I. Mécanismes de régulation de la transcription
I.5. e) Les insulateurs séparent les territoires chromatiniens et confinent l’action des enhancers
La capacité des enhancers à agir sur de très longues distances leur confère une grande flexibilité, leur permettant d’activer des gènes non adjacents situés très loin sur le génome. Toutefois, cette propriété qui est au cœur du fonctionnement des enhancers soulève aussi un problème potentiel : comment l’activité des enhancers est‐elle restreinte aux seuls gènes cibles ?
Un premier niveau de restriction se trouve dans la reconnaissance spécifique enhancer‐promoteur qui va dépendre des sites de fixation aux FTs se trouvant sur l’enhancer et des séquences au niveau du promoteur, en particulier la boite TATA, l’INR et le DPE (Smale and Kadonaga, 2003). L’association des gènes co‐régulés au sein de clusters apporte également, bien qu’indirectement, de la spécificité en rapprochant les gènes co‐régulés et les séquences régulatrices contrôlant leur expression.
Il semble cependant que le principal moyen de confinement de l’action des enhancers soit l’utilisation de séquences cis‐régulatrices spécialisées dites « insulatrices ». Les insulateurs vont agir soit en régulant les interactions entre un enhancer et son promoteur soit en bloquant la propagation de l’hétérochromatine.
Les insulateurs qui perturbent la communication entre un enhancer et son promoteur lorsqu’ils sont placés entre les deux sont appelés « enhancer‐blockers ». L’archétype de l’enhancer‐blocker chez les mammifères est l’insulateur situé entre les gènes IGF2 et H19, ces deux gènes étant soumis à l’empreinte parentale. Sur le chromosome paternel, seul le gène IGF2 est transcrit grâce à l’interaction avec des enhancers situés en aval de H19 (voir figure 7a). Sur le chromosome maternel, cette interaction est empêchée par la séquestration du promoteur du gène IGF2 par l’insulateur ICR (« Imprinting Control Region »), situé en amont de H19, grâce à la formation d’une boucle d’ADN. Le gène IGF2 est alors transcriptionnellement inactif tandis que H19 est exprimé (Kurukuti et al., 2006). La fixation de la protéine CTCF (« CCCTC‐binding Factor ») sur l’ICR est nécessaire à la formation de cette boucle.
Le facteur CTCF est également nécessaire à l’activité de la plupart des enhancer‐ blockers caractérisés à ce jour dont la majorité contient un ou plusieurs sites de fixation pour ce facteur. C’est un FT ubiquitaire comprenant un large domaine de fixation à l’ADN composé de 11 doigts à zinc. Une analyse systématique des éléments non codants conservés chez les mammifères a montré que 15 000 d’entre eux possédaient des sites
a
b
c
e
d
Figure 7. Modes d’action des insulateurs
a: activité de l’enhancer-blocker ICR au niveau du locus IGF2-H19 soumis à l’empreinte parentale. Sur le
chromosome maternel, CTCF se lie à l’ICR et interagit avec le promoteur d’IGF2, bloquant son activation par les enhancers situés en aval qui peuvent alors activer la transcription de H19. Sur le chromosome paternel, les sites de fixation à CTCF sont méthylés et CTCF ne peut pas se lier à l’ICR. Les enhancers peuvent activer
IGF2 tandis qu’un répresseur va se fixer sur le promoteur de H19. D’après Raab et Kamakaka, 2010.
b-d: Modes d’action des enhancers-blockers. Une paire d’insulateurs (I) peut interagir et placer l’enhancer
(E) au sein de la même boucle que le promoteur P2 tout en l’isolant du promoteur P1 (b). Un enhancer-blocker peut aussi séquestrer directement un enhancer (c) ou un promoteur (d) et inhiber son interaction avec son promoteur ou son enhancer respectif.
D’après Raab et Kamakaka, 2010.
e: séparation d’un domaine réprimé (marques d’histone répressives et gènes transcriptionnellement éteints
en rouge) et d’un domaine actif (marques d’activation et gènes exprimés en vert) par la formation d’une boucle d’ADN suite à l’interaction entre deux insulateurs barrières à CTCF. Les domaines actifs peuvent également être confinés au sein d’une boucle. D’après Yang et Corces, 2012.
de fixation au facteur CTCF (Xie et al., 2007), dont une grande partie sont situés aux extrémités de clusters de gènes co‐régulés ou de domaines actifs de chromatine, ce qui suggère que ces éléments sont des enhancers‐blockers et ce qui confirme le rôle généralisé de CTCF dans ce mécanisme d’insulation. De façon semblable à p300 constituant une marque prédictive des enhancers actifs, les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine suggèrent que CTCF caractérise de façon fiable les séquences insulatrices et puisse être utilisé pour identifier celles‐ci (Barski et al., 2007; Cuddapah et al., 2009; Wang et al., 2012). Les sites de fixation au CTCF co‐ localisent souvent avec la cohésine et celle‐ci semble être un cofacteur nécessaire à l’activité de CTCF (Wendt et al., 2008), vraisemblablement en promouvant la formation de boucles d’ADN.
En effet, en plus de la séquestration de promoteur ou d’enhancer, les enhancer‐ blockers peuvent aussi confiner la transcription en interagissant entre eux pour former des boucles d’ADN qui définiraient des domaines chromosomiques : les enhancers situés dans une boucle ne pourraient pas interagir avec les promoteurs d’une autre boucle (Maeda and Karch, 2007, figure 7b‐d). De façon intéressante et similaire à ce que nous avons vu pour la répression dans les corps Polycomb et l’activité transcriptionnelle au sein des usines à transcription, ce regroupement des insulateurs en clusters structure encore un peu plus le noyau en faisant apparaître des « corps d’insulateurs » (Pai et al., 2004; Yang and Corces, 2011).
La formation de boucles permet également aux insulateurs d’agir selon un second type de mécanisme : en opposant une barrière à la propagation de l’hétérochromatine. On parle alors d’enhancers « barrières ». Ici encore, l’implication du facteur CTCF est la mieux caractérisée et des sites CTCF sont souvent trouvés à la frontière entre des domaines de chromatine possédant des marques d’activation d’un côté et de répression de l’autre (Cuddapah et al., 2009). L’importance fonctionnelle de la démarcation de domaines chromatiniens par les insulateurs liés au CTCF est illustrée par l’expression des gènes du cluster HOXA dans les fibroblastes de poumon humain en culture (Kim et al., 2011). Dans ces cellules, les gènes HOXA913 sont éteints tandis que les autres gènes du cluster sont transcrits. Conformément à cette répartition des états de transcription, les gènes HOAX913 sont enrichis en modifications d’histones répressives H3K27me3 tandis que les gènes HOXA17 possèdent des marques d’activation comme H3K4me3. Cette distribution des marques dépend de l’interaction entre deux insulateurs à CTCF
situés de part et d’autre de HOXA913. L’inactivation du facteur CTCF inhibe la formation de la boucle d’ADN entre ces deux insulateurs et entraine la propagation des marques répressives ainsi que l’extinction des gènes HOXA6 et 7. Les enhancers barrières inhibent la propagation de l’hétérochromatine en recrutant des enzymes de remodelage de la chromatine ainsi que des enzymes de modification des histones de type HAT ou H3K4 HMTs (Huang et al., 2007).
Enfin, les insulateurs sont également impliqués dans des processus non liés à la transcription tels que la recombinaison V(D)J au niveau du locus IGH (revu ici : Yang and Corces, 2012). Là encore, le facteur CTCF est impliqué. Au vu du rôle hautement multi‐ fonctionnel joué par CTCF dans les mécanismes de confinement transcriptionnel ou autres (20% des sites CTCF sont par exemple localisés au niveau des promoteurs), des facteurs additionnels sont nécessaires pour spécifier les différents mécanismes d’action de CTCF, ce que font par exemple les facteurs USF1 et VEZF1 au niveau de l’insulateur barrière HS4 flanquant le cluster de gènes de globine β (Barkess and West, 2012). I.5.f) Les ARNs non codants peuvent jouer le rôle de séquences cis‐régulatrices ou