Réactions des espèces réactives de l’azote dérivées du monoxyde d’azote avec la mélatonine et quelques indoles apparentés. Implications biologiques.

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monoxyde d’azote avec la mélatonine et quelques indoles

apparentés. Implications biologiques.

Fabienne Peyrot

To cite this version:

Fabienne Peyrot. Réactions des espèces réactives de l’azote dérivées du monoxyde d’azote avec la mélatonine et quelques indoles apparentés. Implications biologiques.. Chimie analytique. Université Paris XI, 2004. Français. �tel-02615436�

UFR SCIENTIFIQUE D’ORSAY

THÈSE Présentée Pour obtenir

Le GRADE de DOCTEUR EN SCIENCES

DE L’UNIVERSITÉ PARIS XI ORSAY

PAR

Fabienne PEYROT

Sujet : Réactions des espèces réactives de l’azote dérivées

du monoxyde d’azote avec la mélatonine et quelques indoles

apparentés. Implications biologiques.

Soutenue le 13 octobre 2004 à Gif-sur-Yvette. Jury :

Jean-Pierre MAHY (Président) Jean-Luc BOUCHER (Rapporteur) Françoise NEPVEU (Rapportrice) Chantal HOUEE-LEVIN (Examinatrice) Daniel MANSUY (Examinateur)

Table des matières ... 2

Introduction... 6

A. Les espèces réactives de l’azote ...13

1. Monoxyde d’azote (NO) ...13

1.a. Caractéristiques physicochimiques...13

1.b. NO chez les mammifères ...14

1.c. Sources de NO exogènes : les donneurs de NO ...17

1.d. Réactivité du NO ...20

2. Dérivés oxydés ONOO•, •NO2, N2O3, NO2–...21

3. Peroxynitrite (ONOO–/ONOOH) ...24

3.a. Caractéristiques physicochimiques et implications biologiques ...24

3.b. Mise en évidence du peroxynitrite in vivo ...27

4. Nitroxyle ...28

4.a. Formation, existence in vivo...28

4.b. Effets physiologiques...29

4.c. Caractéristiques de la réactivité du sel d’Angeli ...30

B. Un type de cible des espèces réactives dérivées de l’azote : la mélatonine...33

Chapitre 1
: Matériel et méthodes ... 38

A. Produits ...38

1. Tampon utilisé...38

2. Mélatonine et autres dérivés hétéroaromatiques ...38

3. Synthèses de la 1-nitrosomélatonine et de la 1-nitroso-auxine ...40

3.a. Synthèse de la 1-nitrosomélatonine ...40

3.b. Synthèse de la 1-nitrosomélatonine radiomarquée...41

3.c. Synthèse de la 1-nitroso-auxine...41

4. NO gaz et donneurs de NO ...42

4.a. Solutions de NO...42

4.b. Différentes techniques de dosage des solutions de NO ...43

4.c. Solutions mères de donneur de NO ...45

5. Peroxynitrite ...46

5.a. Synthèse de peroxynitrite de sodium à partir de nitrite d’isoamyle et d’hydroperoxyde d’hydrogène... 46

5.b. Peroxynitrite de tétraméthylammonium ...47

5.c. Dosage du peroxynitrite et de ses contaminants...48

6. SIN-1...49

7. Sel d’Angeli ...49

B. Réactivité des espèces réactives de l’azote...50

1. Analyse par spectrophotométrie d’absorption ...50

1.a. Différentielle...50

1.b. En microplaque...50

2.a. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) analytique....51

2.b. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) préparative ..54

2.c. Analyses sur les fractions isolées par HPLC...55

2.d. Analyses sur composés solides...58

3. Analyse par spectrofluorimétrie avec le DAF-2...59

4. Réaction du radical dioxyde d’azote (•NO2) avec la mélatonine ...61

4.a. Appareillage ...61

4.b. Principe de la radiolyse et production de radicaux •NO2...61

4.c. Solutions et protocole...64

C. Étude de la 1-nitrosomélatonine...66

1. Étude de la libération de NO par résonance paramagnétique électronique (RPE) in vitro à l’aide d’un complexe de fer et de dithiocarbamate...66

1.a. Principe ...66

1.b. Étude à 298 K ...68

1.c. Étude à 77 K ...69

2. Étude pharmacologique ...70

2.a. Mutagenèse et cytotoxicité...70

2.b. Vasorelaxation et effet sur les paramètres cardiovasculaires...74

2.c. Inhibition de l’acétylcholine estérase...77

2.d. Distribution de la 1-nitrosomélatonine dans les organes chez la Souris ...77

Chapitre 2
: Réactions des espèces réactives de l’azote dérivées de NO .. 80

A. Réactions des indoles avec le peroxynitrite...80

1. Cas de la mélatonine...80

1.a. Mise en évidence de la réaction...80

1.b. Analyse et identification des produits de réaction...81

1.c. Effet du pH ...88

1.d. Effet de la concentration en hydrogénocarbonate de sodium ... 91

1.e. Effet du rapport entre les concentrations du peroxynitrite et de la mélatonine...93

1.f. Effet de la vitesse d’addition du peroxynitrite...94

1.g. Effet de l’ajout de nitrite ...95

2. Autres structures hétéroaromatiques ...80

2.a. Détection de l’absorption à 340 nm...98

2.b. Analyse par HPLC... 101

2.c. Détection de la réduction du peroxynitrite en NO par la mélatonine et l’auxine ... 106

B. Réaction de la mélatonine avec le dioxyde d’azote •NO2... 109

1. Production de radicaux •NO2 à partir de nitrate (expérience n°1)... 109

2. Production de radicaux •NO2 à partir de nitrite (expériences n°2 à 4) ... 113

3. Origine du groupe nitroso de la 1-nitrosomélatonine... 115

3.a. Réaction de •NO2 en présence de 14NO2– (expérience n°5)... 116

3.b. Réaction de •NO2 en présence de 15NO2– (expérience n°6) ... 117

C. Réaction de la mélatonine avec NO et le DEA/NO ... 118

D. Réaction avec le sel d’Angeli ... 120

1. Cas de la mélatonine... 120

1.a. Mise en évidence de la réaction et caractérisation du produit... 120

1.c. Effet d’un ajout de nitrite de sodium, de peroxyde d’hydrogène ou

d’hydrogénocarbonate de sodium ... 123

2. Cas de la N-acétyltryptamine et de l’auxine ...124

Chapitre 3
: Propriétés physicochimiques et biologiques de la

1-nitrosomélatonine... 125

A. Décomposition spontanée ... 125

1. Cinétique de décomposition et influence de paramètres physicochimiques ... 125

1.a. En solution aqueuse tamponnée ... 125

1.b. En solution organique ... 127

2. Produits de décomposition en solution aqueuse... 128

2.a. Fragment indole ... 128

2.b. Libération de NO ... 129

B. Étude pharmacologique ... 133

1. Mutagenèse et cytotoxicité... 133

2. Neuroprotection... 143

3. Vasorelaxation et effet sur les paramètres cardiovasculaires... 144

3.a. Effet vasorelaxant ... 144

3.b. Enregistrement des paramètres systémiques de circulation sanguine et du débit sanguin cérébral local chez le Rat... 148

4. Effet sur la libération de quelques neuromédiateurs ... 149

5. Inhibition de l’acétylcholine estérase ... 150

6. Étude de la distribution de la 1-nitrosomélatonine dans les organes chez la Souris ... 151

6.a. Étude préliminaire : stabilité de la 1-nitrosomélatonine dans le plasma de Souris ... 151

6.b. Distribution de la radioactivité après l’injection intrapéritonéale de 1-nitroso-[O-méthyl-3H]mélatonine ... 151

6.c. Étude RPE ex vivo avec le complexe (MGD)2-Fe2+ de la répartition de la 1-nitrosomélatonine après injection intrapéritonéale. Comparaison avec le S-nitrosoglutathion...154

Chapitre 4
: Discussion ... 160

A. Réactions de la mélatonine avec le peroxynitrite... 160

1. Caractéristiques générales des réactions du peroxynitrite (ONOO–) avec la mélatonine... 160

2. Arguments pour un mécanisme radicalaire... 161

3. Propositions mécanistiques basées sur les effets du pH et de la concentration en CO2 dissous ... 163

3.a. Effet de l’ajout d’hydrogénocarbonate de sodium... 164

3.b. Précurseurs des indol-2-ones et des pyrrolo-indoles ... 165

3.c. Formation des nitromélatonines ... 167

3.d. Kynuramines et 1-nitrosomélatonine... 168

4. Effet d’un ajout de nitrite ... 170

5. Effet d’une addition lente du peroxynitrite ... 170

6. Implications biologiques... 171

B. Réaction des radicaux •NO2 avec la mélatonine. Effet du nitrite dans la réaction du peroxynitrite... 173

1. Interprétation de la réaction des radicaux •NO2 avec la mélatonine... 173

2. Conséquences pour l’interprétation des réactions du peroxynitrite ... 178

C. Nitrosation de la mélatonine par NO et le DEA/NO... 180

D. Discussion au sujet de la réaction avec le sel d’Angeli... 182

E. Propriétés physicochimiques et biologiques de la 1-nitrosomélatonine ... 183

1. Un nouveau type de donneur de NO ... 183

2. Effets biologiques et implications thérapeutiques potentielles ... 187

2.a. Effet cardiovasculaire ... 187

2.b. Pharmacocinétique... 187

2.c. Action sur les neuromédiateurs ... 190

2.d. Mutagenèse et pouvoir cancérigène ... 190

ANNEXE I : Publication ... 194

ANNEXE II : Nomenclature des espèces réactives de l’azote ... 205

ANNEXE III : La mitochondrie, un exemple de site de régulation par les

espèces réactives dérivées de l’azote et de l’effet bénéfique de la

mélatonine... 206

ANNEXE IV : Liste d'abréviations ... 209

Les premiers organismes vivants photosynthétiques sont à l’origine de l’apparition du dioxygène (O2) dans l’atmosphère terrestre. Des formes de vie aérobie se sont alors

développées, qui utilisaient le dioxygène comme source d’énergie et comme substrat. La réduction à quatre électrons de O2 par la chaîne respiratoire mitochondriale est le moteur

de la synthèse d’adénosine triphosphate (ATP) dans la cellule. Le monde vivant utilise d’autres composés gazeux très simples comme vecteurs d’échanges entre les organismes et avec l’environnement : le dioxyde de carbone (CO2) et le monoxyde d’azote (NO).

NO est l’un des constituants gazeux atmosphériques (quelques ppb à ppm), produit de la combustion du diazote et de la réduction des ions nitrate et nitrite par les bactéries. Il intervient dans la destruction de la couche d’ozone. Sa concentration, ainsi que celle de

•

NO2, augmente dans les gaz d’échappement, les fumées industrielles et de cigarette mais

aussi à cause des émissions des volcans et des éclairs. NO est utilisé comme matière première dans l’industrie chimique dite lourde. Dès le début des années 1980, une synthèse endogène et son importance fonctionnelle a été mise en évidence chez les animaux supérieurs comme les mammifères.

Les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote chez les mammifères

De nombreuses réactions, enzymatiques ou non, opèrent l’oxydation et la réduction du dioxygène et du monoxyde d’azote dans l’organisme et conduisent à la formation d’espèces réactives variées. Quelques-unes sont présentées dans le Tableau 1. Elles sont présentes de façon ubiquitaire dans tous les types cellulaires.

Ces espèces dérivées de l’oxygène et de l’azote peuvent interagir et aussi modifier les molécules biologiques comme les acides nucléiques (coupures de brins d’ADN, modifications des bases nucléiques), les protéines, les lipides insaturés ou les petites molécules (métabolites, vitamines...) en effectuant des réactions d’oxydation, de nitration ou de nitrosation. Parfois, ces réactions sont totalement non spécifiques (cas des réactions d’oxydation), tandis que d’autres sont très sélectives du point de vue de l’espèce en jeu, la nature de la cible et son environnement.

Nature des espèces réactives Principales sources Processus d’élimination Stress induit

Anion superoxyde et radical perhydroxyle O2•–∆ HO2• (pKa = 4,9)

Activité mitochondriale, NADPH oxydase, xanthine oxydase,

lipoxygénase, cycloxygénase... Systèmes redox quinones/hydroquinones Hydroperoxyde d’hydrogène H2O2 2 O₂•– + 2 H+ k = 1,0×10 8 M-1.s-1 ⎯ → ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ H2O2 + 3 O₂

Dismutation spontanée ou catalysée par la superoxyde dismutase

Réaction avec NO Catalase

Glutathion peroxydase

Radical hydroxyle •OH Réaction de Fenton (Fe2+/H2O2)

Réactions non spécifiques Hydroxylation Oxygène singulet 1O2

Neutrophiles b :

H₂O₂ + HOCl ⎯ → ⎯ 1O₂ + HCl + H₂O

Ozone O3 Anticorps convertissent

1

O2 en O3b

Atmosphère

Stress oxydant

Anhydride nitreux a N2O3

Radical nitrosoperoxyle a ONOO•

•

NO + O2 Réaction avec thiols, amines Stress nitrosant

Acide peroxynitreux et anion peroxynitrite a ONOOH ∆ ONOO– • NO +O2•– ONOO – _{+ CO} 2 ⎯ → ⎯ ONOOCO2 –

Réactions avec thiols, vitamines... Dioxyde d’azote a •NO2

H2O2 + peroxydases + NO2–

Atmosphère Réactions avec thiols, vitamines...

Stress oxydant et nitrant

a. Voir annexe II pour la nomenclature systématique des espèces réactives de l’azote dérivées de NO. b. (Babior 2003)

7-État d’équilibre, signalisation

Il existe un niveau élevé de systèmes antioxydants et réducteurs à l’intérieur de la cellule qui agissent en régulant l’action de ces espèces pro-oxydantes. Se sont soit de petites molécules (glutathion, urate...), soit des enzymes (superoxyde dismutase, catalase...). Les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote interviennent alors comme médiateurs d’un processus de signalisation nouveau, appelé « signalisation cellulaire redox ».

La signalisation cellulaire redox est définie comme le résultat de réactions et de régulations associées relevant de la chimie d’oxydoréduction (Gabbita 2000).

Des capteurs sensibles à l’état redox existent dans la cellule, qui ont un rôle fonctionnel (récepteurs, médiateurs, enzymes, facteurs de transcription) ou régulateur (vitamines, glutathion) (Stamler 2001 ; Landar 2003). Une espèce réactive de l’oxygène et de l’azote peut activer directement un récepteur en étant elle-même ligand. Elle peut aussi agir indirectement en modifiant le ligand d’un récepteur. Un autre mécanisme est la modification post-traductionnelle de protéines de signalisation qui entraîne un changement de fonction de ces protéines (activation ou inhibition).

Quelques exemples de signalisation cellulaire redox montrent que la source de l’effecteur doit être proche de la cible et que celle-ci doit disposer d’une spécificité moléculaire.

Activation par NO de la guanylate cyclase, une hémoprotéine intervenant dans la régulation du tonus vasculaire, la neurotransmission et l’agrégation plaquettaire selon le type cellulaire. NO active la production de guanosine monophosphate cyclique (GMPc) en se liant au fer de l’hème. Cette réponse rapide et réversible est typiquement une réponse au stress physique (mouvement, blessure, température...) ou psychologique (Wink 1998).

Activation des kinases par le peroxynitrite (Klotz 2002 ; Minetti 2002).

Activation de récepteurs spécifiques par des lipides oxydés ou nitrés dans l’athérosclérose (Terpstra 1998 ; O'Donnell 1999).

Activation de la cyclo-oxygénase ou inhibition de la prostacycline synthase par le peroxynitrite (Schmidt 2003). La régulation de la synthèse des prostaglandines par le peroxynitrite est un exemple de signalisation qui ne passe pas par un récepteur.

Pour pouvoir parler de signalisation, il faut cependant que les processus considérés répondent à des critères de spécificité, localisation et réversibilité.

Les modifications d’acides aminés dans les protéines ne se font pas au hasard, mais semblent conditionnées par la séquence des acides aminés environnant comme dans le cas de la signalisation par phosphorylation. Ces séquences consensus commencent tout juste à être mises à jour. La situation des résidus cibles à proximité des métaux de transition des sites actifs des enzymes peut également orienter les transformations.

Un résidu cystéine sur 50 est nitrosé dans le récepteur à la ryanodine. Souvent le résidu cystéine cible de la nitrosation est entouré de motifs acido-basiques (protéine ras, hémoglobine...) ou hydrophobes (récepteur à la ryanodine, NO-synthase...) dans la structure primaire ou tertiaire de la protéine (Stamler 2001). Il a été montré que la nitration des résidus tyrosine a lieu sur des protéines particulières et, en particulier, que la localisation subcellulaire joue un rôle dans la détermination de la transformation (Souza 1999 ; Aulak 2001 ; Pignatelli 2001). La réversibilité des transformations opérées par les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote est une question critique. Les modifications de thiols (oxydation en disulfures ou S-nitrosation) ou la nitrosylation des métaux sont des transformations réversibles. L’oxydation ou la nitration des lipides au contraire sont essentiellement irréversibles. La nitration des protéines est une transformation dont la réversibilité a été décrite dans divers systèmes biologiques, mais dont les mécanismes ne sont pas encore élucidés (Kamisaki 1998 ; Irie 2003). Elle est parfois un motif d’adressage au protéasome.

Le séquence des acides aminés environnant la cible peut intervenir dans le processus de dénitrosation, ainsi les résidus polaires et nucléophiles agissent comme catalyseurs de la dénitrosation du tryptophane (Suntsova 2002).

Il faut souligner un rôle important de toutes les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote sur l’expression des gènes, rôle qui commence à être décrit dans la littérature, aussi bien pour O2•– et H2O2 que pour NO et ses dérivés oxydés (Mathy-Hartert 2003).

Déséquilibre et notion de stress

Dans certaines situations pathologiques, l’équilibre redox de la cellule est rompu et les mécanismes de défense sont dépassés. Apparaît alors un dérèglement avec excès des métabolites oxydés ou nitrés et déficit des thiols, de la vitamine E (tocophérol) ou d’autres espèces.

En biologie, on parle de stress pour désigner l’ensemble des réactions pathophysiologiques dues aux espèces dérivées de l’oxygène et de l’azote dans ces situations de déséquilibre. On peut faire une distinction entre stress oxydant, nitrant et nitrosant en considérant la nature chimique de la modification finale de la cible biologique. Cependant le terme de stress oxydant est adapté à toutes les situations car l’ensemble des modifications chimiques observés résulte d’une première étape d’oxydation.

Le stress oxydant, nitrant et nitrosant apparaît comme le point commun d’un grand nombre de pathologies même si les sources et les cibles biologiques des espèces réactives diffèrent d’une maladie à l’autre. On retrouve par exemple les manifestations du stress dans les maladies neurodégénératives (maladies d’Alzheimer et de Parkinson…(Markesbery 1999 ; Zhang Y. 2000)), le diabète (Turko 2003), l’athérosclérose (Yokoyama 2004), mais aussi dans les états post-traumatiques (trauma, ischémie-reperfusion), et dans les situations d’inflammation ou de choc septique (Dedon 2004). La thèse d’un rôle délétère des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote est confortée par le fait que le vieillissement est un facteur de risque important pour bon nombre de ces pathologies.

Dans les formes familiales des maladies neurodégénératives, des mutations ont été identifiées sur les enzymes antioxydantes ou dans les protéines qui régulent l’homéostasie des espèces radicalaires (mutations de la superoxyde-dismutase à cuivre et zinc dans les formes familiales de la sclérose amyotrophique latérale (Rosen 1993)).

L’apparition précoce des marqueurs du stress oxydant, qui précède souvent les signes plus spécifiques à la pathologie, est un argument en faveur de son implication en tant que cause première.

Chez les patients parkinsoniens, dans les neurones de la Substance Noire du cerveau, l’agrégation en protofibrilles puis en fibrilles d’une protéine particulière, l’α-synucléine, est caractéristique de la maladie. L’analyse de ces fibrilles montre que la protéine est nitrée (Giasson 2000). Quelques éléments indiquent que la nitration favorise la formation des fibrilles in vitro (Paxinou 2001).

Dans un modèle animal de la maladie d’Alzheimer, l’augmentation de la peroxydation lipidique précède l’apparition des plaques séniles, agrégats de peptides β-amyloïdes dans les neurones (Pratico 2001).

D’autre part, de plus en plus d’éléments confirment que l’accumulation des dommages occasionnés par les radicaux oxydants au cours du temps, et au fur et à mesure

que les mécanismes de réparation perdent de leur efficacité, sont intimement liés au processus de vieillissement (Harman 1993 ; Beckman K. B. 1998 ; Harman 1998).

Les antioxydants

Des stratégies thérapeutiques visant à prévenir la formation de ces espèces, à les piéger ou à limiter les dommages qu’elles causent ont été proposées et sont en cours de développement (Cuzzocrea 2001 ; Moosmann 2002). Les tests utilisés pour évaluer les médicaments potentiels sont très variés.

Le caractère antioxydant d’une molécule est défini initialement comme la capacité à retarder l’oxydation des molécules organiques par le dioxygène de l’air.

L’auto-oxydation des lipides ou peroxydation lipidique obéit à un mécanisme de réaction en chaîne induit par un système FeSO4/H2O2. :

Initiation :

ROOH ⎯ → hν, ∆, ion métallique⎯ ⎯ ⎯ ⎯ RO•+ HO• RO•+ RH ⎯ → ⎯ ROH+ R• Propagation :

R•+ O₂ ⎯ → ⎯ ROO• ROO•+ RH ⎯ → ⎯ ROOH+ R• Terminaison :

ROO•+ ROO• ⎯ → ⎯ produits non radicalaires

Le monoxyde d’azote a une action antioxydante vis-à-vis de la peroxydation lipidique en milieu aqueux car il peut stopper la propagation de la chaîne en se recombinant avec R•. Au contraire, NO est pro-oxydant en milieu non aqueux par l’intermédiaire de •NO2 et N2O3 (Hiramoto 2003).

Un “antioxydant” peut agir de différentes manières. Le composé peut prévenir l’auto-oxydation en ralentissant l’étape d’initiation, en décomposant les hydroperoxydes initiateurs ou en chélatant les ions métalliques qui catalysent la formation de radicaux à partir des hydroperoxydes (réaction de Fenton). Il peut aussi interrompre la chaîne d’oxydation en réagissant avec les porteurs de chaîne radicalaires (cas de NO). Il est possible de tester indépendamment chaque voie pour comprendre le mode d’action de la molécule (piégeage de H2O2, chélation de métaux, piégeage de radicaux tel le radical

1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle). Un paramètre informatif pour prévoir le caractère antioxydant d’une molécule est la mesure de son pouvoir réducteur par électrochimie.

D’autres tests évaluent plus spécifiquement la capacité des molécules à piéger les espèces réactives dérivées de l’oxygène et de l’azote (O2•–, peroxynitrite, •NO2…). Dans le

cas du peroxynitrite, on évalue l’inhibition de l’oxydation de la dichlorodihydrofluorescéine, l’inhibition de la nitration de la tyrosine ou l’inhibition de la coupure simple brin de l’ADN d’un plasmide.

On peut aussi évaluer des effets antioxydants indirects en mesurant l’inhibition d’enzymes pro-oxydantes (NO-synthases, lipoxygénases…) ou antioxydantes (superoxyde dismutase…) dans des cultures cellulaires ou in vivo.

Un grand nombre de structures issues de la synthèse ou bien extraites du monde vivant (animaux, plantes, micro-organismes) font l’objet de tests à l’heure actuelle. Celles dont le pouvoir antioxydant et la capacité de piégeage vis-à-vis des espèces réactives dérivées de l’oxygène et de l’azote sont reconnus actuellement appartiennent toutes à quelques grandes familles (Vertuani 2004) :

♦ les phénols et polyphénols (vitamine E, tyrosine, flavonoïdes, catéchine, resveratrol) ;

♦ les polyènes (carotène, lycopène, rétinol) ;

♦ les thiols (glutathion, N-acétylcystéine, méthionine) ; ♦ les acides nucléiques (urate, guanine) ;

♦ les métalloporphyrines ;

♦ les composés contenant du sélénium (ebselen).

Les indoles, molécules aromatiques de la famille du tryptophane, font également l’objet de ce type de tests (Wang 2001 ; Andreadou 2003 ; Tsia 2003 ; Herraiz 2004), la mélatonine étant souvent considérée comme le chef de file ou la référence.

L’objet du travail de thèse présenté ici est d’étudier les mécanismes chimiques fondamentaux qui sous-tendent les différents rôles physiologiques des espèces réactives dérivées de l’azote. Nous allons donc passer en revue les caractéristiques physicochimiques des différentes espèces dérivées de NO et faire un bilan de leur implication dans les processus physiologiques. Puis nous présenterons une cible particulière de ces espèces, que l’on a choisi comme modèle dans cette étude, la mélatonine.

A.

Les espèces réactives de l’azote

Les espèces réactives de l’azote chez les mammifères proviennent du monoxyde d’azote et du nitrite. Il convient en premier lieu de décrire NO, le nitrite étant son produit d’auto-oxydation stable.

1.

Monoxyde d’azote (NO)

1.a. Caractéristiques physicochimiques

Le monoxyde d’azote ou oxyde nitrique (NO) est appelé oxidonitrogen(•) dans la nomenclature systématique la plus complète des espèces réactives dérivées de l’azote (Koppenol 1996b ; Koppenol 2002) (voir annexe II). C’est un gaz paramagnétique non chargé et lipophile qui est faiblement soluble dans l’eau (1,95 mM à 20°C sous 1 atm, 3,27 mM à 0°C et 0,08 mM à 80°C, Merck Index). Sa solubilité décroît lorsque la force ionique I augmente. En conditions physiologiques (37°C, I = 0,15 M), elle ne dépasse pas 1,55 mM dans la phase aqueuse. Toutefois, la solubilité de NO dans les membranes pourrait être six à sept fois supérieure (Koppenol 1998a).

La configuration électronique fondamentale du monoxyde d’azote est σ2s2 σ*2s2 π2p4 σ2p2π*2p1. C’est un radical stable qui ne se dimérise pas et ne se dismute pas dans les conditions ordinaires de pression et de température contrairement à la plupart des radicaux (par exemple l’anion superoxyde O2•–). Cela est en partie dû à la forte délocalisation de

l’électron célibataire dans l’orbitale π*2p (Bonner 1996). Les longueurs de liaison N-O et les indices de liaison pour •NO et les espèces chargées voisines : cation nitrosonium ou nitrosyle NO+ et anion nitroxyle ou oxydonitrate(1-) NO–, sont présentées dans le tableau ci-dessous.

Espèce NO+ NO NO–

Degré d’oxydation de N +III +II +I

Formules de Lewis _{N O} N O N O

Indice de liaison 3 2,5 2

Longueur de liaison (pm) 106,2 115,1 126

Isoélectronique à : N2 O2+ O2

1.b. NO chez les mammifères Découverte

En 1998, le prix Nobel de physiologie et médecine a été décerné conjointement à R. F. Furchgott, L. J. Ignarro et F. Murad pour leurs découvertes concernant « le monoxyde d’azote (NO) comme molécule signal du système cardiovasculaire ».

En 1977, Murad établit que l’action vasodilatatrice de la nitroglycérine et d’autres nitrates organiques utilisés dans le traitement de l’angine de poitrine est due à la dégradation de leur fonction nitrée.

Dès 1980, Furchgott propose que la dilatation des vaisseaux sanguins par traitement à l’acétylcholine soit en fait causée par une molécule signal appelée EDRF (« endothelium derived relaxing factor ») et synthétisée par l’endothélium (couche de cellules la plus interne des vaisseaux), mais il n’en précise pas la nature.

En 1986, Ignarro et Furchgott identifient indépendamment, l’EDRF à NO. C’était alors un concept nouveau qu’un composé inorganique produit par une cellule puisse servir de messager en diffusant librement à travers les membranes pour réguler l’activité des cellules voisines. Depuis le coefficient de diffusion de NO dans les milieux biologiques à 37°C a été évalué à 3,30.10-5 cm2.s-1, proche de celui de O2, et il est admis que sa neutralité de charge

l’autorise à franchir les membranes et à traverser plusieurs couches cellulaires. In

vitro, le temps de demi-vie de NO à une concentration de 10 nM en présence de

10 µM de O2 est voisin de 106 s, ce qui lui permet de diffuser à une distance de

26 cm. En réalité, dans l’organisme, cette durée de vie est réduite à environ 5 s à cause des processus d’élimination.

Depuis cette époque, des rôles physiologiques multiples et ambivalents ont été attribués au monoxyde d’azote. La littérature qui lui est consacrée est considérable.

Biosynthèse de NO par les NO-synthases

Le monoxyde d’azote endogène est synthétisé par l’intermédiaire d’enzymes NO-synthases (NOS) très spécifiques de leur substrat et finement régulées. Ces mono-oxygénases apparentées aux cytochromes P450, catalysent l’oxydation de la L-arginine, acide aminé essentiel, en L-citrulline et NO en utilisant le dioxygène comme co-substrat.

HOOC NH₂ HN NH₂ H₂N 0,5 NADP+ H2O HOOC NH₂ HN NH₂ N H HO HOOC NH₂ HN NH₂ O NADP+ H2O 0,5 NADPH, H+ O2 NADPH, H+ O2 + NO L-Citrulline Nω-Hydroxy-L-arginine L-Arginine

Figure 1 : Mécanisme de la biosynthèse de NO par la NO-synthase à partir de L-arginine. On connaît trois types de NOS chez les mammifères : la NOS neuronale (nNOS ou NOS I), la NOS inductible (iNOS ou NOS II) et la NOS endothéliale (eNOS ou NOS III). Elles sont nommées selon leur ordre de découverte et d’après leur première localisation connue ou leur caractéristique d’expression.

Chacune de ces enzymes est séparée en deux domaines reliés par un site de liaison de la calmoduline : une partie C-terminale réductase, faisant intervenir le NADPH comme source d’électrons et des flavines (FAD, FMN) comme relais, et une partie oxygénase qui comprend un site de fixation de l’hème, du substrat L-arginine et du cofacteur tétrahydrobioptérine (BH4).

La nNOS et la eNOS sont constitutives et actives sous forme d’homodimères. Elles sont sensibles à la concentration en ions calcium par l’intermédiaire de la fixation de la calmoduline. Elles synthétisent de petites quantités de NO (pmol/min par mg de protéine d’homogénat) pendant quelques secondes à quelques minutes.

La synthèse de la iNOS est régulée par activation ou inhibition de la transcription (par des cytokines). L’activité de cette enzyme est indépendante de la concentration en Ca2+ car la calmoduline est fixée quasi irréversiblement au moment de la synthèse. La iNOS implique une production de grandes quantités de NO (nmol/min par mg de protéines d’homogénat) sur une longue durée (heures, jours).

Dans certaines conditions particulières (déficit en substrat ou en cofacteurs), la NOS peut synthétiser de l’anion superoxyde et de l’hydroperoxyde d’hydrogène .

Figure 2 : Cycle catalytique de la NO-synthase détaillé pour la formation de la

Nω-hydroxy-L-arginine (Nω_{-O H -L-arg) ; un cycle analogue peut être écrit pour la} formation de NO à partir de la Nω-hydroxy-L-arginine mais toutes les étapes n’ont pas toutes été confirmées (L-arg, L-arginine ; BH4, tétrahydrobioptérine) (Vasquez-Vivar 1999).

Rôles physiologiques

♦ NO est médiateur du système cardiovasculaire et neuromédiateur du système nerveux central : il maintient le tonus vasodilatateur nécessaire à la régulation de la circulation sanguine et de la pression artérielle et inhibe l’agrégation plaquettaire. NO produit par l’endothélium, la plaquette ou le neurone diffuse jusqu’aux cellules voisines où il active la guanylate cyclase. Cela entraîne une augmentation du taux de guanosine monophosphate cyclique (GMPc) qui active ou inhibe des kinases.

♦ NO intervient dans le système immunitaire. Il est libéré en grandes quantités par les macrophages (les cellules immunitaires qui combattent les infections et les tumeurs) lors de certaines réactions immunologiques ou de défense contre les micro–organismes ; il est impliqué dans la physiopathologie du choc septique, du trauma, de l’ischémie-reperfusion

et de l’inflammation (Grisham 1998 ; Dedon 2004). Sa synthèse est généralement accompagnée de production d’autres espèces réactives de l’oxygène.

♦ NO régule l’expression de nombreux gènes directement en modulant l’activité des facteurs de transcription, mais aussi en agissant sur les cascades de signalisation en amont, en modifiant la stabilité des ARN messagers et leur traduction et même en influençant la maturation des produits primaires des gènes (Bogdan 2001).

♦ NO joue un rôle complexe dans l’apoptose, la prolifération cellulaire et le développement. Il a été clairement établi que de faibles concentrations de NO peuvent empêcher l’apoptose et stimuler la prolifération cellulaire, tandis qu’une production accrue de NO peut activer le processus de mort programmée de la cellule. L’effet protecteur de NO passe entre autres par l’inhibition de l’activation des caspases, une famille de protéases impliquées dans les mécanismes de l’apoptose (Kim 1997). La régulation par NO de la croissance des tumeurs présente un effet de concentration seuil identique (Thomas 2004). ♦ NO régule l’homéostasie du fer par l’activation ou l’inhibition de l’activité et de l’expression de plusieurs protéines impliquées dans son métabolisme (hème oxygénase, IRP...) (Wink 1998).

En réalité une partie des actions de NO passent par des mécanismes indirects et la production d’espèces réactives dérivées comme le peroxynitrite ou l’anhydride nitreux.

1.c. Sources de NO exogènes : les donneurs de NO

Bien avant la découverte du rôle de NO dans le système cardiovasculaire, on utilisait des nitrates organiques R-ONO2 (nitroglycérine...) de façon empirique pour traiter

l’angine de poitrine. Leur mécanisme d’action fait encore l’objet de nombreuses recherches, mais l’opinion communément admise est que ces composés exercent leur action vasorelaxante par la libération de monoxyde d’azote in vivo lors de la métabolisation par l’aldéhyde déshydrogénase (Chen 2002).

Plus récemment, le nombre de composés pharmacologiques capable de délivrer NO dans des conditions physiologiques a considérablement augmenté et l’on dispose aujourd’hui d’une panoplie complète de donneurs de NO dont les durées de vie et les mécanismes de décomposition varient beaucoup pour s’adapter aux besoins de l’expérimentateur ou du thérapeute.

HOOC H N N H COOH NH2 O H2C O S NO H2N COOH S NO H N COOH S NO H3C O H N COOH S NO H3C H3C H3C O

S-nitrosoglutathion (GSNO) S-nitrosocystéine (CysNO)

S-nitroso-N-acétyl-d,l-pénicillamine (SNAP) S-nitroso-N-acétylcystéine (SNAC)

Figure 3 : Structures de quelques S-nitrosothiols utilisés ici.

Les S-nitrosothiols RSNO (voir Figure 3) sont les analogues soufrés des nitrites organiques (Welch 1996). Il se décomposent de façon non enzymatique par un mécanisme photochimique ou thermique pour donner le disulfure correspondant et NO.

2 RSNO ⎯ → hν , ∆⎯ ⎯ RSSR + 2 NO (1)

En solution à température ambiante et à l’abri de la lumière, la décomposition fait intervenir un catalyseur rédox (ions Cu2+, Cu+, Fe2+, Fe3+, Hg2+, thiol ou ascorbate).

RS– + Cu2+ ⎯ → ⎯ RS• + Cu+ (2)

RSNO + Cu+ ⎯ → ⎯ RS– + Cu2+ + •NO (3)

RSNO + RS• ⎯ → ⎯ RSSR + •NO (4)

2 RS• ⎯ → ⎯ RSSR (5)

En présence de thiol ou d’amine, les S-nitrosothiols peuvent transférer le groupe NO par transnitrosation. Ce mécanisme est favorisé à pH alcalin.

H+

RSH H+

RSNO + R'S– RS– + R'SNO

R'SH

Le nitroprussiate de sodium (SNP, pentacyanonitrosylferrate(II) de sodium) est un complexe inorganique utilisé pour réduire la pression artérielle (Feelisch 1996). Le mécanisme de libération de NO est largement méconnu, mais requiert une irradiation lumineuse ou l’action d’un réducteur .

Fe NO CN NC CN CN NC 2-, 2 Na+ nitroprussiate de sodium (SNP)

Les diazéniumdiolates (ou NONOates ou sels de Drago) qui possèdent la fonction [N(O)NO]– sont stables sous forme solide et se décomposent spontanément en solution pour donner jusqu’à deux équivalents de NO par mole de composé de départ (Keefer 1996). La cinétique de libération de NO est d’ordre 1 par rapport au NONOate ; elle n’est pas influencée par la présence de thiols ou d’ions métalliques. Les demi-vies à pH physiologique et à 37°C s’étalent entre 2 s et plusieurs jours selon le composé choisi. La vitesse de décomposition diminue considérablement à pH alcalin, ce qui permet de préparer des solutions mères stables. La libération de NO s’accompagne de la libération de l’amine secondaire correspondante, voire de traces de N-nitrosamine.

N N O N O DEA/NO H₃N N N O N O PAPA/NO

Figure 4 : Structure de deux diazéniumdiolates utilisés dans ce travail.

Le SIN-1 (ou 3-morpholinosydnonimine) est le métabolite de la molsidomine, une pro-drogue utilisée dans le traitement des maladies cardiovasculaires. C’est un composé sensible à la lumière, il libère alors NO. Il se décompose aussi spontanément en milieu neutre oxygéné selon un mécanisme en plusieurs étapes, pour donner à la fois NO et O2•–

(voir Figure 5, (Wahl 2004)). Dans ces conditions il peut théoriquement y avoir formation de peroxynitrite. Il faut noter que d’autres oxydants que O2 peuvent réaliser l’étape

d’oxydation aboutissant à la libération de NO, le taux d’O2•– n’est donc pas forcément égal

à celui de NO et la formation de peroxynitrite est variable. Le SIN-1 est couramment utilisé en présence de superoxyde dismutase pour piéger O2•–.

N O N N O N H .HCl N O N N O N H N O N N O N C O O CH₃ SIN-1 N O N N O C N N O N N O C N N O N C N N O N N O N H O₂ NO O₂ Cu2+ _Cu+ HO _SIN-1A N O N C N SIN-1C - H+ Molsidomine Estérase (Foie) 20 min SIN-1

Figure 5 : Formule et décomposition du SIN-1; métabolisation de la molsidomine (Wahl 2004).

1.d. Réactivité du NO

La réactivité de NO a fait l’objet de revues (Koppenol 1998a). NO est peu réactif vis-à-vis des molécules organiques. Il n’a pas de propriétés acido-basiques particulières. Ce n’est ni un oxydant fort ni un réducteur fort. D’après la valeur du potentiel d’oxydoréduction associé au couple formé par le cation nitrosyle et le monoxyde d’azote, E’°[NO+,•NO] = 1,21 V (1 m •NO), il est clair que NO+ ne peut pas se former in vivo car il n’existe pas d’oxydant biologique suffisamment fort pour oxyder NO. La réduction à un électron de NO est au contraire possible d’après les potentiels des couples redox, E’°[•NO,3NO–] = 0,39 V et E’°[•NO,1NO–] = - 0,35 V à pH 7 et 37°C (1 m •NO).

NO se fixe sur les ions métalliques (Fe(II), Zn(II), centres Fe-S…) pour donner des adduits métal-NO. Cette réaction de nitrosylation régule l’activité de plusieurs hémoprotéines ou autres métalloprotéines.

NO réagit aussi rapidement avec les radicaux. Deux exemples importants sont la réaction avec 3O2 (diradical) qui conduit à la formation de nitrite (voir page 21), et la

aussi comme agent de terminaison des réactions en chaînes de peroxydation lipidique, et exerce ainsi une action antioxydante (Hiramoto 2003).

Sa réactivité avec les molécules organiques a rarement été citée. À haute pression et en milieu non aqueux, la réaction de NO avec les nucléophiles donne des adduits avec la fonction [N(O)NO]– (diazéniumdiolates à partir d’amidures) (Keefer 1996). La formation de 3-nitrosoindoles et de 3,3’-azo-bis-indoles par réaction de NO sur les indoles 1,2-disubstitués a été récemment décrite dans le dichlorométhane et en anaérobie avec un intermédiaire de type diazéniumdiolate (Astolfi 2003).

2.

Dérivés oxydés ONOO

,

NO

, N

O

, NO

La stoechiométrie de la réaction de NO avec le dioxygène en phase aqueuse est donnée par l’équation suivante :

4 •_{NO aq + O} 2 aq + 6 H2O ⎯ → ⎯ 4 •_NO 2 – aq + 4 H₃O+ _{aq (6)}

Le produit de la réaction est l’ion nitrite [dioxidonitrate(1-)]. La loi de vitesse associée à cette réaction a été confirmée en 1993 comme étant d’ordre 2 par rapport à NO et d’ordre 1 par rapport à O2.

−1 4 d[•NO] dt = d[NO2–] dt = kaq[ • NO]2[O₂] avec kaq = 6±1,5×10-2 M-2.s-1 à 22°C (Wink 1993).

La réaction de NO avec le dioxygène est relativement lente aux concentrations physiologiques auxquelles NO exerce ses fonctions de messager, par contre dans les conditions pathologiques où la production de NO est accrue, cette réaction peut devenir plus importante. Elle est également accélérée dans les tissus où la concentration d’oxygène est élevée (poumons) et dans les compartiments hydrophobes.

Le mécanisme de cette réaction est complexe avec formation d’intermédiaires ONOO•, •NO2 et N2O3 (Goldstein 1995a) :

•_{NO + O}

2 ONOO

• ₍₇₎

ONOO• + •NO ⎯ → ⎯ ONOONO (ou N2O4) (8)

ONOONO 2 •_NO 2 (9) • NO₂+ •NO k1 0 k_-10 N2O3 ( k10 = 1,1×10 9 M-1.s-1; k_-10= 8,1×104 s-1) (10) N₂O₃ + 3 H₂O ⎯ → ⎯ 2 NO₂– + 2 H₃O+ (11)

La dernière étape correspond à la nitrosation de l’eau par N2O3, anhydride nitreux.

Les réactions de NO en milieu aérobie, nitrosation des thiols, des amines ou de la 2,3-diaminofluorescéine (DAF) sont généralement expliquées par la formation de N2O3

(Wink 1998). Cependant, on peut aussi incriminer ONOO• ou N2O4 qui peuvent être

nitrosants.

La réactivité du radical nitrosoperoxyle ONOO•, ou oxidodioxidonitrogen(•), est très peu décrite dans la littérature (hormis la réaction avec NO). Deux publications le font intervenir dans les réactions de nitrosation des phénols (Uppu 1998) et de la mélatonine (Blanchard 2000) par le peroxynitrite.

Le dioxyde d’azote •NO2 est une espèce dont l’importance en biologie est de plus

en plus reconnue (Augusto 2002 ; Kirsch 2002b). L’auto-oxydation de NO en conditions aérobies est l’une des sources de ce radical dans l’organisme. Les systèmes de Fenton (Fe(II) ou Cu(I) + H2O2) produisent des radicaux hydroxyle qui peuvent oxyder le nitrite,

produit d’une façon endogène par la flore microbienne saprophyte ou apporté par l’alimentation, en •NO2. NO2– peut être aussi oxydé par des réactions catalysées par la

superoxyde dismutase à cuivre et zinc (Singh 1998) et les enzymes peroxydases en présence de H2O2 (van der Vliet 1997 ; Eiserich 1998 ; Ricoux 2001). Il existe de

nombreux types de peroxydases et on suppose que presque toutes les hémoprotéines (cytochromes P450, catalase, methémoglobine…) peuvent présenter une activité peroxydase plus ou moins importante selon la structure de l’enzyme. Ces hémoprotéines utilisent classiquement le peroxyde d’hydrogène comme substrat pour oxyder des molécules organiques. Lors du cycle catalytique, l’enzyme qui possède un ion fer ferrique PFe(III) au repos, passe sous forme de composé I, P•+Fe(IV)=O, puis de composé II, PFe(IV)=O. Le mécanisme le plus communément admis pour l’oxydation du nitrite par la myeloperoxydase ou la horseradish peroxydase est donné dans la Figure 6, cependant une étude récente a mis en évidence un mécanisme alternatif qui ne génère pas de radicaux

•

NO2 pour la lactoperoxydase (Monzani 2004). La réaction d’oxydation du nitrite catalysée

par les peroxydases en présence de peroxyde d’hydrogène ne devient un mécanisme de formation non négligeable que dans les compartiments contenant une activité peroxydasique et où la production d’espèces réactives dérivées de l’oxygène et de l’azote est accrue, par exemple dans les tissus inflammés envahis par les cellules immunitaires réactives (neutrophiles, éosinophiles ou monocytes).

PFe(III) P•+Fe(IV)=O (Composé I) PFe(IV)=O (Composé II) H2O2 H2O •_NO 2 •_NO 2 NO2– + H₂O + 2 H+ NO₂–

Figure 6 : Cycle catalytique de la production de dioxyde d’azote par le système peroxydase et peroxyde d’hydrogène.

On verra plus loin que le radical •NO2 se forme aussi lors de la décomposition du

peroxynitrite (page 24).

La solubilité du radical •NO2 dans l’eau est très réduite, il est en équilibre avec

10 % de son dimère tétroxyde de diazote (N2O4) pour des concentrations physiologiques

inférieures à 1 µM. N2O4 se décompose rapidement en nitrite et nitrate dans l’eau selon la

réaction 12 (k12 = 1×103 s-1). N2O4 + 3 H2O ⎯ → ⎯ NO2 – + NO3 – + 2 H3O + (12)

Le radical neutre •NO2 est susceptible de se concentrer dans les environnements

moins polaires comme les membranes cellulaires et les domaines hydrophobes des protéines où il pourrait réagit par différents mécanismes (Augusto 2002 ; Kirsch 2002b).

Il réalise des abstractions d’atome d’hydrogène en position allylique sur des acides gras insaturés et peut initier de cette façon la peroxydation lipidique.

•

NO₂ + – CH = CH – CH₂ – ⎯ → ⎯ HONO + – HC = CH – CH•– – HC = CH – CH•– + O₂ ⎯ → ⎯ – HC = CH – CHOO•–

En compétition avec l’abstraction d’hydrogène, l’addition réversible de •NO2 sur les

doubles liaisons des molécules organiques est un phénomène qui a sans doute une moindre importance biologique car c’est un processus réversible contrairement au précédent et les concentrations physiologiques de •NO2, •NO et O2 sont le plus souvent trop faibles pour

déplacer l’équilibre vers la droite.

•NO2 + – CH = CH – CH2 – ← → ⎯ – (NO2)HC – CH •

– CH2– –(NO₂)HC – CH•– CH₂– + •NO₂ ⎯ → ⎯ – (NO₂)HC – CH(NO₂) – CH₂–

+ •NO ⎯ → ⎯ – (NO₂)HC – CH(NO) – CH₂ – + O₂ ⎯ → ⎯ – (NO₂)HC – CH(OO•) – CH₂–

Le dioxyde d’azote est un oxydant modéré (E’°[•NO2/NO2–] = + 0,99). L’oxydation

à un électron d’une biomolécule conduit généralement à une modification de sa structure et/ou une altération de sa fonction, mais peut aussi initier une réaction d’oxydation en chaîne si le radical initial réagit avec O2 pour former un radical peroxyle.

Un dernier mode d’action du dioxyde d’azote est bien sûr la recombinaison radicalaire (dont quelques exemples ont déjà été évoqués précédemment). La vitesse de réaction est généralement contrôlée par la diffusion (108-109 M-1.s-1). Etant donné que l’électron célibataire est délocalisé à 53 % sur l’atome d’azote et à 23,5 % sur chacun des deux atomes d’oxygène, la réaction peut conduire soit à un composé nitré (R-NO2), soit à

un nitrite organique (R-ONO). La proportion des deux produits dépend du substrat, mais les produits de nitration sont privilégiés dans beaucoup d’exemples étudiés. La formation de 3-nitrotyrosine peut avoir lieu par recombinaison du radical tyrosyle avec le radical

•

NO2, après l’oxydation préalable du résidu tyrosine soit par •NO2 soit par une activité

peroxydasique.

Tyr• + •NO2 ⎯ → ⎯ Tyr – NO2

3.

Peroxynitrite (ONOO

/ONOOH)

3.a. Caractéristiques physicochimiques et implications

biologiques

Le monoxyde d’azote réagit très rapidement avec l’anion superoxyde pour former l’anion peroxynitrite ONOO–. La constante de vitesse moyenne est de 1010 M-1.s-1, proche

de la vitesse limite de diffusion (Huie 1993 ; Goldstein 1995b ; Kissner 1997). C’est au début des années 1990 que l’on a suggéré la présence de peroxynitrite in vivo. Il est intéressant de remarquer que la réaction d’O2•– avec NO est plus rapide que sa dégradation

par la superoxyde dismutase (kSOD = 6,4×109 M-1.s-1 pour la SOD à cuivre et zinc, et un

ordre de grandeur inférieur pour les SOD à manganèse et à fer (Gray 1992)). Etant donné que les deux précurseurs du peroxynitrite ont des durées de vie limitées, la formation biologique du peroxynitrite requière la production simultanée de ces deux espèces. Plusieurs types cellulaires comme les macrophages, les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales qui produisent et libèrent simultanément NO et O2•– pourraient former du

peroxynitrite (Ischiropoulos 1998 ; Wink 1998). Contrairement à NO qui est diffusible et a une durée de vie de quelques secondes, O2•– qui est anionique à pH physiologique

(pKa = 4,8) avec une demi-vie inférieure à la milliseconde, diffuse très peu loin de son site de production; en conséquence, le peroxynitrite se forme préférentiellement à proximité des sources d’anion superoxyde.

Le terme peroxynitrite désigne couramment l’ensemble de plusieurs formes en équilibre :

L’anion peroxynitrite, ou oxidoperoxidonitrate(1-), ONOO– est équilibre acido-basique avec l’acide peroxynitreux ou pernitreux (ou hydrogen oxidoperoxidonitrate) ONOOH dans les milieux biologiques, le rapport des deux espèces dépendant du pH local. Le pKa du couple [ONOOH/ONOO–] est voisin de 6,8 (Kissner 1997). L’anion est relativement stable tandis que la forme acide subit une coupure homolytique pour donner

•

OH et •NO2 avec une constante de réaction de 0,9 s-1 à pH 7,4 et 37°C (Beckman J. S.

1990 ; Augusto 1994 ; Merenyi 1998). 70 % des radicaux se recombinent et s’isomérisent en nitrate dans la cage du solvant, tandis que les 30 % restant parviennent à s’échapper de la cage pour réagir par ailleurs. Le peroxynitrite peut ensuite diffuser à travers les membranes selon différents processus selon sa forme. La forme neutre du peroxynitrite (ONOOH) peut diffuser de façon passive à travers les membranes mais avec un libre parcours moyen réduit par rapport à celui de NO en raison de sa plus grande instabilité (Marla 1997). La diffusion de la forme anionique ONOO– est dépendante de canaux ioniques transporteurs d’anions (Denicola 1998).

En présence de dioxyde de carbone dissout, une nouvelle forme apparaît : l’adduit nitrosoperoxydocarboxylate (ou 1-carboxylato-2-nitrosodioxidane) ONO2CO2– (Lymar

Sergei V. 1995). (Il n’y a pas de réaction entre le peroxynitrite et les autres formes du

aqueux] sont respectivement 10,25 et 6,37.) La réaction d’addition de ONOO– sur CO2 est

rapide (k = 3,0.104 M-1.s-1 (Lymar S. V. 1996)). In vivo, parce que les fluides biologiques sont riches en bicarbonate (25 mM dans le plasma sanguin), l’essentiel du peroxynitrite est piégé par le CO2. L’adduit se décompose rapidement (k = 33 s-1 à pH 7,5 et 25°C, demi-vie

inférieure à 1 µs) par coupure homolytique en radicaux •NO2 et CO3• (Goldstein 1997 ;

Lymar S. V. 1998 ; Bonini 1999). 65 % des radicaux se recombinent avec isomérisation en nitrate et régénération du dioxyde de carbone, tandis que 35 % s’échappent de la cage du solvant.

Le peroxynitrite est plus réactif en chimie organique que ses précurseurs NO et O2•–. Il réalise des réactions d’oxydation soit directement à un ou deux électrons

(E’°[•NO2,–OH / ONOOH] = 1,6 V, E’°[ONOO–,2H+ / NO2•,H2O] = 1,6-1,7 V et

E’°[ONOO–,2H+ / NO2–,H2O] = 1,3-1,37 V, (Merenyi 1997 ; Koppenol 1998a ; Koppenol

1998b)), soit par l’intermédiaire des radicaux secondaires •NO2, CO3•– et •OH. •NO2 est

nitrant et faiblement oxydant (voir page 21), CO3•– est un oxydant fort (E’° > 1 V) et •OH

est un oxydant encore plus fort (E’° = + 1,9 V), mais très peu sélectif car ses réactions sont très rapides. La forme anionique du peroxynitrite peut-être oxydée en radical ONOO• (Kissner 1997), qui est nitrosant et faiblement oxydant (E’°[ONOO•/ONOO–] = 0,40 V (Koppenol 1992)). Les réactions des radicaux issus du peroxynitrite donnent essentiellement du nitrite et non plus du nitrate à côté des dérivés oxydés et nitrés.

Les principes présentés plus haut sur la réactivité du peroxynitrite gouvernent ses interactions avec les molécules biologiques. Le devenir du peroxynitrite in vivo est déterminé essentiellement par les cinétiques de ces réactions (Alvarez B. 2003a). Les réactions les plus rapides du peroxynitrite ont lieu avec les centres métalliques à fer, manganèse ou cuivre héminiques ou non. L’interaction avec ces ions métalliques est de type acide-base de Lewis et l’adduit libère le radical •NO2 ainsi qu’un composé métal-oxo.

Ces espèces très réactives peuvent conduirent à l’inactivation des enzymes impliquée (mécanisme de l’inactivation de la superoxyde dismutase à manganèse par nitration d’un résidu tyrosine proche du site actif (Quijano 2001)). Une autre issue est la réaction du composé métal-oxo avec le dioxyde d’azote et l’isomérisation du peroxynitrite en nitrate (mécanisme d’élimination principal du peroxynitrite dans le sang par réaction avec l’oxyhémoglobine). Les composés biologiques les plus sensibles à l’oxydation directe par le peroxynitrite sont les thiols (glutathion, résidus cystéine et méthionine), les composés contenant du sélénium et les composés aromatiques (tryptophane, tyrosine, phénylalanine et histidine, guanine...) selon leur potentiels d’oxydoréduction. Sinon l’ensemble de la

réactivité du peroxynitrite passe par les radicaux issus de la coupure homolytique de ONOOH ou de l’adduit avec le CO2.

3.b. Mise en évidence du peroxynitrite in vivo

La détection du peroxynitrite dans les systèmes biologiques est un enjeu majeur qui se heurte à de multiples difficultés (Radi 2001). En effet, la nature fugace du peroxynitrite empêche tout isolement et rend difficile sa détection directe (bien que récemment des électrophysiologistes aient annoncé y être parvenus (Amatore 2001)). Il est essentiel de distinguer les effets biologiques du peroxynitrite de ceux de ses précurseurs NO et O2•–, et

de ceux des autres espèces réactives dérivées de l’azote. Les situations où est invoqué un rôle du peroxynitrite correspondent à l’activation ou l’induction simultanée des enzymes de la biosynthèse de NO et de O2•–.

Une stratégie consiste à élaborer des molécules capables de piéger efficacement et de façon suffisamment spécifique le peroxynitrite avant qu’il ne réagisse avec ses cibles endogènes (par exemple : urate, porphyrine à manganèse).

Alternativement, des marqueurs endogènes ont été proposés, plus ou moins spécifiques du peroxynitrite. L’un d’eux est la nitration en position 3 du résidu tyrosine des protéines. La détection se fait par immunohistochimie avec un anticorps dirigé contre la 3-nitrotyrosine ou par l’analyse par spectrométrie de masse des peptides obtenus après digestion protéolytique. Le cas de la 3-nitrotyrosine est un exemple intéressant à discuter. En effet, cette transformation a longtemps été considérée comme l’empreinte spécifique du peroxynitrite dans la cellule car NO seul n’est pas capable de réaliser des nitrations et que la formation de 3-nitrotyrosine a été détectée in vitro après l’exposition à du peroxynitrite (Ischiropoulos 1992a ; Ischiropoulos 1992b). Par la suite, des études ont démontré que les faibles concentrations de peroxynitrite engendrées par des flux simultanés de NO et O2•–

nitrent moins efficacement la tyrosine que le peroxynitrite authentique et conduisent plutôt au dimère dityrosine (Pfeiffer 1998 ; Pfeiffer 2000). Des mécanismes alternatifs de nitration biologique ont été mis en évidence : celui impliquant le système nitrite-H2O2

-peroxydase (Pfeiffer 2001 ; Espey 2002) et les réactions du radical •NO2 issu de

l’auto-oxydation de NO en milieu aérobie. Ces mécanismes sont malgré tout soumis à des contraintes bien particulières. Le premier requiert la présence de la peroxydase et semble donc restreint aux situations d’inflammation et aux tissus où interviennent les cellules immunitaires (neutrophiles, éosinophiles, monocytes activés). Récemment il a été suggéré que pour la lactoperoxydase ou pour des concentrations de nitrite élevées, l’espèce nitrante

n’est pas •NO2, mais une forme de l’enzyme complexée par du peroxynitrite (Monzani

2004). La nitration de la tyrosine par •NO2 issu de NO a sans doute une importance

biologique assez limitée du fait de la lenteur de la réaction d’oxydation de NO pour les gammes de concentrations physiologiques de dioxygène, d’autant plus que la réaction directe du radical •NO2 avec la tyrosine est bien plus lente que l’oxydation des thiols par •

NO2. Même lorsque la formation de 3-nitrotyrosine peut être reliée à la production de

peroxynitrite, il est difficile d’affirmer avec certitude que le niveau de nitration des résidus tyrosines des protéines reflète exactement la quantité de peroxynitrite produite par la cellule car il dépend aussi des mécanismes d’élimination et de réparation des protéines nitrées in vivo qui ne sont pas élucidés. Plus généralement se pose la question de la stabilité de la nitration opérée par le peroxynitrite in vivo.

Pour toutes les raisons évoquées ici, il est très difficile d’avancer une valeur pour la concentration physiologique du peroxynitrite. Cette valeur varie sans doute beaucoup selon le compartiment, la cellule, le tissu considéré. Dans la littérature, une concentration stationnaire intramitochondriale de 0,6 à 2,2 nM de peroxynitrite est proposée, mais cette grandeur est calculée à partir des flux de NO et de O2•– et non pas mesurée

expérimentalement (Alvarez S. 2003b).

4.

Nitroxyle

Une abondante littérature décrit les propriétés chimiques et les effets biologiques des espèces oxydées dérivées de NO, mais peu d’études se consacrent, à l’anion nitroxyle NO–, le dérivé réduit à un électron de NO. En particulier, sa réactivité vis-à-vis des molécules organiques est largement inconnue pour l’instant. Plusieurs raisons expliquent le faible intérêt de la communauté scientifique pour cette espèce. Une erreur importante sur la mesure du potentiel d’oxydoréduction du couple •NO/NO–, a longtemps entretenu l’idée que le nitroxyle n’avait aucune existence physiologique. Aujourd’hui, les caractéristiques physicochimiques du nitroxyle ont été réévaluées et de nombreux résultats témoignent en faveur de sa formation potentielle in vivo. Cependant, le nitroxyle est une espèce particulièrement instable et difficile à détecter, ce qui ne facilite par l’étude de sa réactivité.

4.a. Formation, existence in vivo

A pH physiologique, la forme prédominante du nitroxyle est la forme protonée HNO dans un état fondamental singulet. En effet, HNO est un acide plus faible que ne le laissaient croire les premières estimations du pKa du couple 1HNO/3NO–. Il est désormais

admis que la valeur du pKa est voisine de 11,4-11,6 (Bartberger 2002 ; Shafirovich 2002), et que la réaction de déprotonation a lieu moyennant le franchissement d’une barrière d’activation très élevée à cause de l’interdiction de spin associée à cette réaction (Shafirovich 2003). Le pKa du couple 1HNO/1NO– vaut environ 23 (Shafirovich 2002).

Le potentiel d’oxydoréduction du couple •NO/3NO– est de l’ordre de – 0,8 V à 1 M de NO (Bartberger 2002). La réduction de •NO en nitroxyle peut être effectuée par la superoxyde dismutase (Murphy M. E. 1991), par le ferrocytochrome c (Sharpe 1998), et probablement par l’ensemble des ferrohémoprotéines. Plus récemment, il a été montré que la xanthine oxydase convertit NO en HNO en présence de son substrat l’hypoxanthine et en conditions anaérobies (Saleem 2004). Ce mécanisme pourrait contribuer aux dommages du stress oxydant lors de l’ischémie-reperfusion étant donné que la NO-synthase et la xanthine oxydase sont alors simultanément activées et induites. La réduction de NO pourrait également être opérée par des systèmes redox de type quinone/hydroquinone (catécholamines, flavonoïdes, ubiquinol...) d’une façon similaire à la réduction du dioxygène en O2•– (Poderoso 1999). Des études suggèrent que le nitroxyle produit par cette

voie serait l’un des agents responsable des ruptures de brins d’ADN provoqués par NO en présence de catéchols (Ohshima 1998).

Des mécanismes de formation du nitroxyle indépendants de NO ont également été mis en évidence dans des conditions physiologiques. On peut citer par exemple l’oxydation des N -hydroxyguanidines (Fukuto 1992b ; Cho 2003) et la réaction entre thiols et nitrosothiols (Wong 1998).

Plusieurs systèmes chimiques de production de nitroxyle sont connus et peuvent servir pour l’étude des propriétés physiologiques de cette espèce. Le sel d’Angeli (ou trioxodinitrate de sodium, Na2N2O3) est la source de nitroxyle la plus communément

utilisée dans la littérature. D’autres systèmes existent cependant comme les

N-hydroxybenzenesulfonamides (en particulier l’acide de Piloty (Fukuto 1992a)), et la

réaction d’oxydation du cyanamide par la catalase en présence de peroxyde d’hydrogène (Nagasawa 1990).

4.b. Effets physiologiques

Les effets biologiques du nitroxyle administré de façon exogène varient selon le type de cellule ou le tissu étudié. Le sel d’Angeli a un effet cytotoxique sur des cultures de neurones dopaminergiques (Vaananen 2003) et un effet cytotoxique synergique est observé

(Chazotte-Aubert 1999). Ces effets passent par l’oxydation des thiols dans le premier cas, et par l’oxydation de l’ADN dans l’autre (Ohshima 1999). Quelques résultats indiquent que le nitroxyle pourrait jouer un rôle en tant que régulateur de la fonction de diverses protéines (induction de l’hème oxygénase 1 (Naughton 2002), régulation du récepteur à l’acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA) (Colton 2001), inhibition de l’aldéhyde déhydrogénase (DeMaster 1998)). Un effet inotropique positif protecteur (augmentation de la contractilité du myocarde) a été relevé à plusieurs reprises dans le cœur défaillant (Feelisch 2003 ; Pagliaro 2003 ; Paolocci 2003). Dans tous les cas, l’effet du nitroxyle est clairement distinct de celui du monoxyde d’azote.

4.c. Caractéristiques de la réactivité du sel d’Angeli

N N O O O N N O O O .2 Na

Le sel d’Angeli (ou trioxodinitrate de sodium, Na2N2O3) se décompose en solution

aqueuse pour donner différents oxydes d’azote selon les conditions. La nature des produits et la valeur de la constante de vitesse de la réaction de décomposition dépendent grandement du pH de la solution. Dans la gamme de pH comprise entre 4 et 8, HNO et NO2– sont libérés (réaction 13 ; on détecte en réalité le produit de dimérisation et de

déshydratation de HNO, N2O), tandis que NO est produit à un pH inférieur à 4 (réaction

14). Le sel d’Angeli est stable en solution très basique (pH > 10). La vitesse de décomposition est indépendante du pH sur l’intervalle 4 à 8 mais augmente très fortement en dessous de 4. N N O O O H 1_{HNO + NO} 2– (13) N2O3 2– + 2 H+ ⎯ → ⎯ 2 NO + H2O (14)

Les pKa du sel d’Angeli mesurés expérimentalement varient un peu avec la force ionique I : 2,51 et 9,7 par extrapolation à I = 0 M (Sturrock 1963), > 3 et 9,35 pour I = 0,25 M (Hughes 1976).

Les arguments en faveur du mécanisme de décomposition à pH physiologique ont été largement discutés avant d’aboutir à un consensus sur l’équation 13 (Bonner 1988). La cinétique de décomposition du sel d’Angeli est ralentie par l’ajout de nitrite, ce qui indique

que cette étape est réversible. Des expériences de marquage isotopique à l’azote-15 ont permis de montrer que l’azote du nitrite formé par la réaction 13 est celui qui porte deux atomes d’oxygène dans le sel d’Angeli et que la décomposition à pH neutre passe par la protonation sur l’azote lié à un seul atome d’oxygène et par la rupture de la liaison N-N. Récemment, une étude théorique détaillée du mécanisme est venue corroborer les observations expérimentales (Dutton 2004).

HNO se dimérise spontanément en H2N2O2, avec déshydratation et libération de

N2O (k15≈ 8×106 M-1.s-1). La formation d’oxyde de diazote est de ce fait souvent

considérée comme une preuve indirecte de la formation de HNO. 1

HNO + 1HNO _{⎯ →} k_{⎯ ⎯ H}15

2N2O2 ⎯ → ⎯ N2O + H2O (15)

Alors que le potentiel d’oxydoréduction de HNO est relativement bas, la réactivité du sel d’Angeli en présence de dioxygène est plutôt marquée par des réactions d’oxydation. De plus, on observe la formation de nitrate en plus du nitrite et de N2O à

partir du sel d’Angeli lorsque la décomposition a lieu en présence de dioxygène (Kirsch 2002a). Ces éléments indiquent qu’un intermédiaire réactif oxydant est formé par la réaction des produits de décomposition du sel d’Angeli avec le dioxygène.

La stoechiométrie de la réaction du sel d’Angeli avec O2 est équimolaire ou

inférieure selon les conditions réactionnelles (Miranda 2001 ; Kirsch 2002a). Le sel d’Angeli ne réagit pas directement avec O2 car sa vitesse de décomposition est

indépendante de la concentration en dioxygène (Liochev 2003). La consommation de dioxygène est donc due à 1HNO. Une compétition entre la réaction avec le dioxygène et la dimérisation de 1HNO, dont la constante de réaction est assez élevée, peut expliquer les différences de stoechiométrie observées.

1

HNO + 3O_{2 ⎯ →} k_{⎯ ⎯ " HNOOO"}16 ₍₁₆₎

Le produit de cette réaction n’a pas été identifié pour l’instant. Il s’agit d’un isomère de l’acide peroxynitreux ONOOH. Une isomérisation de cette espèce en ions nitrate pourrait expliquer leur apparition parmi les produits de décomposition du sel d’Angeli en conditions aérobies.

Dans des conditions particulières de décomposition du sel d’Angeli en présence de dioxygène (soit spontanée à pH > 12 (Kirsch 2002a), soit sous irradiation UV à pH neutre ou > 12 (Shafirovich 2002)), la formation de peroxynitrite a été mise en évidence par spectrophotométrie (bande à 302 nm caractéristique de l’anion ONOO–). La durée de vie

de l’espèce est cohérente avec celle du peroxynitrite et elle peut même être piégée par du dioxyde de carbone dissout. Pour expliquer la formation de peroxynitrite dans ces conditions, les auteurs proposent que 3NO–, l’espèce prédominante issue de la décomposition du sel d’Angeli dans ces conditions particulières, réagisse avec 3O2 (k17 =

(2,7±0,2)×109 M-1.s-1 (Shafirovich 2002)). 3 NO– + 3O2 k₁₇ ⎯ → ⎯ ⎯ ONOO– (17)

Mais à pH 7,5 où la forme prédominante libérée par la décomposition spontanée du sel d’Angeli est 1HNO, on ne peut pas invoquer cette réaction. En effet la réaction de déprotonation de 1HNO en 3NO– est interdite de spin et possède une grande énergie d’activation (réaction 18). Sa constante de vitesse est estimée à k18≈ 5×104 M-1.s-1

(Shafirovich 2002 ; Liochev 2003 ; Shafirovich 2003). Comme [HO–] ≈ 2,5×10-7 -3,2×10-6 M à pH 7,5-8,5, la réaction 18 est considérée comme extrêmement lente.

1

HNO + HO– k18 3NO– + H2O (18)

D’autres propositions mécanistiques ont été avancées (réactions 19 et 20), mais la réaction 19 est interdite de spin et semble être empêchée cinétiquement même si elle est thermodynamiquement possible (Shafirovich 2002). Le transfert d’atome d’hydrogène (équation 20) qui pourrait aussi conduire à la formation de peroxynitrite via la recombinaison des deux radicaux monoxyde d’azote et perhydroxyle est également jugé négligeable devant la dimérisation de 1HNO :

1

HNO + 3O₂ ⎯ → ⎯ ONOOH (19) 1

HNO + 3O₂ ⎯ → ⎯ •NO + HO₂• (20)

Dans des conditions physiologiques, plusieurs équipes ont tenté de caractériser l’espèce réactive en comparant son profil de réactivité à celui du peroxynitrite, du SIN-1 ou de donneurs de NO. Les résultats diffèrent selon les auteurs et n’ont pas apporté de réponse décisive au débat. Ainsi il a été montré que le sel d’Angeli en présence de O2

hydroxyle l’acide benzoïque plus efficacement et nitrose mieux la 4,5-diaminofluorescéine que ne le fait le peroxynitrite, mais qu’il réalise moins facilement l’oxydation monoélectronique et la nitration de l’acide hydroxyphénylacétique. Selon les mêmes études, les deux espèces ont toutefois des rendements d’oxydation biélectronique de la dihydrorhodamine identiques et aucun des deux n’est capable de nitroser le 2,3-diaminonaphtalène (Miranda 2001 ; Miranda 2002). Des formes cycliques ont été