Analyses préliminaires

Les extraits bruts ont été solubilisés à raison de 10 mg/mL dans un solvant adéquat : le dichlorométhane pour les extraits apolaires et le méthanol pour les extraits polaires. Ils ont ensuite été analysés par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) dans les conditions expérimentales décrites en 5.2.1. Outre l’observation sous rayonnement UV à 254 nm et 366 nm, les plaques ont été révélées à l’aide de réactifs chimiques présentés au point 5.5.1, dans le but de donner un premier aperçu de la composition des échantillons.

Pour les analyses par HPLC/DAD-UV, les extraits bruts ont été solubilisés dans un solvant adéquat : l’acétonitrile (CH3CN) pour les extraits apolaires, et le méthanol pour les extraits

polaires. Dans le cas des extraits apolaires difficilement solubles, ils ont au préalable été dissous dans un volume minimal de tétrahydrofurane (THF), puis complétés ad 1 mL. Après centrifugation et décantation, les solutions ont été injectées dans un système HPLC (conditions décrites en 5.2.2), et analysées selon les conditions suivantes :

• échantillon : 10 μL d’une solution à 10 mg/mL d’extrait ; • colonne : NovaPak® C18 (5 μm, 150 x 3,9 mm d.i. ; Waters) ;

• phase mobile : débit 1 mL/min avec les gradients linéaires suivants :

a) CH3CN-H2O 30:70 → 100:0 en 30 min (extraits DCM) ou

b) MeOH-H2O 30:70 → 100:0 en 30 min (extraits MeOH, EtOH

ou n-BuOH) ;

• détection : DAD-UV à 210 nm, 254 nm et 366 nm.

Le criblage chimique sur plaque CCM a permis de mettre en évidence relativement peu de classes de composés. La révélation au réactif général de Godin (1954) a montré la présence systématique, dans les extraits bruts polaires, de tanins sur la ligne de dépôt (coloration rouge) (Wagner and Bladt, 1996). Ces mêmes taches prenaient une coloration rouge-brune avec le réactif au chlorure de fer. Quant aux extraits obtenus à partir des fruits de la famille Sapindaceae, de nombreux composés prennent une coloration violette suite au giclage de la CCM avec le réactif de Godin, permettant alors de supposer la présence de saponines (cf. 5.5.1).

La présence de ce type de composés n’est pas surprenante, car ils sont fréquemment décrits chez les espèces de cette famille (Bruneton, 1999). Quant au réactif de Dragendorff, seul l’extrait méthanolique de B. reticulata a montré une faible réaction. Il semblerait donc, a priori, que la forme toxique du fruit de D. senegalense ne comporte pas ce type de composés, ce qui est en désaccord avec les études faites par Paris et Moyse-Mignon (1947) (cf. chapitre 2.5.4.2). Cependant, ces chercheurs avaient mis en évidence ce type de composés en quantité de traces, et de plus, par le biais d’un autre réactif : celui de Mayer et Bouchardat.

Lors de l’interprétation des résultats obtenus par réactions chimiques effectuées sur CCM, il faut garder à l’esprit qu’elles ne sont qu’indicatives, et que la présence de résultats faux positifs ou faux négatifs est fréquente.

3.2.1 Elimination des sucres

Une investigation phytochimique de fruits peut présenter quelques inconvénients en raison du taux élevé en sucres. En effet, les extraits méthanoliques ou éthanoliques préparés, compte tenu de la polarité des solvants employés, extraient les sucres de façon presque totale. Ces extraits sont par conséquent collants, très hygroscopiques et des concentrations élevées doivent être employées pour pouvoir détecter les métabolites secondaires, ce qui a effectivement été observé lors des analyses préliminaires par CCM ou HPLC/UV-DAD. Par conséquent, deux méthodes ont été employées pour éliminer les sucres. La première est le partage liquide-liquide n-BuOH/H2O, appliqué aux extraits de péricarpes, supposés pauvres en sucres, de Nephelium

ramboutan-ake et de Dimocarpus longan. Cette méthode d’élimination des sucres présente l’avantage de ne nécessiter que peu de matériel, mais un inconvénient est la formation d’une émulsion à l’interface difficilement éliminable. Cette technique est peu appropriée pour des extraits très riches en sucres, car il faudrait un nombre très élevé d’extractions, engendrant alors de nombreuses pertes au niveau des métabolites secondaires recherchés. Dès lors, les extraits de mésocarpe ou de mésocarpe + péricarpe, contenant une très grande proportion de sucres, ont été traités au moyen d’une colonne chromatographique ouverte sur résine échangeuse d’ions Diaion® _{HP20/L. Ces deux méthodes sont décrites dans les chapitres 5.3.1 et 5.3.2,}

respectivement, tandis que les rendements des extraits sans sucre obtenus sont présentés dans les Tableaux 3.2 et 3.3. Seuls les fruits présentant un intérêt marqué ont été traités de cette manière.

Ainsi, les extraits méthanoliques de Bauhinia reticulata, Ziziphus zizyphus et Talisia esculenta n’ont pas été traités, en raison du nombre d’études importantes déjà réalisées sur ces fruits.

Tableau 3.2 – Extraits sans sucre obtenus par colonne chromatographique ouverte sur résine échangeuse

d’ions Diaion® _HP20/L

Plante / organe Extrait (poids) Extrait sans sucre (poids)

Rendement

Detarium microcarpum / mésocarpe +

péricarpe MeOH (116 g) MeOH s.s. (8.6 g) 7.4 %

D. senegalense forme comestible /

mésocarpe + péricarpe MeOH (21.5 g) MeOH s.s. (1.6 g) 7.2 %

D. senegalense forme toxique /

mésocarpe + péricarpe (20.6 g) MeOH MeOH s.s. (2.2 g) 10.7 %

Bauhinia reticulata / mésocarpe +

péricarpe

n.t. n.t. n.t.

Ziziphus zizyphus / mésocarpe +

péricarpe

n.t. n.t. n.t.

Nephelium ramboutan-ake / mésocarpe EtOH

(10.4 g)

EtOH s.s. (0.6 g)

5.6 %

Dimocarpus longan / mésocarpe EtOH

(16.5g)

EtOH s.s. (1.2 g)

7.2 %

Talisia esculenta / péricarpe n.t. n.t. n.t.

n.t. non traité

Tableau 3.3 – Extraits sans sucre obtenus par partage n-BuOH/H2O

Plante / organe Extrait fractionné (poids)

Extrait butanolique sans sucre (poids)

Rendement

Nephelium ramboutan-ake / péricarpe EtOH

(23.36 g)

n-BuOH s.s. (14.04 g)

60.1 %

Dimocarpus longan / péricarpe EtOH

(4.26 g)

n-BuOH s.s. (1.08 g)

25.4 %

Les rendements d’extraction obtenus pour les extraits de mésocarpes de Nephelium ramboutan-ake et de Dimocarpus longan ne sont que des valeurs indicatives, étant donné que les fruits n’étaient que partiellement lyophilisés. Malgré cela, l’hypothèse de départ qui consistait à penser que la teneur en sucres était nettement plus faible dans le péricarpe que dans le mésocarpe, est confirmée. Concernant les trois extraits méthanoliques des fruits de Detarium, leur teneur en sucres est semblable, et avoisine les 90 %.