Au sein de la signalisation HH, deux différents états sont remarquables, l’état activé, et l’état basal dit SHH-off durant lequel la protéine Kinase A (PKA) dépendante de l’Adénosine Mono Phosphate cyclique (AMPc) phosphoryle les protéines Gli, entrainant leur clivage en forme transcriptionnellement répressive (Wang et al., 2000). Ainsi l’activité de la protéine PKA est essentielle à la régulation de la voie HH, particulièrement dans le maintien de l’état basal de la signalisation. Pour cette régulation, la protéine PKA a été retrouvée au sein du cil primaire (Barzi et al., 2010; Mick et al., 2015; Tuson et al., 2011). L’activité de PKA dépend du niveau d’AMPc, lui-même régulé par les protéines RCPGs. De nombreux RCPGs sont présents au niveau du cil, notamment SMO, GPR175 impliqués dans la régulation de la voie HH, mais aussi GPR161 et les recepteurs EP (recepteurs de la prostaglandine) activant l’Adénylate cyclase (AC) qui produit l’AMPc (Mukhopadhyay et al., 2013; Philipp and Caron, 2009; Riobo et al., 2006a, 2006b; Singh et al., 2015).
L’AMPc est régulé au sein du cil primaire par différents acteurs clés les adénylates cyclases. Les adénylates cyclases de types III (seules adénylates cyclases retrouvées chez les mammifères) sont au nombre de 9 AC1-AC9 (Linder, 2006). Actuellement 3 AC sont reconnus de façon globalement ubiquitaire au niveau du cil primaire, il s’agit d’AC3 AC5 et AC6 (Defer et al., 2000). La surexpression de ces AC entrainent une répression de la voie HH tandis que leur déplétion entraine une activation anormale de la voie (Bishop et al., 2007; Vuolo et al., 2015; Wang et al., 2011). Pour souligner d’autant plus l’importance de la protéine PKA comme régulateur ciliaire, les molécules d’AMPc et de Ca2+ sont des régulateurs
critiques de la taille des cils primaires (Besschetnova et al., 2010; Mukherjee et al., 2016). Enfin, une production même faible de molécules d’AMPc, entraine une augmentation significative de la concentration en AMPc au cil, suffisante pour activer la PKA au sein du cil et inhiber la voie HH (Moore et al., 2016; Zhang et al., 2012a). Ainsi l’AMPc serait un regulateur du cil primaire possiblement via HH.
II.4. Perspectives et études ciliaires
Depuis plusieurs années, le rôle du cil dans la signalisation cellulaire, et plus largement dans de nombreux processus clés au niveau de l’organisme total, a été démontré comme primodial (cf Figure 12: Evolution du nombre de publications en référence au cil primaire). Comme le démontre les nombreux projets sur le cil, en particulier le projet européen SYSCILIA, dont le but était de disséquer les fonctions ciliaires et leurs liens avec les pathologies, le cil primaire ne demeurre cependant que partiellement élucidé. Le rôle
96 | P a g e prépondérant du cil primaire dans les pathologies humaines a été confirmé par l’émergence de nouvelle maladies étiquetées « ciliopathie », ceci en partie dû au développement des techniques de séquençage d’exome. Pour cette raison, et grâce à l’évolution de nouvelles technologies, de nombreuses études ont été menées sur la biologie du cil primaire au cours des trois dernières années. Ainsi, différentes approches globales protéomiques ou de criblage par interférence ARN ont permis de définir l’ensemble des protéines exprimées au cil ou joueant un rôle clé dans la biogenèse du cil, et identifier ainsi de nouvelles voies de signalisation liées à cet organel, replaçant le cil plus que jamais au centre de l’attention dans le développement de pathologies humaines. Ces différentes études réalisées dans plusieurs modèles cellulaires et animaux comprennent des études de criblage par interférence ARN, des études par biotinylation de protéines ciliaires couplées à une approche protéomique, le tout regroupant pas moins de 7 études majeures dans différents modèles lors des 2 dernières années.
Dans un premier temps, des analyses de la ciliogenèse par immunofluorescence ou cytométrie en flux ont été réalisées après l’invalidation de l’ensemble des gènes du gènome par interférence ARN. Deux sur 3 études, ont utilisés une protéine smo-EGFP comme rapporteur sur des cellules rétiniennes humaines RPE1 et une étude a couplé des cellules rénales murines mIMCD3 et RPE1 utilisant l’α-tubuline acétylée comme marqueur du cil (Kim et al., 2016a; Roosing et al., 2015; Wheway et al., 2015). Wheway et at. en 2015 détecte 1829 gènes sur 19059 affectant la ciliogénèse, et seulement 194 de ces gènes n’affectent pas le nombre de cellules et ont été validé par un second et un troisième criblage dans des mIMCD3 et des RPE1. Roosing et al 2015 identifie 1299 gènes impliquant la ciliogénèse sur 18045 gènes dans les RPE1. Sur ces 1299 gènes, 591 gènes sont considérés comme étant de très bons candidats cilaires. Enfin, Ji Hyun Kim et al en 2016 identifient 825 gènes impliqués dans la ciliogenèse qu’ils classent en 3 sous-groupes en fonction de leur effet sur le cycle cellulaire. Ainsi 20% de ces gènes entraînent des défauts de ciliation et bloquent l’entrée et/ou le maintien des cellules en état de quiescence.
Deux autres études utilisent l’approche par biotinylation des protéines ciliaires dans des cellules mIMCD3. Le principe est de créer une protéine de fusion à partir d’une protéine ciliaire et d‘ascorbate peroxidase APEX. Sous l’influence du peroxyde d’hydrogène H202,
l’APEX catalyse la conversion de biotine-phenol en radicaux biotine-phenoxyde très instable. Ces radicaux seront capables de se lier de façon covalente aux acides aminés environnant, marquant alors toutes les protéines alentour. Une purification des protéines biotynylées par
97 | P a g e des billes de streptavidine et une approche de spectrométrie de masse permettront l’analyse et l’identification de ces protéines. Cette approche a été utilisée avec deux différents rapporteurs, NPHP3 (Mick et al., 2015) et le GPCR HTR6 (Kohli et al., 2017). Les résultats des deux études sont similaires et permettent d’obtenir un peu plus de 350 protéines retrouvées au cil. En parallèle, une cinquantaine de nouveaux gènes, notamment relatifs au cytosquelette d’actine (Actn1/Acn4/Tmp3/Tmp4/Coroc1c/Ezrine/Gelsoline) ont ainsi été identifiés.
Enfin, deux études d’analyses protéomiques couplées à des études phylogénétiques ont permis d’établir différentes listes de protéines du cil ou ciliomes en fonction de leur degrés de conservation (Roncaglia et al., 2017; Sigg et al., 2017). Cette méthode a permis de confirmer 437 gènes ciliaires hautement conservés au cours du temps soulignant leur importante fonction dans les voies de signalisation (Sigg et al., 2017). La deuxième étude a identifié 285 gènes candidats dont 24 sur 36 testés (soit 66%) ont été validés dans des cellules RPE et IMCD (Roncaglia et al., 2017). Ces gènes candidats associés aux gènes déjà validés comme ciliaires forment une base de données, CiliaCarta, de 836 gènes.
Ainsi, ces récentes études permettent une meilleure compréhension et surtout une meilleure cartographie des protéines ciliaires. Cette cartographie permet alors la priorisation de variants identifiés dans ces gènes candidats lors du séquençage haut débit de patients atteints de ciliopathies. De fait, de nouveaux gènes de ciliopathies et de nouveaux phénotypes cliniques ont été mis en évidence. C’est le cas de TALPID3 dans le JBTS ou du gène ENKUR dont les mutations, causent un situs inversus chez l’humain du fait de son rôle au cil motile (Sigg et al., 2017) (Abedin Sigg et al 2017). C’est aussi cette nouvelle cartographie qui permet de voir l’émergence de nouvelles pathologies étiquetées « ciliopathie » comme il a pu être détaillé précédemment avec l’achondroplasie (cf Les ciliopathies émergentes).
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Figure 12: Evolution du nombre de publications en référence au cil primaire
Graphique représentant le nombre de publications scientifiques en référence au cil primaire, publiées lors des 30 dernières années (1988-2018) via le moteur de recherche Pubmed.
Les études sur la composition ciliaire ont aussi permis de définir ou de confirmer de nouvelles voies de signalisation impliquant le cil primaire, telle que la voie de signalisation de l’AMPK (Mick et al., 2015). En effet, il apparait que la protéine STRADβ co-localise au cil avec la kinase LKB1, un régulateur des voies mTOR et AMPK (Boehlke et al., 2010; Mick et al., 2015; Zeqiraj et al., 2009), et est nécessaire à sa localisation ciliaire. Bien que la protéine AMPK n’ait jamais été retrouvée au niveau du cil primaire, notamment dû à son importante dynamique, elle est retrouvée au cil des cellules déplétées pour IFT27, dans lesquelle le transport des protéines ciliaire défectueux. Ces résultats ont permis de démontrer que le cil primaire est impliqué, via la voie STARDβ-LKB1-AMPK et mTOR, dans le métabolisme énergétique (Jansen et al., 2009). La découverte de nouvelle voie de signalisation, comme celle sus-citée, au niveau du cil primaire permet de mieux comprendre la physiopathologie des ciliopathies et donc d’en élargir le spectre thérapeutique.
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