C. Étude de la 1-nitrosomélatonine
2. Étude pharmacologique
2.a. Mutagenèse et cytotoxicité
L’ensemble de ces tests a été développé par l’équipe du Dr. Manuel Blanco (Laboratorio de Toxicología Genética, Instituto de Investigaciones Citológicas, Fundación Valenciana de Investigaciones Biomédicas, Valencia, Espagne). Les tests de cytotoxicité et génotoxicité visent à obtenir, en plus de la caractérisation toxicologique des produits chimiques, une information sur leurs propriétés biologiques ayant un intérêt pharmacologique potentiel.
Test de mutagenèse
Le test bactérien de mutagenèse est destiné à examiner si la 1-nitrosomélatonine est capable d’induire des mutations spécifiques chez les différentes souches de Escherichia coli (voir Tableau 3).
Tableau 3 : Phénotype des différentes souches de Escherichia coli utilisées dans les tests
de mutagenèse et de cytotoxicité.
Souche ∀
Phénotype ∃ IC188 IC203 IC204 IC5282 IC2880
OxyR + – + + +
Pol V + + – + +
Pol RI (pKM101) + + – + –
Trp – – – + –
Les souches de E. coli sont dérivées deIC188 (ou WP2 uvrA trpE65/pKM101)
réparation des lésions de l’ADN par excision-resynthèse. Les lésions non éliminées de l’ADN donnent lieu à la réparation mutagène, ou réparation SOS, au cours de laquelle se produisent les mutations. IC188 héberge le plasmide pKM101 qui confère la résistance à l’antibiotique ampicilline et qui contient aussi deux gènes codant l’ADN polymérase Pol RI, impliquée dans le processus de réparation SOS. La souche IC203 est dérivée de IC188 dans laquelle a été introduite une délétion du gène oxyR (∆oxyR30). Le produit de ce
gène, la protéine OxyR, est un activateur de la transcription des gènes de certaines enzymes antioxydantes (catalase et alkyl hydroperoxyde réductase). Cette mutation rend la souche spécifiquement hypersensible à la mutagenèse d’origine oxydante. La souche IC204 exprime OxyR, mais est déficiente dans l’ADN polymérase Pol V, contrairement à IC188 et IC203. La polymérase PolV, comme la polymérase Pol RI, participe au mécanisme de réparation mutagène SOS. Ces deux enzymes prennent le relais de la polymérase Pol III, qui assure normalement la réplication de l’ADN chez E. coli et reste
bloquée lorsqu’apparaissent des lésions de type site abasique résultant d’une perte de base nucléique. Elles incorporent alors une adénine en face du site abasique. Toutes les souches contiennent la mutation ochre trpE65 (c’est-à-dire que le codon stop UAA est présent dans
l’un des gènes impliqués dans la voie de synthèse du tryptophane). Cette mutation trp– empêche la croissance des cellules dans un milieu sans tryptophane. Une mutation spontanée ou induite par un composé mutagène peut permettre à la souche de récupérer le phénotype Trp+ et de pousser sur un milieu dépourvu de tryptophane. La réversion peut être due à une mutation dans le gène cible trpE et entraîner un retour à la séquence initiale.
Plus souvent, il s’agit de mutations extragéniques suppressives qui ont lieu dans le gène d’un ARN de transfert (ARNt) et impliquent la mutation de l’anticodon de cet ARNt. Le nouvel ARNt insère un acide aminé en face du codon stop ochre UAA qui n’interrompt plus la synthèse protéique.
Le test de réversion a été réalisé dans des boîtes contenant un milieu minimal. Ce milieu autorise la croissance des mutants Trp+ seulement. Afin d’augmenter la sensibilité du test, une trace de tryptophane (0,5 mg/L) a été ajoutée qui permet la croissance de 2 à 3 générations de Trp– et rend possible l’apparition des mutants. On y a déposé une quantité constante d’une des souches-test, le composé potentiellement mutagène à la dilution voulue et de l’agar fondu. Après incubation pendant 48 heures à 37°C, le dénombrement des mutants Trp+ a été effectué ; ils apparaissent sous la forme de colonies sur un tapis cellulaire translucide. Chaque composé a été testé en double pour 5 à 6 doses et chaque résultat est exprimé comme la moyenne de 3 expériences indépendantes.
La 1-nitrosomélatonine a été diluée dans le DMSO à une concentration de 100 µM puis dans l’eau à 40 ou 10 µM juste avant d’être ajoutée aux cellules.
Culture de bactéries
Milieu minimal avec trace de tryptophane témoin + composé mutagène (dose 1) + composé mutagène (dose 2) + composé mutagène (dose 3)
Comptage des mutants Trp+
après 48 h à 37°C
Mutants spontanés
Figure 19 : Test de réversion de la mutation trp– sous l’effet d’un composé mutagène. Caractérisation des mutants réverses
Les mutants réverses Trp+ apparus dans le test précédent ont été caractérisés par leur aptitude à supprimer des mutations non-sens chez trois phages T4 différents : oc427, ps205 et NG273 (Urios 1996). Chacun des phages possède une mutation ochre spécifique qui empêche son développement dans la cellule hôte. S’il infecte une bactérie qui possède la mutation suppressive adéquate, il récupère la faculté de se développer et des plages de lyse apparaissent (voir Tableau 4 et Figure 20). Si la mutation est de type réversion vraie, aucun des phages ne se développe. Les phages oc427 détectent l’ensemble des mutants suppresseurs. Les phages NG273 détectent les mutations suppressives supC sur le gène de
l’ARNt de la tyrosine résultant d’une transversion GC→TA (une transversion est une mutation dans laquelle une base purique, A ou G, est remplacée par une base pyrimidique, C ou T, et vice-versa). Les phages ps205 détectent les mutations supB sur le gène de
l’ARNt de la glutamine résultant d’une transition GC→AT (une transition est une mutation dans laquelle une base purique ou pyrimidique est remplacée par une autre base de la même famille). Par différence, on calcule le nombre de mutations supG et supN sur le gène
Tableau 4 : Spectre de développement des phages selon le type de mutant infecté.
Phage trpE+ supB
GC→AT GCsupC→TA TAsupG/N→AT
oc427 – + + + ps205 – + – – NG273 – – + – Phage ps205 Phage NG273 Phage oc427 Plage de lyse ⇒ la mutation est de type supC
(transversion GC→TA) Pas de plage de lyse ⇒ la mutation n’est pas de type supB
(transition GC→AT) Plage de lyse
⇒ la mutation est de type suppressive Attaque du tapis bactérien par
les phages Ajout d’une suspension
de phages T4 à 0,3 mL de culture et étalement avec de la gélose fondue
Culture pendant 1 nuit
(1 mL de milieu riche)
Figure 20 : Caractérisation des mutants Trp+. Exemple d’un mutant suppresseur supC.
Test de cytotoxicité
La souche-test utilisée est la souche IC5282 (OxyR+), dérivée trp+ de IC188. Ces bactéries ont été mélangées à un grand nombre de cellules de la souche IC2880 trp– (non sujettes à la réversion et incapables de survivre sur le milieu dépourvu de tryptophane) afin d’obtenir des colonies bien distinctes et réparties sur la boîte. À un mélange de bactéries (contenant environ 800 cellules-test pour 3×107
cellules espaceuses), on a ajouté le composé potentiellement cytotoxique à la dilution voulue et de l’agar fondu. Lorsque cela est indiqué, du catéchol (CAT) avec ou sans ascorbate (ASC) a aussi été ajouté. L’ensemble a été versé sur un milieu de culture minimal sans tryptophane et incubé 24 heures à 37°C. Le pourcentage de survie a été calculé par la formule suivante :
% Survie = nombre de colonies par boîte
nombre de colonies par boîte à la dose zéro×100 Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne de 3 expériences.
2.b. Vasorelaxation et effet sur les paramètres cardiovasculaires
Effet vasorelaxant : collaboration avec le professeur Bernard Muller
Les expériences ont été menées par l’équipe du professeur Bernard Muller au Laboratoire de Pharmacologie et Physico-Chimie des Interactions Moléculaires et Cellulaires (Faculté de Pharmacie, Illkirch).
Des anneaux d’aortes de Rat Wistar sans endothélium fonctionnel ont été placés dans un milieu Krebs classique en présence de 95 % de dioxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Un dispositif expérimental a permis de mesurer le taux de contraction des tissus soumis à l’action de différentes substances ajoutées au milieu de culture.
L’effet de la 1-nitrosomélatonine a été comparé à celui de plusieurs donneurs de NO : S-nitrosocystéine (CysNO), S-nitrosoglutathion (GSNO), S-nitroso-N-acétyl-d,l-pénicillamine (SNAP), S-nitroso-N-acétylcystéine (SNAC), 3-morpholinosydnonimine
(SIN-1) + 100 unités/mL de superoxyde dismutase (SOD), DEA/NO et nitroprussiate de sodium (SNP). La mélatonine a été utilisée comme témoin.
Les aortes ont été pré-contractées par 10-7 M de noradrénaline (NA, ou norépinéphrine) ou de phényléphrine, puis la réponse à des concentrations croissantes de donneur de NO (10-9 à 10-6 M) a été enregistrée afin de déterminer la concentration (CE50) capable de réduire de moitié l’effet vasoconstricteur de la noradrénaline (ou de la phényléphrine). OH OH HO NH2 OH HO N H CH3 noradrénaline (NA) ou norépinéphrine phényléphrine
Le mode d’action des donneurs a été évalué en utilisant 1 µM d’ODQ
(1-H[1,2,4]oxadiazolo[4,3-α]quinoxalin-1-one), un inhibiteur sélectif irréversible de l’activation NO-dépendante de la guanylate cyclase qui se fixe sur le fer de l’hème. La fixation sur l’hème est compétitive avec NO. Le PTIO (2-phényl-4,4,5,5-tétraméthylimidazolin-1-oxyl 3-oxyde), un radical stable piégeur sélectif de •NO, a aussi été utilisé.
N N N O O N N O O ODQ PTIO
La capacité des différents donneurs de NO à former des réservoir stables de NO mobilisables par un traitement avec un thiol de faible masse moléculaire comme la
N-acétylcystéine (NAC) a été mise en évidence en utilisant le protocole suivant (voir
Figure 21). Les anneaux d’aortes ont été exposés pendant 30 min à un donneur de NO (1 µM), puis, après 60 min de lavages, contractés par la noradrénaline. Ensuite l’effet relaxant de la NAC a été évalué.
H N COOH SH H3C O N-acétylcystéine (NAC) donneur de NO (10-6 M) 30 min lavages 60 min NA NAC mesure de la contraction temps
Figure 21 : Chronologie des traitements appliqués aux anneaux d’aortes de Rat isolées pour évaluer la capacité de formation de réservoirs stables de NO mobilisables par la
N-acétylcystéine (NAC).
Enregistrement des paramètres systémiques de circulation sanguine et du débit sanguin cérébral local chez le Rat : collaboration avec Jean-Loup Corrèze et le professeur Philippe Meric
Ce travail a été réalisé en collaboration avec Jean-Loup Corrèze et le professeur Philippe Meric de l’Institut de Chimie des Substances Naturelles.
Préparation des solutions à injecter
Après plusieurs tentatives, nous avons retenu des injections intrapéritonéales de 0,25 mL de solution saline à 8 mM de 1-nitrosomélatonine contenant 10 % de Tween 80, µmol/kg). (Les Rats se sont révélés très
sensibles à la 1-nitrosomélatonine dans ces conditions et des doses plus élevées étaient létales.) Des injections de contrôle ont également été réalisées à partir de solvant ou de solution saline à 8 mM de mélatonine et à 10 % de Tween 80.
Pour la préparation des solutions de 1-nitrosomélatonine, 3 mg broyés finement ont été chauffés au bain-marie à 90°C dans 100 µL de Tween 80 pendant quelques minutes sous agitation jusqu’à dissolution complète. Nous avons ensuite ajouté 1 mL de solution aqueuse de chlorure de sodium (9 g/L) et homogénéisé. La solution finale a été dosée par spectrophotométrie avant son utilisation (concentration autour de 8 mM).
Protocole expérimental
Les Rats Wistar mâles (environ 300 g) ont été placés sous anesthésie volatile (mélange de O2, N2O et isoflurane) et leur température maintenue à 37°C pendant toute la durée de l’expérience (jusqu’à 2 heures). Une artère de la patte arrière a été cathétérisée pour permettre la mesure de la pression artérielle et le prélèvement de sang pour le dosage des gaz sanguins. Une fibre optique reliée à un laser infrarouge et destinée à la mesure des variations du débit sanguin cérébral local a été placée à la surface de l’os du crâne dénudé et aminci. Ce dispositif utilise l’effet Doppler pour mesurer la vitesse des hématies dans les capillaires du cortex cérébral ; l’amplitude du signal recueilli dépend fortement du positionnement de la sonde et seules ses variations ont un sens.
Après stabilisation des paramètres de mesure sous anesthésie, l’intégrité du tissu cérébral au-dessous de la sonde a été contrôlée en pratiquant un test d’hypercapnie artificielle transitoire, c’est-à-dire que l’on a ajouté du dioxyde de carbone au mélange gazeux respiré par le Rat. La réaction normale est une accélération de la ventilation et une augmentation du débit sanguin cérébral pour compenser la baisse de dioxygène, ce qui se traduit par une augmentation transitoire du signal mesuré par la fibre optique.
Nous avons attendu le retour aux conditions initiales et la stabilisation des paramètres mesurés avant de réaliser une injection intrapéritonéale de 1-nitrosomélatonine, de mélatonine ou de solvant. Plusieurs injections ont pu être pratiquées sur le même Rat, espacées de 30 à 40 minutes.
En fin d’expérience, les Rats ont été soumis à nouveau à un test d’hypercapnie puis ont été sacrifiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital.
2.c. Inhibition de l’acétylcholine estérase
La ciblothèque de l’Institut de Chimie des Substances Naturelles dispose d’un test d’inhibition de l’acétylcholine estérase (AChE) adapté au criblage haut débit de molécules issues de synthèse ou d’extraits de plantes. Nous avons décidé de l’appliquer à la 1-nitrosomélatonine.
La méthode utilisée dans ce test est la méthode colorimétrique d’Ellman (Ellman 1961). Le principe repose sur la mesure du produit d’hydrolyse de l’acétylthiocholine (ATCh ; analogue structural du substrat naturel) par l’AChE. La thiocholine convertit ensuite le réactif 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoate) (DTNB), de structure chimique R-S-S-R en acide 5-thio-2-nitrobenzoïque (jaune). La vitesse de la réaction est mesurée en suivant l'apparition et l'intensité de la coloration jaune. Dans les conditions utilisées, l'activité enzymatique est proportionnelle à la vitesse de la réaction. L’ajout de différentes substances au milieu réactionnel permet de mesurer leur effet inhibiteur par rapport à la référence. I N S H3C H3C H3C N S H3C H3C H3C CH3 O I COOH O2N S S COOH NO2 DTNB I N S H3C H3C H3C I N S H3C H3C H3C S COOH NO2 H3C O O COOH O2N S + H2O + + 2 H+ AChE ATCh + + jau ne Figure 22 : Principe du test d’Ellman pour mesurer l’activité de l’acétylcholine estérase.
Le test a été réalisé dans des microplaques à 96 puits. Dans un puits, nous avons ajouté successivement la 1-nitrosomélatonine dissoute dans le DMSO à différentes concentrations (5 µM à 1 mM), le réactif DTNB et l’enzyme dans le tampon phosphate à 0,1 M et pH 7,4 et enfin le substrat iodure d’acétylthiocholine. Nous avons enregistré l’absorption à 450 nm pendant 2 min.
2.d. Distribution de la 1-nitrosomélatonine dans les organes
chez la Souris
Dans ces expériences, nous avons utilisé des Souris femelles C57BL6 (20-22 g) provenant du Centre d’Élevage Janvier (Le Genest/Isle, France).
Étude préliminaire : Stabilité de la 1-nitrosomélatonine dans le plasma de Souris
Le sang d’une Souris a été recueilli dans un tube hépariné et centrifugé afin d’isoler le plasma. 95 µL de ce dernier ont été transférés dans un puits de microplaque et incubés à
37°C pendant 10 min. Nous avons ajouté 5 µ L d’une solution à 10 mM de
1-nitrosomélatonine dans le DMSO. L’absorption caractéristique de la 1-nitrosomélatonine a été enregistrée à 346 nm pendant une heure.
Distribution de la radioactivité après l’injection intrapéritonéale de
1-nitroso-[O-méthyl-3H]mélatonine
La mélatonine radiomarquée (1,25 mg) a été dissoute dans l’éthanol puis diluée 20 fois dans une solution saline contenant 9 g de chlorure de sodium pour un litre d’eau.
Les Souris ont reçu 800 µL de cette solution intrapéritonéalement, c’est-à-dire une dose de 5 mg/kg (19 µmol/kg). Les animaux ont été sacrifiés par rupture de la colonne vertébrale 5, 10, 15, 30 ou 60 minutes après l’injection (2 souris pour chaque temps considéré). Le sang a été collecté dans un tube hépariné immédiatement. Ensuite, la tête a été séparée du corps pour prélèvement simultané des organes et tissus (cerveau, cervelet, foie, rein, rate, partie d’intestin, poumon, coeur, morceau de muscle de la patte arrière).Les organes ont été pesés et 300 mg maximum de chaque tissu ont été transférés dans des fioles afin d’être solubilisés avec 3 mL de NCS-II tissue solubilizer (Amersham) pendant une nuit
à 40°C. Après dissolution complète, 17 mL de liquide de scintillation Aquasafe 500 Plus (Zinsser Analytic) ont été ajoutés et la radioactivité a été mesurée après 24 h pour s’affranchir de la chimiluminescence parasite due au mélange du NCS-II avec le liquide de
scintillation. Nous avons ensuite exprimé la radioactivité détectée dans les organes comme un pourcentage de la radioactivité totale injectée.
Étude RPE ex vivo avec le complexe (MGD)2-Fe2+ de la répartition de la
1-nitrosomélatonine après injection intrapéritonéale. Comparaison avec le S-nitrosoglutathion
Des Souris femelles C57BL6 ont reçu une injection intrapéritonéale de 1 mL de solution de 1-nitrosomélatonine, de GSNO ou de solution saline.
Les solutions à injecter ont été préparées de la façon suivante : 2,6 mg de 1-nitrosomélatonine ont été agités dans 0,3 mL de Tween 80 pendant plusieurs heures jusqu’à dissolution puis dilués avec 1 mL de solution aqueuse de chlorure de sodium (9 g/L). La concentration de 1-nitrosomélatonine a été mesurée par spectrophotométrie
(ε346 nm = 10 900 M-1.cm-1). Pour un animal de 20 g, une injection intrapéritonéale de 1 mL d’une solution contenant 2,5 ou 5 µmol correspond à une dose de 32 ou 65 mg/kg (122 ou 249 µmol/kg). Une solution de 0,3 mL de Tween 80 pour 1 mL de solution aqueuse de chlorure de sodium (9 g/L) a été utilisée pour la dissolution du GSNO et pour les injections témoins. Dans le cas du GSNO, nous avons injecté 5 ou 10 µmol, ce qui correspond à des doses de 84 ou 168 mg/kg (250 ou 500 µmol/kg).
Les Souris ont été anesthésiées 7 min après l’injection par 4,5 mg de pentobarbital de sodium (Sanofi) en injection intrapéritonéale. Le sang a ensuite été éliminé en perfusant la Souris avec une solution saline dans le but de se débarrasser du piégeur de NO naturel que constitue l’hémoglobine. Le foie et le cerveau ont été prélevés et pesés (environ 1 g pour le foie et 0,4 g pour le cerveau). A l’organe placé dans un tube de broyage rodé sous un flux d’argon, nous avons ajouté un volume de solution de complexe (MGD)2-Fe2+ à 10 mM équivalent à 20 % de la masse de l’organe (voir la méthode de préparation du complexe page 69). Puis nous avons ajouté un volume de tampon phosphate de sodium à 0,1 M et pH 7,5 déaéré équivalent à 80 % de la masse de l’organe. Nous avons immédiatement procédé à l’homogénéisation du tissu avec les solutions et le broyat a été transféré dans un tube RPE en quartz de 5 mm de diamètre. Après 30 min à température ambiante, nous avons congelé le tube dans l’azote liquide jusqu’à la mesure RPE.
Les spectres RPE ont été enregistrés avec le spectromètre RPE Magnettech avec les mêmes paramètres que pour l’étude RPE in vitro à 77 K (voir page 69). La hauteur pic à
pic des deux premières raies du spectre RPE a été utilisée pour quantifier le complexe formé par comparaison avec les expériences in vitro de calibration avec la