TP19 Extrait d'un sujet de BTS Biochimiste
1. DETERMINATION DE L'ACTIVITE SPECIFIQUE DE L'EXTRAIT BRUT
L'activité enzymatique est déterminée par action de l'extrait sur une suspension tamponnée à pH 6,2 de parois bactériennes (pH optimum d'action du lysozyme).
L'extrait brut est susceptible de contenir de 10 à 20 g/L de protéines totales. Le dosage sera réalisé par la méthode du biuret.
1.1. Dosage des protéines totales de l'extrait brut : 1.1.1. Étalonnage
A partir de la solution étalon de protéines à 5g/L (dans du tampon glycine pH 10) et en fonction du mode opératoire proposé pour l'essai, préparer directement une gamme d'étalonnage contenant au maximum 2,5 mg de protéines totales par tube.
1.1.2. Essais (2 essais exigés)
Diluer convenablement l'extrait brut à l'aide de tampon glycine pH 10. Introduire dans un tube à essai :
- dilution 0,5 mL
- réactif de Gornall 2 mL
Homogénéiser, attendre 30 min minimum à l'obscurité et lire au spectrophotomètre à (530-580 nm).
1.2. Détermination de l'activité enzvmatique de l'extrait brut (1 essai) Longueur d'onde utilisée 450 nm.
Dans une cuve spectrophotomètrique jetable de 1 cm de trajet optique introduire :
- suspension tamponnée pH 6,2 (équilibrée à 25°C) de parois bactériennes : 2,5 mL Mettre en place dans le compartiment (thermostaté) du spectrophotomètre.
Injecter alors à t = 0 20µL d'extrait brut et homogénéiser soit à l'aide d'un "plumper", soit par retournements successifs.
Enregistrer (ou lire de 15s en 15s) l'absorbance pendant 3 minutes maximum.
2. MISE EN OEUVRE DE LA PURIFICATION DE L'EXTRAIT BRUT SUR ECHANGEUR D'IONS (CARBOXYMETHYLCELLULOSE)
2.1. Purification Travail sur minicolonne analytique de carboxyméthylcellulose
La méthode retenue pour l'évaluation des protéines est le dosage U.V. à 280 nm en raison de sa simplicité et de sa rapidité d'exécution et ce, en dépit de son absence de spécificité.
L'activité de l'extrait purifié sera déterminée selon le mode opératoire décrit précédemment pour l'extrait brut.
2.1.1. Préparation de la colonne
Durant toutes les opérations ne jamais laisser l'échangeur à sec. Utiliser le petit obturateur pour interrompre l'écoulement si nécessaire.
On gardera pour toutes les opérations le débit naturel de la minicolonne (environ 0,2 à 0,4 mL/min).
- Remplissage :
Introduire à l'aide d'une canne de verre (utilisée comme pipette) la suspension tamponnée pH 10 et homogénéisée de carboxyméthylcellulose et laisser s'écouler l'excédent de tampon pour obtenir une sédimentation correcte.
La hauteur d'échangeur doit être comprise entre 2 et 3 cm pour une colonne de 0,6 à 0,8 cm de diamètre.
- Déposer avec précaution 1ml d'extrait brut et faire pénétrer.
2.1.2. Rinçage
Rincer avec 6 mL de tampon glycine pH 10 utilisé en deux fractions successives de 3 mL.
Les liquides de rinçage seront regroupés et tenus à la disposition des examinateurs, mais ne seront pas
Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 1/2
réutilisés dans le cadre de cette épreuve.
2.1.3. Elution
Procéder ensuite à l'élution à l'aide de 3 mL du mélange tampon glycine, chlorure de sodium et recueillir l'éluat (EXTRAIT PURIFIE) dans une fiole jaugée de 5 mL .
2.2. Évaluation de la méthode
Détermination de l'activité spécifique de l'extrait purifié.
2.2.1. Dosage U.V. (280 nm)
Préparer conformément au tableau ci-dessous des dilutions de la solution étalon tamponnée pH10 de lysozyme à 1 g/L.
Lysozyme (mL) 0,5 1 1 2
Tampon glycine pH 10 (mL) 9,5 9 4 3
Lire l'absorbance (après transfert dans une cuve « quartz spéciale » à 280 nm des solutions étalons et de l'extrait purifié (qui sera conservé) contre un témoin convenable.
Remarque :
L'essai peut être lu à n'importe quel moment, indépendamment de la gamme d'étalonnage.
2.2.2. Détermination de l'activité enzymatique de l'extrait purifié (1 essai) Protocole opératoire identique à celui utilisé pour l'extrait brut.
3. Compte rendu
Déterminer la teneur en protéines de l'extrait brut et de l'extrait purifié. Déterminer l'activité enzymatique de 1 mL de l'extrait brut et de l'extrait purifié. En déduire l'enrichissement et le rendement de cette étape de purification.
L'unité Lysozyme est définie comme la quantité d'enzyme qui provoque une diminution d'absorbance de 0,001 en 1 minute dans les conditions utilisées par ce test.
Données :
Résultats des tests enzymatiques.
Extrait brut : DA/min = 0,186 ; Extrait purifié DA/min = 0,035
