Administration lentivirale de la phosphoprotéine du Bornavirus chez le rat

Les vecteurs lentiviraux ont été fournis par le Dr. Bétourné (UMR 1043, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, équipe D. Gonzalez-Dunia). Ils expriment, sous contrôle du promoteur EF1 , la protéine GFP (pour Green Fluorescent Protein), la phosphoprotéine sauvage du Bornavirus (BDV-PWT pour Borna disease virus Phosphoprotein, wild-type), ou la phosphoprotéine mutée (BDV-PAA). Cette mutation se situe sur les sérines 26 et 28 de la phosphoprotéine, qui sont les sites de phosphorylation par la PKC. La substitution de ces sérines en alanines rend cette protéine non phosphorylable par la PKC endogène (figure 14).

Figure 14. LA PHOSPHOPROTEINE DU BORNAVIRUS (BDV-P) ET SES SITES DE PHOSPHORYLATION PAR LA PKC.

Microinjection stéréotaxique. La procédure est similaire à celle précédemment décrite. La

microinjection est réalisée bilatéralement dans l’hippocampe, dans deux sites du gyrus denté (GD) et deux sites de la région CA1, selon les coordonnées suivantes :

82 Microinjections hippocampe ≈ 2 mois Locomotion basale 5 jours EPM 4 jours OF 4 jours Locomotion s s PS 3 jours CC 3 jours Perfusion et sacrifice < 1 semaine Site 1 (GD) Site 2 (CA1) Site 3 (GD) Site 4 (CA1)

AP : - 3,6 mm - 3,6 mm - 4,8 mm - 4,8 mm

L : ± 1,8 mm ± 1,8 mm ± 3,7 mm ± 3,7 mm

P : - 4,2 mm - 3,2 mm - 4,4 mm - 3,4 mm

La microinjection est réalisée à l’aide d’un injecteur en acier inoxydable (30G, Interchim, France) relié à une seringue Hamilton de 50 μL (Interchim, France), placée sur une pompe (Harvard Apparatus, Etats-Unis) par un cathéter PE10. Un volume de 0,5 μL de vecteurs solubilisés dans du tampon PBS est infusé par site à une vitesse de 0,2 μL/min. Un délai de diffusion de 2 minutes 30 est respecté entre chaque site d’injection. L’injecteur est ensuite retiré, les trous dans le crâne sont obstrués avec de la cire à os (B. Braun, France), puis la peau est recousue. A leur réveil, les animaux sont replacés dans l’animalerie dans leur cage habituelle par groupe de 4, pendant environ 2 mois avant le début de l’étude comportementale. Afin qu’ils restent habitués à l’expérimentateur, les animaux sont manipulés tous les 2 jours les 2 premières semaines post-opératoires, puis de façon dégressive jusqu’à une fois par semaine durant le dernier mois.

Protocole expérimental. Le protocole expérimental est présenté dans la figure 15. Deux

mois après les injections, les animaux sont successivement évalués dans l’actimètre pour la locomotion basale, dans le test du labyrinthe en croix surélevé, dans l’open field. Ils sont alors séparés en deux groupes, CC et PS (voir section suivante), puis leur activité locomotrice est à nouveau évaluée. Les animaux sont perfusés et sacrifiés environ une semaine après le dernier test comportemental dans le but d’une évaluation histologique future du site d’injection (non réalisée à ce jour).

Figure 15. PROTOCOLE EXPERIMENTAL DES EXPERIENCES REALISEES APRES INJECTION

LENTIVIRALE DE LA PHOSPHOPROTEINE DU BORNAVIRUS (PWT) OU DES MOLECULES CONTROLES

(GFP,PAA).

Abréviations : EPM, elevated plus-maze (labyrinthe en croix surélevé) ; OF, open field ; CC, contrôle cage ; PS, privation de sommeil.

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III- Privation de sommeil

Principe et procédure. La privation de sommeil paradoxal est réalisée grâce à la

technique dite du « pot de fleurs renversé » (figure 16, Jouvet et al., 1964). Les rats sont placés (vers 14h30) dans un baril en Plexiglas transparent (hauteur, diamètre : 30 x 30 cm), sur une plateforme (hauteur, diamètre : 8,6 x 6,6 cm) entourée de 2 cm d'eau chaude (initialement à 33°C ± 1) pendant 72h.

Dans un tel dispositif, la perte du tonus musculaire qui survient en début de sommeil paradoxal provoque la chute de l’animal dans l’eau en raison de la taille réduite de la plateforme, ce qui l’empêche d’entrer en sommeil paradoxal (Mendelson et al., 1974).

Les barils sont placés dans une pièce maintenue sous des conditions standards identiques à la pièce d’hébergement (eau et nourriture ad libitum, température à 22°C, cycle jour/nuit 12/12h). Les barils sont nettoyés tous les jours. Durant cette période de nettoyage, les rats sont placés dans une cage sèche pendant 10 min où ils restent éveillés (comportement de toilettage et d'exploration).

Des animaux témoins sont placés dans des barils identiques à ceux utilisés pour les rats privés de sommeil (PS), mais sur un lit de copeaux de bois (« contrôles isolés », CI), ou sont hébergés par 4 dans leur cage d’origine (« contrôles cage », CC) pendant toute la durée de l’expérience.

Figure 16. DISPOSITIF DU « POT DE FLEURS

RENVERSE » UTILISE POUR REALISER UNE PRIVATION

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J1 J2 J3 J4

privation de sommeil 72h

14h30 14h30

Injections thioTEPA(1 ou 5 mg/kg i.p.)

Evaluation comportementale

Evaluation de la prolifération cellulaire Protocoles expérimentaux.

Pour les expériences destinées à déterminer les effets d’une privation de sommeil sur les comportements liés à l’humeur, les animaux sont testés immédiatement après la fin des 72h de privation de sommeil dans les différents tests décrits dans la partie IV.

Pour les expériences réalisées dans le but d’étudier l’effet de la privation de sommeil sur la neuroplasticité, les rats sont anesthésiés à la fin des 72h, puis nous avons suivi les protocoles décrits dans les parties V et VI pour évaluer la prolifération cellulaire ou la LTP.

Pour les expériences dans lesquelles l’activité de la PKC est examinée par western blot (partie VII), les rats sont sacrifiés à la fin des 72h de privation de sommeil.

Dans une autre expérience, les glandes surrénales des rats CC et PS sont prélevées à la fin des 72h de privation de sommeil, puis pesées. Les données sont exprimées en poids relatif des glandes surrénales par rapport au poids du rat.

Enfin, pour les expériences visant à appréhender l’importance de l’intégrité de la prolifération cellulaire dans l’effet antimaniaque potentiel des inhibiteurs de la PKC, une solution de ThioTEPA (1 ou 5 mg/kg/jour i.p., 2 mL/kg) est administrée quotidiennement aux rats CC et PS pendant quatre jours, selon le protocole schématisé dans la figure 17. Le thioTEPA est un agent alkylant de l’ADN utilisé pour le traitement de certains cancers (Maanen et al., 2000), qui est capable d’inhiber très fortement la prolifération cellulaire dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris (Mignone et Weber, 2006).

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IV- Evaluation comportementale

Les expériences comportementales qui suivent une privation de sommeil et celles effectuées avec des animaux exprimant la phosphoprotéine du Bornavirus sont réalisées vers 14h30. Les expériences effectuées chez les rats naïfs sont réalisées entre 8h et 12h.