Apport du dichroisme circulaire a la connaissance des modifications structurales de l hémoglobine en solution au cours de la fixation de l oxygène

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Apport du dichroisme circulaire a la connaissance des modifications structurales de l’hémoglobine en solution

au cours de la fixation de l’oxygène

G. Melki

To cite this version:

G. Melki. Apport du dichroisme circulaire a la connaissance des modifications structurales de

l’hémoglobine en solution au cours de la fixation de l’oxygène. Journal de Physique, 1972, 33 (1),

pp.37-47. �10.1051/jphys:0197200330103700�. �jpa-00207225�

APPORT DU DICHROISME CIRCULAIRE A LA CONNAISSANCE DES MODI-

FICATIONS STRUCTURALES DE L’HÉMOGLOBINE EN SOLUTION AU COURS

DE LA FIXATION DE L’OXYGÈNE

G. MELKI

Service de

Cardiologie, Hôpital ^Émile Roux,

^{94 2014} Limeil-Brevannes

(Reçu

^{le 6 novembre}

1970,

^{révisé 12}

juin 1971)

Résumé. ²⁰¹⁴ L’intensité et la position des bandes de dichroïsme circulaire de la molécule d’hémo-

globine ^{sont étudiées} pour la forme oxyhémoglobine ^{et la forme} désoxyhémoglobine. ^{Elles sont}

aussi comparées ^avec celles de chaînes 03B1 et 03B2 oxygénées ^et désoxygénées.

Une étude analytique des résultats obtenus est ensuite entreprise ^{en vue} d’apprécier ^la part ^due

au couplage ^entre les différentes transitions électroniques ^sur les modifications des bandes spectrales

observées en dichroïsme circulaire lors du _passage de l’oxy- ^{à la} désoxyhémoglobine. L’importance

de ce couplage, déjà souligné par différents auteurs, ^{nous a} amené à comparer ^non plus l’ellip- ticité des bandes mais leurs forces rotatoires respectives. ^{Ceci nous a} permis ^de souligner ^combien

toute

interprétation

structurale ^se fondant sur une variation d’intensité d’une seule et même bande

dichroïque doit être avancée avec beaucoup ^de

prudence

^{et en tous cas} après ^{avoir tenu} compte des modifications d’intensité des autres bandes spectrales.

De cette étude comparative ^et analytique ^nous pouvons conclure que certaines des variations du spectre de dichroïsme circulaire de l’hémoglobine ^{au cours de la fixation} d’oxygène, ^notamment celles de bandes ultraviolettes bien déterminées, ^{sont très} certainement dues à des modifications de la structure tertiaire de la protéine induites par la fixation du ligand.

Abstract. ²⁰¹⁴ Intensities and positions of circular dichroism bands of haemoglobin ^{molecule are} studied for the oxyhaemoglobin form and the desoxyhaemoglobin ^form. They are ^also compared

with those of the oxygenated ^and desoxygenated ^03B1 and 03B2 ^chains.

Then an analytical study ^{of the} experimental results is undertaken in order to appreciate ^the

part

of the coupling between the different electronic transitions, ^{to the} modifications of

spectral

^bands

observed in circular dichroism during conversion of oxy- ^to deoxy-haemoglobin. The importance ^of

this coupling, already pointed ^out by ^different authors, ^{have incited us} to compare, ^not only ^the ellipticities ^{of the} bands, ^but also their respective rotational strengths. ^That permit ^{us to underline} how a structural interpretation, ^{founded on} intensity variations of only ^{one dichroic}

band,

^{must be}

proposed

^{with a} great caution ^and always ^after taking ^{into account the} intensity modifications of the other spectral ^bands.

By ^this comparative ^and

analytical

study, ^{we can conclude that some} variations of the dichroic spectrum of haemoglobin occuring during ^{the fixation} of oxygen, notably those of the well determi- ned ultraviolet bands, ^are certainly ^{due to} modifications of the tertiary ^structure of the protein,

induced by the fixation of ligand.

Classification Physics Abstracts ;

22.10

Introduction. ^- Les modifications conformation- nelles de la molécule

d’hémoglobine

^induites par

l’oxygénation

^{ont été} bien démontrées _par cristallo-

graphie

^{aux rayons X}

(Perutz) [1]

^{ainsi que} par d’autres

procédés [2].

^Ces modifications conformationnelles sont à

l’origine

^du

phénomène

^de

coopération

^inter-

héminique

^{bien connu de}

l’hémoglobine

^et

expliquant

les caractères de la

cinétique

^de réaction de l’hémo-

globine

^avec

l’oxygène ;

^se

produisant

essentiellement

en

solution,

^{elles sont} difficiles à suivre _{par les}

procédés cristallographiques

^et

peuvent

^être

plus

^aisément

étudiées

grâce

^aux méthodes faisant

appel

^{à la}

pola-

risation rotatoire. Dans le cas de

l’hémoglobine,

^on

distingue

^trois

grands

types ^d’effets Cotton. Les effets Cotton dits

« intrinsèques » [3] qui

^{ont lieu en ultra-}

violet lointain ^entre 250 ^et 180 _{nm ;} dus au chromo-

phore peptidique,

^ils

permettent

^{de mesurer le taux}

d’alpha

^hélice

[4], [5].

^Les effets Cotton dits « latéraux » peuvent s’observer entre 350 et 250 _nm, ils sont dus

aux acides aminés

aromatiques

^{ou soufrés. Enfin,}

les effets Cotton dits

« extrinsèques » [8]

^{sont dus à}

l’hème et peuvent ^{servir à} caractériser

l’asymétrie

de

configuration

^{de l’hème avec} la chaîne

polypep- tidique

avoisinante.

Plusieurs travaux ont

déjà

^été

entrepris

^en

disper-

sion

optique

^{rotatoire et en} dichroïsme circulaire en vue d’obtenir des

renseignements

^sur la fixation

d’oxygène

par la molécule

d’hémoglobine.

^{Dans le}

proche

^U.

V., Beychok [9]

^a initialement

publié

^les spectres ^de dichroïsme circulaire des formes

oxygénées

et

désoxygénées

^et aussi des chaînes

isolées ;

^cette

étude est fondamentale car elle fut la

première

^à apporter ^des

renseignements

intéressants en mon-

trant

l’importance

de la contribution des transitions-

Article published online by EDP Sciences and available at http://dx.doi.org/10.1051/jphys:0197200330103700

héminiques

^{dans cette}

région spectrale (bande

^à

260

nm)

^et

également

^des interactions des chaînes.

Une série de travaux a suivi dans le même

domaine ;

Li et Johnson

[10]

^ont étudié l’activité

optique

^des

bandes

héminiques

^de

l’oxy-,

^{de la}

désoxyhémoglobine

ainsi que différents dérivés de

l’hémoglobine

^{liés à}

plusieurs ligands

^{et ont recherché une} corrélation entre

l’amplitude

des bandes ^et les moments

magnétiques

^des molécules. Ueda et coll.

[11] ont pré-

senté aussi les spectres ^{de D. C. de}

l’Hb, Hb02

^et

HbCO ^et des chaînes en détaillant surtout la

région

visible et la

région

^du

proche

^{U. V.}

Sugita

^{et coll.}

[12]

ont

publié

^les spectres ^de

l’oxy-

^{et de la}

désoxyhémo- globine

^{humaine et de}

lamproie

^{dans la}

région

^de

Soret,

^{dans le}

proche

^{U. V. et dans le lointain U. V.}

En marge de ^ces

problèmes

^{de fixation}

d’oxygène,

Strauss et coll.

[13]

^ont

enregistré respectivement

^les

spectres de D. 0. R. et de D. C. de

l’oxyhémoglobine

et ont recalculé le spectre de D. 0. R.

théorique

^en

fonction du spectre de D. C.

expérimental

^{et vice}

versa.

Tous ces travaux viennent

compléter

^{une série de}

résultats observés ^en

dispersion optique

^rotatoire

[14], [15]

^et apportent ^un

complément

d’information _par la finesse et la

complexité

^moins

grande

^des spectres de dichroïsme circulaire que vient ^encore améliorer le

perfectionnement

^des modèles commerciaux de

dichrographes.

Cependant

^{aucun travail à notre} connaissance ne

présente

^le spectre ^de dichroïsme circulaire de la

désoxy-

et de

l’oxyhémoglobine

^le

long

de la gamme

spectrale

allant de 615 à 180 _nm, gamme autorisée _{par les}

appareils

^actuels.

Or,

^{seules les mesures des}

paramètres

des bandes

dichroïques

^du spectre ^{des deux variétés}

d’hémoglobine,

^{sur un}

large

intervalle

spectral,

^sont

susceptibles

^de permettre ^une

interprétation

^structu-

rale valable. En

effet,

^la discussion d’une variation

d’amplitude

d’une même bande

dichroïque,

^{pour être}

interprétée

^{en termes de structure ou de}

conformation,

nécessite la

comparaison

^{de cette variation avec}

celles des autres bandes

spectrales

^{mesurées de la}

même manière c’est-à-dire ^sur le même échantillon dosé

préalablement,

^{avec le même}

appareil,

^avec

la même verrerie et par le même

expérimentateur.

Un tel

procédé

^est

important

actuellement d’autant

qu’on

^{connaît mieux la}

signification

des bandes

dichroïques

^de

l’hémoglobine.

En outre, ^{il est}

difficile,

^{en se référant aux travaux}

antérieurs

cités,

^de comparer les

ellipticités

^{de deux}

bandes

dichroïques

^{situées dans des domaines spec-}

traux différents. En effet les valeurs des

ellipticités

sont rarement concordantes car d’une

part

^{elles sont}

exprimées

^{bien souvent en} unités différentes ^d’un auteur à l’autre sans

qu’il

^soit

possible

^{d’en faire}

l’interconversion,

^d’autre

part

^on observe de notables fluctuations sur les valeurs

d’ellipticités

^{d’un travail}

à

l’autre, peut-être

^en rapport

également

^{avec un}

choix différent des coefficients d’extinction de l’hémo-

.globine

^{trouvés dans les tables et}

responsable

^d’une

certaine erreur sur la valeur de la concentration des échantillons.

C’est ce

qui

^{nous a amené à}

pratiquer

^{une série}

de spectres ^en dichroïsme circulaire de

l’hémoglobine

entière et des chaînes oc

et fl

^isolées

oxygénées

^et

désoxy- génées

^le

long

^{de la} gamme

spectrale

^{600-185 nm.}

Le dichroïsme circulaire a

l’avantage

^{sur la}

dispersion optique

^{rotatoire de donner} des effets Cotton ne

pré-

sentant

qu’un

^{seul extremum}

positif

^ou

négatif

^ainsi

que des bandes

beaucoup

mieux résolues

[16].

Pour effectuer la

comparaison

des variations des bandes

dichroïques

d’une forme

d’hémoglobine

^à

l’autre nous avons

comparé

différentes

grandeurs

caractérisant les bandes :

-

l’ellipticité

maximum de la même bande _pour chacune des deux variétés moléculaires

exprimée

selon la même unité

(degré . cm2 /décimole

^d’acide

aminé),

- la surface

comprise

^sous

chaque

^{bande entre}

le spectre ^{et la}

ligne

^de

base,

- la mesure

approchée

des forces rotatoires des bandes. En raison de

l’aspect particulier

^du spectre

dichroïque

^de

l’hémoglobine (comme

^{nous allons le}

voir

ci-dessous),

formé de bandes

groupées

^{dans des}

domaines spectraux ^{limités avec de}

larges

intervalles

sans

absorption dichroïque

^ainsi que de la

quasi-

inexistence de bandes de sens inverse et

qui

^{se chevau-}

chent,

nous avons mesuré

plus

exactement la somme

algébrique

de chacune des composantes

gaussiennes

du spectre ^{dans un} domaine limité. En dehors des cas

où le spectre ^est

complexe

chacune des valeurs obte-

nues est en réalité

largement représentative

^d’une

bande

dichroïque principale.

Matériel et méthodes. ^-

1)

PRÉPARATION DES

ÉCHANTILLONS. ^- Les solutions

d’hémoglobine

^sont

préparées

par

purification

^{au toluène selon la méthode}

de Drabkin

[17] ; l’hémolysat

^est

centrifugé

^une

heure à 15 000 g ^{avant son} utilisation ultérieure. La

préparation

des chaînes a

et /3

s’effectue de la manière suivante. La

globine

^{soluble à}

pH

^{7 est}

préparée

^{en vue}

de la

séparation

^{des chaînes} par l’acétone-acide acé-

tique

^à froid selon la méthode de Anson et

Mirsky [18] ]

modifiée _par Schroeder

[19],

^{et en} effectuant la neutralisation _par

dialyse

^de

façon

^lente

(2 heures)

et

progressive.

^La

globine (300 mg)

^{est dissoute ensuite}

dans 10 ml de tampon

phosphate 0,05

^{M contenant 8 M} d’urée et

0,05

^{M de}

mercaptoéthanol.

^Le tampon

est

ajusté

^à

pH 6,7

par l’acide

phosphorique. Après dialyse

^{de 3 heures contre ce} tampon, l’échantillon de

globine

^est

chromatographié

^{sur colonne de car-}

boxyméthylcellulose

^{et élué} par ^un

gradient

^de

pH

^selon la

technique

^de

Olegg, Naughton

^et Weatherall

[20].

Après élution,

les chaînes sont collectées et

dialysées

contre de l’eau contenant

0,1

^{M de NaCI et}

passées

sur colonne de

Séphadex

^{G 25}

équilibrée préalable-

ment avec la même eau salée en vue d’éliminer les

phosphates.

Chaque

échantillon est ensuite

dialysé

^{et concentré}

contre une

grande quantité

^{d’eau contenant du}

poly- vinyl pyrolidone.

^{Tous les}

produits

^{examinés en}

spectroscopie

^sont dilués dans de l’eau distillée

ajustée

à

pH 7,

par

NaOH ;

^le

pH

^est

soigneusement

^contrôlé

immédiatement avant l’obtention d’un spectre.

2)

DÉSOXYGÉNATION. -

L’oxygénation complète

^se

fait évidemment ^en

agitant

^{les solutions à l’air. La}

désoxygénation

^{s’obtient en faisant}

barboter,

^{dans une}

cuve de verre fermée par ^un bouchon de

caoutchouc,

un courant d’azote amené à l’intérieur de la solution par ^une

aiguille ;

^{une autre}

aiguille

^{assure la sortie}

du gaz ; la

désoxygénation

^{totale nécessite au moins}

une demi-heure. Les échantillons sont

prélevés

par

une

aiguille

^{fine montée sur une}

seringue

^«

Plastipak » remplie puis

vidée d’azote. Ils sont introduits dans les cuves de quartz pour ^examen

spectroscopique ;

ces cuves

possèdent

^{un collet sur}

lequel

^est

adapté

un bouchon de caoutchouc à fermeture

hermétique ;

deux fines

aiguilles

traversent ce

bouchon ;

^{les cuves}

sont soumises d’abord à un courant

d’azote ;

^l’intro- duction de l’échantillon se fait _par une

aiguille longue qui

^{est montée sur la}

seringue

^et

qui

peut

pénétrer profondément,

^{même à} l’intérieur de la cuve de 1 ^mm de

trajet optique.

^La

désoxygénation complète

^est

obtenue d’une part

quand

^{la solution est décolorée}

uniformément et de manière

homogène

^{et d’autre} part

lorsque

^{la densité}

optique

^{à 560 nm atteint une}

valeur maximale en

plateau.

La méthode

classique [15] qui

^{consiste à réduire}

l’hémoglobine

^au moyen de dithionite

(Na2S204)

nous a donné des résultats semblables mais nous

préférons

^la

désoxygénation

^à l’azote de manière à diminuer les

risques

^de dénaturation.

3)

^MATÉRIEL DE SPECTROSCOPIE. ^- C’est la même

cuve de quartz

Suprasil

^{de 1 mm de}

trajet optique qui

^{nous a servi} pour toutes les mesures en ultraviolet lointain sur le

Dichrographe

^{et la même cuve de 1 cm}

pour celles dans le visible et le

proche

^{U. V.}

Les spectres

d’absorption

^{sont réalisés sur}

appareil

UNICAM étalonné

soigneusement

^avant

chaque

mesure.

Les concentrations

d’hémoglobine

^{sont évaluées}

spectrophotométriquement

^{en prenant comme coeffi-}

cient

d’absorption

a540 ⁼

0,85 ml/(mg

^x

cm) [16],

contrôlé

cependant

^{au moyen de la} solution étalon du C. N. T. S.

Le pourcentage ^de

l’oxyhémoglobine

^{est donné} par la formule :

où

DHb02’ ^{DHb et}

^{D sont}

respectivement

^{les densités}

optiques

^{à 560 nm de}

l’hémoglobine oxygénée,

^de

l’hémoglobine complètement

^réduite par du dithio- nite et de

l’hémoglobine

^étudiée.

Les spectres ^de dichroïsme circulaire sont

enregis-

trés

grâce

^{à un}

appareil

^Jouan

Roussel,

^{modèle CD 185}

équipé

^d’une

lampe

^{au xénon. La} différence des coeffi- cients d’extinction des composants ^{droit et}

gauche

est calculée _par la formule :

d est la déviation

enregistrée

^en mm,

s la sensibilité

utilisée,

c la concentration en grammes par

litre,

1 est le

trajet optique

^{de la cuve en} cm,

M est la masse moléculaire _{moyenne par} résidu d’acide

aminé ;

^{elle est}

prise égale

^à

107,3, 108,7

^et

108

[21] ] respectivement

pour les

chaînes,

^et pour

l’hémoglobine

^entière.

L’ellipticité

^{est donnée} par la formule

[16] :

[0]

^est

exprimé

^en

degré

^x

cm’/décimole

^d’acide

aminé.

L’étalonnage

^de

l’appareil

^{se fait avec une solution}

de testostérone dans l’éthanol dont le Ae connu à

216 nm est égal à 218

^{± 10.}

La vitesse

d’enregistrement

^des spectres ^{est choisie} très lente

(réglage

^{« OA ou OB}

»)

^{de sorte} que

chaque

cm de

papier représente

^{5 ou 10 nm. Dans} l’ultraviolet lointain nous utilisons

toujours

la vitesse la

plus

lente

(7,25 nm/minute).

^{L’erreur relative sur les}

déviations extrêmes est de 2

%

^{et un} peu

plus

^forte

au-dessous de 210 ^{nm en} raison de la tension

imposée

à

l’appareil.

Les courbes

présentées

^{sont la} moyenne de 5 spectres ^{établis avec la même} variété moléculaire mais au moyen d’échantillons différents.

Nous

soulignerons

^la

longueur

^et la difficulté des

manipulations

^{en anaérobie} surtout pour l’étude

dichroïque,

^{car en raison des fortes} différences d’ab-

sorption,

^{la cuve utilisée} pour le dichroïsme en ultra- violet lointain doit être de 1 mm et celle _pour les

mesures de saturation en

oxygène

^{à 560 nm, de 1 cm.}

L’utilisation d’une même cuve pour ^toutes les

mesures dans chacun de ces deux domaines spectraux permet de meilleures

comparaisons.

Mesure des forces rotatoires.

Une

première

méthode consiste à utiliser la méthode

d’intégration

^en

appliquant

les formules

classiques

relatives aux forces rotatoires. Ainsi la force rotatoire d’une bande k est donnée par la formule

[22] :

dans

laquelle NA

^{est le nombre}

d’Aogadro,

^{h la cons-}

tante de Planck et c la vitesse de la

lumière,

^cette

formule est valable

lorsque

^l’effet

dichroïque

^est

exprimé

^en

ellipticité molaire ;

^en unités C. G. S.

cette formule devient :

Les valeurs sont données habituellement ^en ergs ^x

cm’

^x radian ^{ou en} Biot

(1

^{Biot =}

^10-40

unité C. G.

S.).

La force rotatoire

Rk

^{s’obtient donc en calculant}

l’intégrale

des courbes :

Pour ^un groupe de

transitions,

^{la somme}

algébrique

des forces rotatoires des bandes dans le domaine où a

lieu

l’absorption dichroïque

^{est évaluée} par

intégration

de la formule

précédente

^{entre deux}

longueurs

^d’onde

qui

limitent l’intervalle

d’absorption.

Une ^autre méthode consiste à

décomposer

^le spectre

en

gaussiennes.

Si l’on assimile en effet une bande à

une

gaussienne, l’expression

^{de la} force rotatoire

se

simplifie

^et

l’ellipticité

^est alors donnée _par la formule :

où

[0]1

^est

l’ellipticité

^du

maximum, Âo

^la

longueur

d’onde

correspondante

^et

Ak

^la

demi-largeur

^{de bande}

à l’ordonnée

e-’

du sommet de la bande.

Après

substitution de cette

expression

^{dans la formule}

pré-

cédente donnant

Rk, l’intégrale

^se

simplifie

^{et l’on}

obtient ^en unités C. G. S. :

ceci permet ^une évaluation

rapide

^des forces rotatoires pour des bandes

approximativement gaussiennes.

Il est bien entendu nécessaire _pour

chaque

^intervalle

d’absorption dichroïque

^de

décomposer

^le spectre

en

gaussiennes, lorsque

^le

spectre

^{revêt une allure}

complexe.

Résultats. ^- Les résultats

qui

^suivent comportent les spectres

d’absorption

^{et de} dichroïsme circulaire des formes

oxygénées

^de

l’hémoglobine

^{et de chacune}

des chaînes a et

fl,

^ainsi que des formes

désoxygénées.

Il sera établi une

comparaison

^des différents spectres dans un double but. D’une

part, analyser

^{les carac-}

téristiques

^du

spectre

^d’une même forme

d’hémoglo-

bine avec celles des chaînes

correspondantes isolées,

de manière à savoir si l’interaction des chaînes a

et fl

dans la molécule entière comporte ^{une traduction}

spectrale ;

^dans

l’afhrmative,

^{observer si} cette tra- duction est

plus significative

pour les formes

oxygé-

nées ou pour les formes réduites. D’autre part, ^obser-

ver et mesurer les variations des forces rotatoires des bandes

dichroïques

^se

produisant

^{lors du} passage de la forme

complètement oxygénée

à la forme

complètement réduite,

d’un même échantillon molé- culaire.

RÉSULTATS OBTENUS SUR L’HÉMOGLOBINE ADULTE

NORMALE ET DES CHAINES a ET

p.

^-

a) Spectreî

^obtenus

dans le domaine visible

(600-460 nm).

^{- La}

figure

¹

représente

^les spectres

d’absorption

^de

l’oxyhémo-

FiG. 1. ^- Spectres d’absorption ^de l’oxyhémoglobine (-)

et de la désoxyhémoglobine (- - -) de 460 à 600 _{nm ;} c = 1,20 mg/

ml, trajet optique ¹ cm, solvant H20 à pH 7, température 20 °C ; le coefficient d’absorption a ^est exprimé ^en ml/(mg ^x cm).

globine

^{et de la}

désoxyhémoglobine.

^La

première présente

^deux

pics d’absorption

^{situés à 578 et 540} nm, la seconde un

large pic

^{dont le maximum est à 560 nm.}

La

figure

^{2a montre les} spectres

dichroïques

^de

FIG. 2a. ^- Spectres d’ellipticité ^de l’oxyhémoglobine (-),

des chaînes a (- -) et,8 (- -) oxygénées, et moyenne arithmé- tique (+ +) pour les chaînes a et fl (mêmes conditions expéri-

mentales _que Fig. 1), l’ellipticité [0] ^est exprimée ^en degré ^x cm2 j

décimole.

l’Hb02

^et des chaînes oc

et fl oxygénées. L’Hb02 présente

deux bandes

dichroïques positives

^{à 578 et}

540 nm et une bande

négative

^{à 520 nm. Les deux}

chaînes

oxygénées présentent

^deux

pics positifs

^situés

aux mêmes

longueurs

^d’onde que

l’Hb02,

^{mais la}

chaîne _a, contrairement à la chaîne

[3,

^ne

présente

pas de

pic négatif

^{à 520 nm.}

La

figure

^{2b montre les} spectres

dichroïques

^de

FIG. 2b. ^- Spectres d’ellipticité ^{de la} désoxyhémoglobine (-)

des chaînes a (- -) et fl (- ^{· -.} -) oxygénées et moyenne arithmé-

tique (+ +) pour les chaînes a et 8 (mêmes conditions expéri-

mentales _que Fig. 2a).

l’hémoglobine désoxygénée

^{et des chaînes a et}

p désoxy- génées ;

^{tous trois}

présentent

^{un effet Cotton}

positif

étalé et dont le maximum ^est situé à 560 _{nm ;} sur celui de la

première

^on peut ^{observer un}

épaulement

^vers

510 nm.

Il est intéressant de constater que

l’ellipticité

^de

la chaîne oc est

plus grande

que celle de la chaîne

fl,

aussi bien _pour la forme

oxygénée

que

désoxygénée.

Si le spectre ^{de la}

désoxyhémoglobine

^{reste très voisin}

de la courbe de la moyenne

arithmétique

des chaînes

désoxygénées,

^{il n’en} est pas de même _pour les formes

oxygénées ;

^en

effet,

^on peut remarquer dans ^{ce cas} que les deux courbes s’entrecroisent à 560 _nm, 520 nm et 480 _{nm, et}

présentent

des différences

plus marquées

que dans le cas

précédent.

Si les

ellipticités

^{sont du même ordre de}

grandeur

pour les formes

oxygénées

^et

désoxygénées,

^{les forces}

totales rotatoires des bandes situées au-delà de 500 ^nm sont

différentes ;

^le rapport des forces rotatoires

désoxy-Hb/oxy-Hb

^est

égal

^à

1,95 (voir

^Tableau

I).

b) Spectres

^{obtenus dans la}

région spectrale

^460-

360 nm. - Les spectres

d’absorption

des formes

oxygénées

^et

désoxygénées

^de

l’hémoglobine

^dans

ce domaine

spectral (Fig. 3)

^{sont très voisins l’un de}

FIG. 3. ^- Spectres d’absorption ^de l’oxyhémoglobine (-),

et de la désoxyhémoglobine (2013 ’ -), de 330 à 460 nm ; ^{c =} 1,2 mg/

ml, trajet optique Imm, ^solvant H20, ^à pH 7, température ^{20 °C.}

Le coefficient d’absorption exprimé ^en ml/(mg ^x cm).

l’autre. On _y observe le

pic d’absorption important

à 410 nm

qui correspond

^à la bande de Soret.

Les spectres de dichroïsme circulaire des

hémoglo-

bines

oxygénées

^et

désoxygénées présentent

^une

différence

marquée spécialement

^{vers 420 nm où}

l’ellipticité

^{de la forme}

désoxy prend

^{une valeur très}

intense _par rapport ^{à celle de la} forme oxy.

Les spectres de dichroïsme de

l’Hb02

^{et des chaînes a}

et fl oxygénées

^sont

représentés

^{sur la}

figure

^4a.

FIG. 4a. ^- Spectres d’ellipticité ^de l’oxyhémoglobine (-),

des chaînes a (- -) et P (-. -) oxygénées ^{et la} moyenne

arithmétique (++) pour les chaînes a et P ^{entre 340 et 460 nm} (mêmes conditions expérimentales que Fig. 2a).

L’oxyhémoglobine présente

^{un maximum à 420 nm,}

la chaîne a à 415 nm et la chaîne

fi

^{à 420 nm. Il est}

intéressant de remarquer ici

aussi, l’ellipticité plus importante

^{de la chaîne a} que celle de la

chaîne fi ;

en outre, ^un effet Cotton

négatif

^{à 390 nm est retrouvé}

pour

l’hémoglobine

^et pour la chaîne

fi

^{mais pas pour}

la chaîne oc.

Les spectres des formes

désoxygénées

^{de l’hémo-}

globine

^et des chaînes a et

fi

^sont

présentés figure

^4b.

FIG. 4b. ^- Spectres d’ellipticité des formes désoxygénées ^des

mêmes molécules _que figure 4a, ^avec des notations semblables.

On peut remarquer ^en

particulier l’importance

^de

l’ellipticité

^{à 422 nm de la}

désoxyhémoglobine

par rapport ^à celle des deux chaînes

séparément

^{et à leur}

moyenne

arithmétique.

Le rapport ^{des forces} rotatoires de la

désoxyhémo- globine

^{à celui de}

l’oxyhémoglobine

^{est trouvé}

égal

à

1,20 ;

^ici encore, tout ^comme pour les bandes obser- vées dans le

visible,

^ce _rapport est nettement

supé-

rieur à 1

(voir

^Tableau

I).

c) Spectres

obtenus dans le

proche

ultraviolet

(250

^nm-360

nm).

^{- Les} spectres

d’absorption

^des

deux formes

d’hémoglobine présentent

^{tous deux}

deux

pics d’absorption (Fig. 5) ;

^{l’un est situé à 265} nm,

FIG. 5. ^- Spectres d’absorption ^de l’oxyhémoglobine (-)

et de la désoxyhémoglobine (2013’2013), ^{entre 250 et 370} nm ;

c ⁼ 3 mg/ml, trajet optique ^{1 cm solvant} H20, ^à pH 7, tempé-

rature 20 °C. Le spectre ^{de la} désoxyhémoglobine ^{est très} voisin.

l’autre à 345 nm. Ce dernier

présente

^un coefficient d’extinction

légèrement

^{inférieur au}

précédent.

En dichroïsme

circulaire,

^on remarque l’absence de toute activité

optique

^{entre 360 et 310 nm, aussi}

bien pour les formes

oxygénées

que réduites des molécules étudiées.

Par contre, au-dessous de 310 nm, ^on observe une

intense activité

optique ;

les effets Cotton observés ici

correspondraient

essentiellement à des transitions

électroniques

^sur les noyaux

aromatiques

^latéraux

de la chaîne

polypeptidique (Blout ) [3].

Les spectres

dichroïques

des formes

oxygénées

^de

l’hémoglobine

^{et des deux chaînes}

(Fig. 6a)

^montrent

une

légère

^bande

positive

^{située à 300 nm, et une très}

ample

^bande

positive

de forme très arrondie dont le maximum est situé vers 265 nm.

FIG. 6a. ^- Spectres d’ellipticité ^de l’oxyhémoglobine (-)

des chaînes ce (- -) ^et 8 (2013’2013) oxygénées ^et la moyenne

arithmétique (+ +) ^{des chaînes a} et 18

(mêmes

conditions expé-

rimentales que (Fig. 5) ^{entre 240 et 300}

nm).

On _pourra remarquer

l’importance

de la surface

sous-jacente

à la bande à 265 nm

qui

^{est bien}

supé-

rieure à celle observée

plus

^haut pour la bande à 420 nm. Là encore le spectre ^de

l’hémoglobine

^s’écarte

nettement du tracé de la moyenne

arithmétique

^des

deux

chaînes,

notamment entre 300 et 280 nm.

Les spectres

dichroïques

des formes

désoxygénées

des mêmes molécules

(Fig. 6b) présentent

^{tous une}

FIG. 6b. ^- Spectres d’ellipticité ^{des formes} désoxygénées ^des

mêmes molécules _que figure 6a, ^{avec des notations} semblables.

forte bande

positive

^{à 265} nm ; la bande

positive

à 300 nm est extrêmement faible. Une bande

négative

située à 290 nm se retrouve pour la

désoxyhémoglobine

et pour la

chaînes

mais pas du tout pour la chaîne a.

Il est très

important

de remarquer

qu’ici l’ellipticité

du

pic

^{à 265 nm de la forme}

désoxygénée

^{est bien}

inférieure à celle de la forme

oxygénée.

^Le rapport des forces rotatoires

respectives

est, ^en

effet, égal

à

0,59,

^à

l’opposé

^{de ce} que nous avons pu observer

plus

^{haut dans le} domaine du visible et de la bande

d’absorption

^{de Soret.}

d) Spectres

^{obtenus en} ultraviolet lointain

(au-

dessous de 250

nm).

^{- Les} spectres

d’absorption

de

l’hémoglobine

^montrent l’existence d’une

absorp-

tion extrêmement intense au-dessous de 250 _{nm ;} il est

possible cependant,

^{en utilisant des solutions}

aqueuses suffisamment

diluées,

^{de descendre au-} dessous de 200 nm.

Les spectres ^de dichroïsme circulaire des formes

oxygénées

montrent, ^comme pour les

polypeptides

en a hélice

droite,

^{un minimum à 222} nm, ^un second minimum à 209 _nm, chevauchant avec le

précédent (Fig. 7),

^ainsi

qu’un pic positif important

^{à 195 nm.}

L’ellipticité

^de

l’hémoglobine

^{à 222 nm est}

égale

^à

33 000

degrés. cm2/décimole,

^ce

qui

permet ^d’évaluer

son hélicité à environ 80

%.

^{La chaîne oc semble}

présenter

^{une hélicité}

légèrement supérieure

^{à celle}

de la

chaînes (hélicité

^{de 82}

%

^{contre 78}

%).

Au cours de la

désoxygénation,

^{nous avons étudié}

l’aspect

^et

l’amplitude

du minimum à 222 _{nm ;} il

n’apparaît

^{pas de variation}

d’ellipticité

^{à 222} nm, aussi bien _pour les chaînes a que pour les chaînes

f3,

ainsi _{que pour}

l’hémoglobine ; l’amplitude

^{et la forme}

des

pics

^restent

pratiquement

^{immuables à cette}

FIG. 7. - Spectre d’ellipticité ^de l’oxyhémoglobine, ^{de 240 à}

200 nm ; ^{c =} 1,20 mg/ml, trajet optique ^{1 nm, solvant} H20, pH 7, température ^{20 °C. Le} spectre ^{de la} désoxyhémoglobine

coïncide avec celui-ci.

longueur

^d’onde

pendant

l’interconversion molé- culaire.

RÉSULTATS PARTICULIERS OBSERVÉS POUR CERTAINES

HÉMOGLOBINES ANORMALES. ^- Nous avons pu étudier

également

^la

désoxygénation

^des

hémoglobines

^anor-

males S et C ^en dichroïsme circulaire à 222 ^nm. La

première

^ne

présente

^aucune modification du

pic

à 222 _{nm ;}

cependant,

nous avons observé _que la seconde

(Fig. 8) présente

^une

légère

diminution de

l’amplitude

^{de ce}

pic lorsque

^le pourcentage ^{de satu-} ration en

oxygène décroît ; ainsi,

pour ^un tel _pour-

FIG. 8. ^- Modification de l’amplitude ^du pic dichroïque ^à

222 nm pour l’HbC au cours de la désoxygénation. [0]exp

est la déviation expérimentale exprimée ^{en cm, A} correspond ^à

l’HbC complètement oxygénée, ^{B à un stade de} désoxygéna- tion partielle ^{et C à un stade de} désoxygénation avancée. On pourra noter ^une diminution de 2 cm d’amplitude ^du pic ^à

222 nm en fin de désoxygénation.

centage ^de saturation en

oxygène

passant ^{de 100}

%

à 30

%, l’amplitude

^du

pic

^{diminue de 4}

%,

et, pour

une saturation

nulle,

^cette

amplitude

^{a baissé de 10}

% ;

ces variations

d’amplitude

^{nous semblent} être compa- tibles avec la sensibilité de

l’appareil

^et

représentent

une différence de hauteur du

pic

^{de 2 cm} pour ^un

pic

de 20 cm.

Discussion. ^- Des résultats

présentés ci-dessus,

il est

possible

^{de déduire les}

points

^{suivants :}

- il existe un certain nombre de

spécificités

spec- trales

dichroïques

des chaînes a

et fi interprétables

en termes de structure ;

- l’interaction des chaînes dans la molécule entière peut ^{avoir une} traduction en dichroïsme

circulaire ;

- il est

possible d’évoquer

certaines modifications de structure

spatiale

ayant ^lieu

pendant l’oxygénation,

à

l’origine

^des variations de forces rotatoires de certaines bandes

spectrales.

1)

SPÉCIFICITÉS SPECTRALES DICHROIQUES ^{DES CHAI-} NES OE ET

fi.

^- Il existe des différences

marquées

^entre

les spectres

dichroïques

^{des chaînes a}

et fi

^dans

plusieurs

^domaines spectraux. ^{Si la structure}

primaire

des deux chaînes est assez

proche,

l’existence du

chromophore héminique

^{lié de manière}

plus

^ou

moins

asymétrique

^{selon les chaînes est}

susceptible

de rendre compte ^de

plusieurs

^des

phénomènes

^obser-

vés.

Stryer [23]

^{avait montré} que la liaison de l’hème à un

polypeptide désorganisé, optiquement

^inactif

dans le

visible, s’accompagne

^d’une

absorption dichroïque

par suite de la création d’une

asymétrie

^de

configuration

^{au niveau de l’hème. Les} spectres

dichroïques

des chaînes oc

et fl

^{diffèrent dans le visible}

où l’on a vu que la bande

négative présentée

par la

chaîne fi

^{à 520 nm} n’est pas retrouvée pour la chaîne a.

Au niveau de la bande de Soret la

chaîne fi présente

une bande

positive

^nettement

déplacée

^{vers les}

plus grandes longueurs

^d’onde

(420 nm)

par rapport ^à celle de la chaîne oc

(415 nm),

^{et un}

pic négatif

^{à 395 nm}

qui

^n’existe pas pour la chaîne oc. En outre, ^{des diffé-}

rences entre les spectres

dichroïques

de deux chaînes s’observent ^au niveau de la bande à 290 nm.

Les différences

spectrales

des chaînes dans le visible et au niveau de la bande

d’absorption

de Soret font la _preuve d’une différence de structure

électronique

de l’hème en rapport ^{avec une}

spécificité

^conforma-

tionnelle de la chaîne

peptidique

avoisinante.

On pourra remarquer que la force rotatoire de la chaîne oc est constamment

plus importante

^{que celle}

de la

chaînes

^{pour les bandes des}

régions spectrales

étudiées. Un résultat semblable avait été observé pour les constituants de la

cyan-méthémoglobine

par

Beychok [9].

2)

TRADUCTION EN DICHROISME CIRCULAIRE DE

L’INTERACTION DES CHAINES DE LA MOLÉCULE ENTIÈRE. ^- La

comparaison

^{des courbes} formant la _moyenne

arithmétique

^des

ellipticités

^des deux chaînes et des