C. Étude de la 1-nitrosomélatonine
1. Étude de la libération de NO par résonance paramagnétique électronique
paramagnétique électronique (RPE) in vitro à l’aide d’un complexe de fer
et de dithiocarbamate
1.a. Principe
La résonance paramagnétique électronique (RPE) est une technique d’étude des espèces paramagnétiques (possédant des électrons non appariés). C’est une spectroscopie d’absorption. Un échantillon est placé dans une cavité résonante et soumis à une onde électromagnétique incidente (dans le domaine des micro-ondes). On effectue ensuite un balayage en champ magnétique pour lever la dégénérescence des niveaux énergétiques
électroniques de la substance étudiée. Lorsque l’écart entre les niveaux correspond à l’énergie de la micro-onde incidente, celle-ci est absorbée. Pour des raisons pratiques, le spectre obtenu est la dérivée de l’absorption.
Bien que le monoxyde d’azote soit une espèce paramagnétique stable, ses propriétés physiques empêchent sa détection directe par RPE en solution liquide ou gelée dans les conditions classiques. Des piégeurs de spin de plusieurs types ont été développés afin de rendre cette détection possible de façon indirecte en solution ou dans des cellules, des organes ou des animaux vivants. Parmi ceux-ci, les complexes de fer (II) et de dithiocarbamate sont très utilisés car ils forment sélectivement des adduits mononitrosylés stables. Nous avons choisi d’utiliser le complexe de fer (II) et de dithiocarbamate de
N-méthyl-D-glucamine (MGD) pour étudier la libération de NO par la 1-nitrosomélatonine
à température ambiante en comparaison avec d’autres donneurs connus (GSNO, SNAP). Ce complexe est hydrosoluble, contrairement à d’autres piégeurs de la même famille par exemple celui avec le diéthyldithiocarbamate.
S S OH HO OH HO OH FeI I NO S S HO OH HO OH HO
Figure 16 : Structure du complexe paramagnétique de fer (II) et de dithiocarbamate de
N-méthyl-D-glucamine (MGD) mononitrosylé.
Le bon déroulement des expériences utilisant le complexe de fer et de dithiocarbamate de N-méthyl-D-glucamine (MGD) dépend de l’état d’oxydation du fer.
Les propriétés magnétiques et spectroscopiques des complexes de fer et de MGD sont décrits par la Figure 17. Le fer (II) peut être oxydé en fer (III) par le dioxygène de l’air. Il est donc important de se placer dans des conditions anaérobies lors de la préparation et de l’utilisation du complexe si l’on veut obtenir des résultats fiables et quantitatifs. Cette technique permet de distinguer les donneurs de NO et NO–, c’est donc une méthode de choix pour confirmer que la 1-nitrosomélatonine libère du NO radicalaire au cours de sa décomposition (Vanin 2000 ; Xia 2000).
(MGD)2-Fe2+
(MGD)2-Fe3+ (MGD)2-Fe3 +-NO
(MGD)2-Fe2 +-NO Oxydant (O2) Oxydant (O2) + •NO + NO– incolore S=0, silencieux en RPE vert foncé S=1/2, visible en RPE g=2,04 aN=1,27 mT brun orangé S=5/3, visible en RPE g=4,3 jaune S=0, silencieux en RPE + •NO Réducteur (ASC) Réducteur (ASC ou (MGD)2-Fe2 +) (MGD)2-Fe2 + + NO2– H2O, –OH
Figure 17 : Etats d’oxydation, propriétés spectroscopiques et magnétiques de plusieurs complexes de fer et dithiocarbamate de N-méthyl-D-glucamine (MGD) (d’après Vanin
2000 et Xia 2000).
1.b. Étude à 298 K
Le dithiocarbamate de N-méthyl-D-glucamine (MGD) a été fourni par le
Laboratoire de Physiopathologie et de Pharmacologie Cardiovasculaires Expérimentales (Dijon). Il a été synthétisé à partir de N-méthyl-D-glucamine (Sigma) et de disulfure de
carbone (Sigma) (Shinobu 1984).
S S CH3 OH HO OH HO OH dithiocarbamate de N-méthyl-D-glucamine (MGD)
J’ai réalisé l’ensemble des expériences in vitro à 298 K au Laboratoire de
Physiopathologie et de Pharmacologie Cardiovasculaires Expérimentales dirigé par le professeur Luc Rochette à l’université de Bourgogne (Dijon). Le docteur Catherine Vergely m’a transmis son expérience de ce type de manipulation à l’occasion de deux courts séjours au mois de décembre 2000.
Nous avons utilisé un spectromètre RPE ESP 300E Bruker (Wissenbourg, France)
fonctionnant en bande X et équipé d’une cavité TM110. Nous avons retenu les paramètres suivants pour la détection du complexe (MGD)2-Fe2+-NO : intensité du champ magnétique
340±6,5 mT, puissance de la micro-onde 5 mW, fréquence de la micro-onde 9,73 GHz, amplitude de modulation 0,566 mT et fréquence de modulation 100 kHz.
Toutes les solutions ont été déoxygénées en faisant barboter du diazote. Peu avant chaque expérience, nous avons préparé une solution contenant 100 mM de MGD dans le tampon Tris à 50 mM et pH 7,4 et une solution contenant 20 mM de sulfate ferreux (FeSO4.7H2O, MM = 278, Sigma) dans l’eau. La solution de complexe de fer et de dithiocarbamate de N-méthyl-D-glucamine (MGD)2-Fe2+ à 10 mM a été obtenue extemporanément en mélangeant rapidement 0,5 mL de chacune de ces solutions dans un tube VacutainerTM (tube dans lequel règne un vide partiel et employé couramment pour les prises de sang). (Le MGD a été ajouté en large excès afin d’obtenir une complexation totale des ions Fe2+.) Aussitôt nous avons ajouté, sous forte agitation, 10 µL de solution de 1-nitrosomélatonine, de S-nitrosoglutathion (GSNO), de S-nitroso-N-acétyl-d,l-pénicillamine (SNAP), de nitrite ou de nitrate (10 µM à 1 mM dans le mélange final).
Le mélange a ensuite été transféré dans une cellule plate en quartz préalablement purgée au diazote et des spectres RPE ont été enregistrés toutes les 3,5 minutes pendant une heure.
1.c. Étude à 77 K
Les expériences à température de l’azote liquide ont été réalisées à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles avec un spectromètre RPE MiniScope MS100
Magnettech (Berlin, Allemagne) fonctionnant en bande X. Il s’agit d’expériences destinées à quantifier les signaux obtenus par la suite lors de l’étude RPE ex vivo décrite page 78.
Nous avons utilisé les paramètres suivants : intensité du champ magnétique 331,5±20 mT, puissance de la micro-onde 100 mW atténué par 13 dB, fréquence de la micro-onde entre 9,3 et 9,6 GHz, amplitude de modulation 5,73×10-5
T et fréquence de modulation 100 kHz.
Figure 18 : Spectromètre RPE en bande X MiniScope MS100 Magnettech.
Une solution de 1-nitrosomélatonine (2 mg/200 µL) a été préparée dans du Tween 80 (Merck-Schuchardt), puis diluée avec du tampon phosphate de sodium à 0,1 M et pH 7,5. La concentration de cette solution a été contrôlée par spectrophotométrie (ε346 nm = 10 900 M-1.cm-1). Nous avons utilisé comme ci-dessus des solutions fraîches et
tampon phosphate à 0,1 M et pH 7,5 et 20 mM de sulfate ferreux dans l’eau. La solution de complexe de fer et de dithiocarbamate de N-méthyl-D-glucamine (MGD)2-Fe2+ à 10 mM a été obtenue en mélangeant rapidement sous argon des volumes égaux de ces solutions. Immédiatement après, nous avons ajouté sous argon 0,1 mL de cette solution de (MGD)2-Fe2+ à 0,4 mL de solution de 1-nitrosomélatonine (ou de GSNO) dans un tube RPE en quartz de 5 mm de diamètre. Le tube a été congelé après 30 min dans l’azote liquide et conservé à cette température jusqu’à l’analyse RPE.