a) Les gènes Hox des groupes paralogues 1 et 2

  III.5 Gènes de segmentation et autres acteurs majeurs participant à la mise  en place des rhombomères   

La  morphogénèse  du  rhombencéphale  est  amorcée  par  l’établissement  des  gradients  de  facteurs  décrits  précédemment.  Ces  voies  de  signalisation  contrôlent  un  ensemble de FTs dont l’action concertée avec les molécules diffusibles aboutit au final à  la  mise  en  place  des  deux  systèmes  moléculaires  que  sont  le  code  Hox,  spécifiant  l’identité AP des segments, et les Eph‐ephrines, responsables de la ségrégation cellulaire.  

Ces FTs organisent la segmentation du rhombencéphale en affinant l’information  contenue dans les gradients et sont le plus souvent nécessaires à la formation d’un ou  plusieurs  rhombomères.  Ils  sont  définis  pour  cette  raison  comme  des  gènes  de  segmentation, bien que cela ne leur exclue pas un rôle dans la spécification de l’identité  AP des segments. D’autres facteurs n’étant pas formellement des gènes de segmentation  mais participant de façon centrale au processus de segmentation sont également décrits  dans ce chapitre.    III.5.a) Les gènes Hox des groupes paralogues 1 et 2 

Nous  avons  déjà  détaillé  le  rôle  des  gènes  Hox  dans  la  spécification  AP  des  rhombomères. Les Hox des groupes 1 et 2 sont également impliqués précocement dans  la  mise  en  place  des  segments  du  rhombencéphale  comme  en  témoignent  les  double  mutants Hoxa1‐Hoxb1 et Hoxa2‐Hoxb2 chez la souris ou le triple mutant Hoxa1‐hoxb1‐ Hoxd1 chez le xénope, chez lesquels plusieurs segments sont perdus ou réduits.   Les gènes Hox PG1 sont les premiers à être exprimés dans le rhombencéphale et  leurs domaines d’expression s’établissent autour de 7,5‐8 jpc chez la souris, soit un jour  avant la formation morphologique des rhombomères, et s’étendent jusqu’à une frontière  antérieure située entre les futurs r3 et r4. L’expression de Hoxb1 est ensuite maintenue 

  dans r4 par une boucle d’autorégulation (Pöpperl et al., 1995) tandis que celle de Hoxa1  s’éteint (Murphy and Hill, 1991). Hoxd1 n’a pas été détecté dans le rhombencéphale des  mammifères jusqu’à ce jour. En revanche, chez le xénope, Hoxd1 est exprimé de façon  très transitoire dans des territoires chevauchant les domaines Hoxb1 et Hoxa1 (Kolm &  Sive, 1995; McNulty & al., 2005). Chez le poisson‐zèbre, il n’y a pas de gène Hoxd1 et les  profils d’expression et différents travaux de gains et de pertes de fonction suggèrent que  les  gènes  ichthyens  hoxb1b  et  hoxb1a  sont  les  équivalents  fonctionnels  respectifs  de 

Hoxa1 et Hoxb1 murins (Jozefowicz et al., 2003).  

Les phénotypes associés aux pertes de fonction des gènes Hox PG1 démontrent  un  rôle  excédant  la  seule  spécification  d’identité  AP  (figure  30),  en  particulier  pour 

Hoxa1.  En  effet,  les  mutants  murins  Hoxa1  possèdent  un  rhombomère  4  réduit  et  un 

rhombomère 5 absent ou sévèrement diminué suivant les études (Chisaka et al., 1992;  Carpenter  et  al.,  1993;  Mark  et  al.,  1993).  Dans  ces  mutants,  la  frontière  antérieure  d’expression de Hoxb1 est également plus caudale et le territoire d’expression de Krox20  dans r3 est plus grand (Rossel and Capecchi, 1999).  Les gains ou pertes de fonction pour Hoxb1 sont associés à des transformations  homéotiques plus classiques pour des gènes Hox : dans le mutant Hoxb1 les marqueurs  spécifiques de r4 sont perdus au profit de l’expression de marqueurs de r2 (Goddard et  al., 1996; Studer et al., 1996); tandis que le phénotype inverse est observé dans le cas  d’une expression ectopique de Hoxb1 ciblée à r2 (Bell et al., 1999). De façon cohérente  avec  le  rôle  régulateur  de  Hoxa1  sur  Hoxb1,  la  surexpression  de  Hoxa1  chez  la  souris  induit l’expression ectopique de Hoxb1 dans r2 et l’acquisition d’une identité de type r4  par les populations neuronales de ce rhombomère (Zhang et al., 1994).  

Hoxb1 est probablement aussi impliqué dans le processus de mise en place des 

territoires  car  la  double  mutation  Hoxa1‐Hoxb1  produit  un  phénotype  de  défaut  de  segmentation  plus  important  que  le  simple  mutant  Hoxa1 :  les  rhombomères  4  et  5  disparaissent complètement, l’expression de MafB dans r6 est diminuée tandis que celle  de Krox20 dans r3 est à la fois plus faible et plus étendue, occupant un territoire grand  comme  deux  rhombomères  avant  qu’un  important  processus  d’apoptose  ne  réduise  celui‐ci à la taille d’un seul rhombomère et ne produise un rhombencéphale globalement  plus petit (Studer et al., 1998; Rossel and Capecchi, 1999). Les mutants Hoxa1 possédant  un seul allèle Hoxb1 fonctionnel montrent un phénotype intermédiaire.   

Figure 30. Conséquences de la perte de fonction des gènes Hox PG1 sur la segmentation du

rhombencéphale

a: Représentation schématique de l’expression génétique et de l’organisation du rhombencéphale (r2 à r6)

dans des embryons murins à 8-8,5 jpc sauvage ou mutants. L’ellipse au niveau de r5 symbolise la vésicule otique.

fol: follistatine; a2: Hoxa2; b2: Hoxb2; K-20: Krox20; kr: MafB. D’après Rossel and Capecchi, 1999.

b: Représentation schématique de la segmentation du rhombencéphale chez différents modèles de

vertébrés au sein desquels la fonction des gènes Hox PG1 est altérée. Le triple knock-down chez le xénope de Hoxa1/Hoxb1/Hoxd1 et l’inactivation de tous les cofacteurs Pbx des protéines Hox conduisent à une perte complète des gènes à expression segmentée dans les rhombomères 2 à 6.

MO : morpholinos; r : rhombomères. D’après McNulty et al., 2005.

sauvage  sauvage  Souris  Hoxa1‐/‐  Souris  Hoxa1‐/‐;Hoxb1‐/‐  Poisson‐zèbre   MO Hoxb1a/hoxb1b  Souris  Hoxa1‐/‐;  Hoxb1‐/‐  Xénope  MO  Hoxa1/Hoxb1;Hoxd1  Poisson‐zèbre  Pbx4‐/‐ + MO Pbx2 

a 

b 

Chez le poisson‐zèbre, les expérience de gains de fonction de hoxb1b (équivalent 

Hoxa1) et hoxb1a (équivalent Hoxb1) provoquent la transformation caudalisante de r2 

en  r4,  similairement  à  ce  qui  est  observé  chez  la  souris  (McClintock  et  al.,  2001).  De  même, l’organisation neuronale du rhombomère 4 mime celle de r2 chez des poissons  injectés  avec  un  morpholino  contre  hoxb1a  (McClintock  et  al.,  2002).  La  perte  de  fonction hoxb1b produit un phénotype semblable au mutant murin Hoxb1a mais moins  dramatique : r5 n’est pas perdu, en revanche les territoires r4‐r6 sont réduits et r3 est  étendu  caudalement  (McClintock  et  al.,  2002).  Le  double  K.O.  hoxb1b‐hoxb1a  par  injection  de  morpholinos  accentue  ce  phénotype  mais  est  également  moins  prononcé  que le double mutant murin Hoxa1‐Hoxb1 (figure 30, McClintock et al., 2002). De façon  intéressante,  les  gènes  Hox  PG1  pourraient  être  à  l’origine  du  signal  FGF  dans  r4  (Waskiewicz et al., 2002b). En effet, la surexpression ectopique de hoxb1a par injection  d’ARN  sur  des  embryons  à  1  cellule  entraine  l’expansion  rostrale  et  caudale  de  l’expression  de  fgf3,  normalement  restreint  à  r4.  Cette  expression  est  au  contraire  réduite  dans  les  embryons  injectés  avec  des  morpholino  dirigés  contre  hoxb1a  et 

hoxb1b. 

Enfin, chez le xénope, l’inactivation, par injection de morpholinos, de chacun des  trois gènes du groupe PG1 exprimés dans le rhombencéphale n’aboutit qu’à de faibles  perturbations de la segmentation, touchant essentiellement r4 (McNulty et al., 2005). La  combinaison  de  deux  pertes  de  fonction  accentue  le  phénotype  mais  l’expression  de 

Krox20 dans r3 et r5 est maintenue. En revanche, l’inactivation des trois gènes Hoxa1­ Hoxb1‐Hoxd1  entraine  une  absence  complète  de  segmentation  et  une  perte  des 

marqueurs  propres  aux  régions  r2‐r7,  incluant  les  gènes  Hox  PG2  à  4  et  Krox20,  ainsi  qu’une  extension  postérieure  du  domaine  d’expression  de  Gbx2,  indiquant  que  le  rhombencéphale  acquiert  une  seule  identité  de  type  r1  (McNulty  et  al.,  2005).  Le  phénotype plus grave du triple mutant chez le xénope, en regard du double mutant chez  la souris ou le poisson, n’est pas expliqué à ce jour et suggère que Hoxd1 s’exprime peut‐ être  dans  le  rhombencéphale  murin  et  ichthyen  de  façon  faible  et  transitoire,  comme  chez  le  xénope,  et  que  cette  expression  n’a  pas  été  détectée.  Il  est  également  possible  qu’un autre Hox chez la souris et le poisson joue le rôle de Hoxd1 chez le xénope.  

L’AR est le principal régulateur précoce caractérisé des gènes Hox PG1 et agit par  l’intermédiaire de deux sites RAREs situés en aval des gènes Hoxa1 et Hoxb1 (Marshall  et al., 1994; Frasch et al., 1995; Langston and Gudas, 1992). Leur mutation conduit à des 

phénotypes  assez  similaires  aux  mutants  simples  Hoxa1  et  Hoxb1  (Dupé  et  al.,  1997;  Gavalas  et  al.,  1998;  Studer  et  al.,  1998).  En  plus  de  la  boucle  d’autorégulation,  l’expression de Hoxb1 est également contrôlée par Hoxa1 en synergie avec des facteurs  Oct  et  Sox  (Di  Rocco  et  al.,  2001),  les  régulations  croisées  ou  autologues  étant  fréquemment rencontrées chez les gènes Hox. 

  Les gènes Hox PG2 sont exprimés après ceux du groupe 1, à partir de 8‐8,5 jpc. 

Hoxa2 est le gène Hox dont le profil d’expression est le plus antérieur puisqu’il s’étend 

jusqu’à  la  frontière  r1/r2  et  est  le  seul  gène  Hox  exprimé  dans  le  rhombomère  2  (Krumlauf, 1993; Prince and Lumsden, 1994). Hoxb2 est exprimé postérieurement à la  limite r3/r4 et de façon plus intense dans r3‐r5 (Krumlauf, 1993). Ces expressions sont  conservées chez la souris, le poulet, le xénope et le poisson de r2 à r5 (Pasqualetti et al.,  2000;  Hunter  and  Prince,  2002).  Postérieurement,  Hoxa2  et  Hoxb2  sont  exprimés  faiblement chez la souris, le poulet et le xénope mais pas chez le poisson.  

  Le phénotype du mutant murin Hoxa2 suggère une implication de ce dernier dans  le  processus  de  mise  en  place  des  territoires.  La  frontière  r1/r2  est  absente  et  les  territoires  r2  et  r3  sont  réduits  au  profit  de  r1,  ce  qui  entraine  un  élargissement  du  cervelet et un rétrécissement du pons (Gavalas et al., 1997; Davenne et al., 1999; Barrow  et  al.,  2000).  Des  défauts  de  spécification  AP  sont  également  observés  avec  le  remplacement des structures du second arc branchial (colonisé par les cellules de la CN  issues de r4) par la duplication en miroir des structures du premier arc (normalement  colonisé par les cellules de la CN de r2), ce qui suggère une altération de l’identité de r4  (Gendron‐Maguire et al., 1993; Rijli et al., 1993). L’expression ectopique antérieure de  Hoxa2 chez le poulet ou le xénope conduit à l’inverse au remplacement du premier arc  branchial par des structures du second arc (Grammatopoulos et al., 2000; Pasqualetti et  al., 2000).     Le mutant murin Hoxb2 ne montre pas de défaut de segmentation (Barrow and  Capecchi,  1996;  Davenne  et  al.,  1999).  Toutefois,  l’expression  de  Hoxb1  dans  r4  y  est  abolie  (observé  seulement  dans  l’étude  de  Barrow  et  Capecchi)  et  les  neurones  somatiques du nerf facial VII (en regard de r4) ne se forment pas, ce qui est associé à  une paralysie faciale observée également chez le mutant Hoxb1. Dans le double mutant 

Hoxa2‐Hoxb2, les frontières inter‐rhombomériques entre r1 et r4 sont absentes, ce qui 

réduction  du  territoire  r2/r3  au  profit  de  r1  est  accentuée.  L’expression  des  gènes 

Krox20 ou Epha4 dans r3 est cependant toujours segmentée (Davenne et al., 1999).    Malgré la conservation d’expression, les pertes de fonction de Hoxa2a et Hoxb2a  chez le poisson‐zèbre ne sont pas associées à des défauts de segmentation. La perte de  fonction d’un seul gène ne produit aucun phénotype (Hunter and Prince, 2002) tandis  que la combinaison du K.O. des deux gènes est associée à des phénotypes seulement liés  à la spécification AP.  

  L’expression  de  Hoxa2  et  Hoxb2  est  contrôlée  directement  par  Hoxb1  dans  r4  (Maconochie et al., 1997; Jacobs et al., 1999; Ferretti et al., 2000b; Tümpel et al., 2007)


et par Krox20 dans r3 et r5 (Sham et al., 1993; Nonchev et al., 1996; Vesque et al., 1996;  Maconochie  et  al.,  2001)  ainsi  que  par  des  boucles  d’auto‐  et  d’inter‐régulation.  L’expression de Hoxa2 dans r2 est contrôlée par un enhancer spécifique localisé dans le  second exon du gène (Frasch et al., 1995; Tümpel et al., 2008) dont l’activité requiert la  présence de deux sites de fixation aux protéines Sox.