2. MATERIELS ET METHODES
2.3. Méthodologie
2.3.4. Analyses microbiologiques
2.3.4.1. Microorganismes recherchés dans les échantillons
Les flores recherchées étaient : la Flore Aérobie Mésophile Totale (FAMT), les coliformes totaux et fécaux (avec la recherche de E. coli) qui renseignent respectivement sur l’état de fraîcheur de la viande et sur les conditions de l’abattage ; les Pseudomonas qui sont des germes psychotrophes, indicateurs de l’altération des poissons et pouvant se développer sur les poissons conservés à la températures ambiantes (25 à 40°C) ainsi que les pathogènes comme les salmonelles, les staphylocoques et les Anaérobies Sulfito- Réducteurs (ASR).
UAC/NCQTA/2015 Elie LINTON 37
Les échantillons ont été analysés conformément aux normes ISO spécifiques à chaque germe recherché :
*FAMT : ISO 4833,
*Salmonelles : ISO 6579, 2002
*Stapylocoques présumés pathogènes: ISO 6888,
*ASR : ISO 7937,
*Coliformes Totaux : ISO 4831,
*Coliformes fécaux: ISO 4831,
*E.coli : ISO 7251,
*Pseudomonas : ISO 13720
2.3.4.2. Prise d’essai, préparation des dilutions et de l’inoculum
La préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique est réalisée selon la norme NF V 08 - 010. Vingt-cinq grammes de chair issue de la tête, du tronc, de la queue et des branchies des poissons ont été prélevés aseptiquement dans un sachet stérile de Stomacher puis, 225 ml d’eau peptonnée tamponnée ont été ajoutés et l’ensemble homogénéisé au Stomacher pendant 30 secondes à une minute. Par la suite, le broyat obtenu est laissé reposer pendant 45 minutes au maximum à la température ambiante afin d’obtenir la revivification des germes. Ce mélange a constitué donc la suspension mère, qui a servi à préparer des dilutions successives en progression géométrique de raison 10. En effet, les différentes dilutions ont été réalisées à partir de cette solution mère. Un millilitre de ladite solution (10-1), prélevée après homogénéisation, a été inoculé dans 9 ml de Tryptone sel stérile ou diluent (0,1%peptone + 0,85% NaCl) pour obtenir la dilution 10-2. Après homogénéisation, 1 ml de cette dilution 10-2 a été également inoculé dans 9 ml de Tryptone sel stérile afin d’obtenir la dilution 10-3. C’est ainsi qu’on est passé à la dilution 10-4 et 10-5.
UAC/NCQTA/2015 Elie LINTON 38
2.3.4.3. Recherche et dénombrement des germes
Les germes recherchés sont des germes microbiologiques indicateurs d’altération, de pollution fécale et les germes pathogènes, à savoir : la Flore Aérobie Mésophile Totale (FAMT), les coliformes fécaux, Staphylococcus aureus, les Anaérobies Sulfito-Réducteurs (ASR), Salmonella sp, les Pseudomonas et Escherichia coli.
2.3.4.3.1. Flore mésophile aérobie totale (FMAT)
Le milieu Plate Count Agar (PCA) est la gélose standard utilisée pour le dénombrement de cette flore. Aseptiquement, 1 ml de suspension de chaque tube a été transféré des dilutions 10-1 et 10-2 dans les boîtes de pétri stériles. Le milieu PCA, fondu et refroidi au bain-marie à 45°C, a été ajouté à l’inoculum à raison de 12 à 15 ml par boîte. Ensuite, le mélange a été homogénéisé par des mouvements rotatifs. Après solidification, une deuxième couche de 5 à 7 ml de PCA a été ajoutée. Cette deuxième couche résulte de la faible sélectivité du PCA et permet d’éviter l’envahissement de la boîte par des germes comme Proteus, qui rendraient la lecture difficile. Les boîtes ayant la gélose solidifiée ont été ensuite incubées, couvercles tournés vers la clayette de l’étuve à 30°C pendant 72 heures conformément à la norme ISO 4833(2003). Toutes les colonies qui ont poussé entre les deux couches ont été dénombrées à l’œil nu et la lecture faite sur 2 boîtes ensemencées avec des dilutions successives. Le nombre de germes par gramme (N) de produit a été obtenu selon la formule suivante :
N= ∑ 𝐶
𝑉(𝑛+0,1𝑛2)𝑑
N= nombre de germes par gramme de produit
ΣC= somme des colonies caractéristiques sur les deux boîtes retenues
V= volume de l’inoculum appliqué à chaque boîte (en ml)
d= taux de dilution correspondant à la première dilution retenue
n1= nombre de boîtes lues à la première dilution
n2= nombre de boîtes lues à la deuxième dilution
UAC/NCQTA/2015 Elie LINTON 39
Pour le comptage des colonies, les boîtes contenant au plus 300 colonies au niveau de deux dilutions successives ont été retenues ainsi que les boîtes qui renferment au moins 150 colonies.
2.3.4.3.2. Coliformes en milieu liquide
Une série de tubes munis d’une cloche de Durham contenant10 ml par bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVL) a été préparée à raison de trois tubes par dilution. A partir des dilutions décimales 10-3 à 10-1 ; 1 ml de ces dilutions a été porté aseptiquement dans chacun des trois tubes correspondant à une dilution donnée. L’incubation a été faite à 30°C pendant 24 à 48 heures pour les coliformes totaux et 44°C pour les coliformes fécaux conformément à la norme (ISO 4831: 2006). Pour la lecture, les tubes qui ont présenté à la fois un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche), un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune sont ceux qui ont été considérés comme positifs, puis la lecture finale a été faite selon les prescriptions de la table de Mac Grady.
2.3.4.3.3. Staphylocoques présumés pathogènes (Staphylococcus aureus)
Le dénombrement des germes a été fait avec 0,1 ml de suspension par étaleur en surface sur milieu Baird Parker additionné d’un mélange de jaune d’œuf de tellurite de potassium, après incubation à 37 °C pendant 24 à 48 heures.2.3.4.3.4. Anaérobies sulfito-réducteurs (ASR)
Ce sont les formes sporulées qui ont été recherchées. Deux milieux sélectifs peuvent être utilisés : Gélose Trypticase Sulfite Néomycine (TSN) ou gélose Trypticase Cyclosérine;
C’est le TSN qui a été utilisé dans la présente étude. L’ensemencement du milieu TSN pour la recherche des ASR a été fait en tubes. Le milieu TSN fondu au bain-marie et refroidi, a été coulé à raison de 15 ml par tubes. 1 ml de suspension mère à 10-1 et 1 ml de dilution à 10-2 sont transférés dans les tubes stériles. Après homogénéisation et solidification, une deuxième couche est coulée. Les tubes ayant la gélose solidifiée sont
UAC/NCQTA/2015 Elie LINTON 40
incubés en anaérobiose à 46°C pendant 24 heures. Seules les colonies noires caractéristiques apparaissant dans les tubes d’incubation ont été comptées.
2.3.4.3.5. Salmonelles
Les salmonelles ont été recherchées en quatre étapes successives selon la norme ISO 6579:2002. Pour le pré- enrichissement, la solution mère à 10-1 a été incubée pendant 20 heures. L’enrichissement a été fait sur le milieu d’enrichissement sélectif bouillon Rappaport-Vassiliadis (RV) à 1/10ème et incubé à 37°C pendant 24 heures. L’isolement a été fait sur le milieu sélectif Gélose Hektoen préalablement préparé et réparti. Après solidification, il a été ensemencé en stries en surface, à l’aide d’une anse de platine ou d’une pipette Pasteur à partir du milieu d’enrichissement. Les boîtes ont été incubées pendant 24 heures à 37° C. A la lecture, les colonies apparaissent bleuâtres avec ou sans centre noir.
2.3.4.3.6. Pseudomonas
Pseudomonas a été le milieu de culture utilisé pour la recherche des Pseudomonas spp, les germes ont été incubés à 37°C à l’étuve. La lecture a été faite sur des colonies bactériennes développées et conformément à la norme ISO 13720. Les colonies de Pseudomonas ont été jaunes-claires tendant vers le blanc.
2.3.4.3.7. Critères d’appréciation de bonne qualité bactériologique du poisson
Pour une bonne qualité de poisson, les critères microbiologiques ci-dessous ont été utilisés pour apprécier les résultats d’analyse obtenus par notre travail. Il s’agit de : -Absence de germes pathogènes et en particulier de Salmonella dans 25 g,
-Absence des coliformes dans 1 g,
-Absence de Clostridium sulfito-réducteurs dans 1 g,
-Flore aérobie " totale" < 25 germes/g pour la viande fraîchement obtenue et <500 germes/g pour les viandes conservées au froid.
UAC/NCQTA/2015 Elie LINTON 41