluoróforo sem estar intercalado com DNA. Ainda na Figura 25 é possível observar o aumento da intensidade de fluorescência quando o brometo de etídio está intercalado com o DNA e que existe um leve deslocamento da banda de emissão de 600 nm para comprimentos de onda maiores cerca 603 nm, enquanto o máximo de excitação (absorção) sofre um leve deslocamento da posição inicial 515 nm para 525 nm.
Figura 25 - Espectros de excitação e emissão para uma solução 5,0 mg L-1 de BE adquirida em um
espectrofluorímetro comercial, sem adição de DNA e com adição de DNA.
400 500 600 700 800 0 100 200 300 400 500 600 700 F lu o re scê n ci a a .u . Comp. de onda (nm)
Excitaçao sem DNA Emissao sem DNA Excitaçao com DNA Emissao com DNA
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A variação da fluorescência com o intercalamento também foi observada com o instrumento proposto, utilizando as mesmas condições utilizadas para o equipamento de bancada. Conforme apresentado na Figura 26, observa-se um aumento significativo da fluorescência (cerca de 2,5 vezes) em relação ao fluoróforo não intercalado. Esse resultado indica a possibilidade de uso do instrumento para a aplicação do projeto, pois a concentração aproximada de brometo de etídio usada neste experimento foi de 1,5 mg L-1 e os protocolos como o da Universidade de Princenton permitem o descarte de soluções deste fluoróforo em concentrações menores que 10 mg L-1 sem necessidade de tratamentos. (48)
Figura 26 - Variação da fluorescência de uma solução 1,5 mg L-1 de Brometo de Etídio quando na
ausência e na presença de DNA adquirido no fluorímetro construído.
Com o objetivo de avaliar a capacidade analítica do fluorímetro proposto na determinação do fluoróforo BE, realizou-se um teste por adição de alíquotas de um padrão de BE diretamente à cubeta já contendo a solução de DNA tamponada. Foram realizadas adições sucessivas de 20 µL de uma solução 100 mg L-1 de Brometo de Etídio a uma cubeta que continha 2,5mL de tampão TBS (pH=7,5) e 0,5 ml de solução de DNA 2 mg mL-1 .Pode-se observar na Figura 28 que a curva analítica construída para uma faixa de concentração aproximada de 0,05 a 0,5 mg L-1 em BEapresentou uma linearidade adequada
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(R2=0,996) indicando a possibilidade de uso do instrumento para a aplicação quantitativa113 Com base nas leituras e na projeção do gráfico da Figura 27 (ponto onde o gráfico se curva na parte inferior da curva estimada), estimou-se de forma visual um limite de detecção de aproximado de 0,05 mg L-1 para o método com o instrumento proposto, um valor bem abaixo do que o sugerido para um descarte seguro.
Figura 27 – Variação do sinal de fluorescência para adições sucessivas de BE em um meio tamponado e com presença de DNA no instrumento proposto.