CONTROLE
des MICROORGANISMES et TECHNIQUES de
STERILISATION
1) DEFINITIONS
Stérilisation:
- un agent stérilisant permet l'élimination ou la destruction de toute trace de vie ( cellule, spores, virus .... ).
- Un objet stérile est totalement exempt de microorganismes, de spores ou d'agents infectieux viables.
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A- Contrôles des microorganismes
L'activité microbienne peut avoir des conséquences indésirables telles que:
- la détérioration des aliments,
- la prolifération des microorganismes pathogènes.
Désinfection:
les désinfectants sont des agents chimiques employés sur des objets inanimés, ils permettent la destruction, l'inhibition ou l'élimination des microorganismes pathogènes.
Décontamination:
c'est une désinfection partielle, permettant de réduire le nombre de microorganismes (nettoyage de la vaisselle par ex).
1
Antisepsie:
les antiseptiques sont des agents chimiques moins toxiques que les désinfectants et qui peuvent être appliqués sur les tissus hôtes dans le but de détruire ou d'inhiber le développement des microorganismes pathogènes.
2) Facteurs influençant l'activité des agents antimicrobiens
L'activité des agents antimicrobiens peut être affectée par au moins six facteurs:
a- La concentration microbienne:
la destruction d' une plus grande population nécessite plus de temps qu'une petite population.
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Suffixes -CIDE et-STATIQUE
- Le suffixe -cide est utilisé pour les substances présentant des activités destructrices des microorganismes, on parle selon les cas de substances:
- Bactéricides, - Fongicide, -Algicide - ou Virucide.
- Les agents antimicrobiens qui ne font que stopper le développement des microorganismes sans les tuer, se terminent par le suffixe -statique: Bactériostatique, Fongistatique ...
b- le type de microorganisme:
l'activité d'un agent antimicrobien varie d'une espèce à l'autre et selon l'état des cellules:
- les cellules végétative sont plus sensibles que celles à l'état d'endospores;
- les cellules jeunes sont plus sensibles que les cellules matures.
c- La durée d'exposition : d-La température:
2 .,
..
Antisepsie:
les antiseptiques sont des agents chimiques moins toxiques que les désinfectants et qui peuvent être appliqués sur les tissus hôtes dans le but de détruire ou d'inhiber le développement des microorganismes pathogènes.
2) Facteurs influençant l'activité des agents antimicrobiens
L'activité des agents antimicrobiens peut être affectée par au moins six facteurs:
a-La concentration microbienne:
la destruction d' une plus grande population nécessite plus de temps qu'une petite population.
26/09/2017
Suffixes-CIDE et-STATIQUE
- Le suffixe -<:ide est utilisé pour les substances présentant des activités destructrices des microorganismes, on parle selon les cas de substances:
- Bactéricides, - Fongicide, -Algicide - ou Virucide.
- Les agents antimicrobiens qui ne font que stopper le développement des microorganismes sans les tuer,·se terminent par le suffixe -statique: Bactériostatique.
· Fongistatique ...
b- le type de microorganisme:
l'activité d'un agent antimicrobien varie d'une espèce à l'autre et selon l'état des cellules:
- les cellules végétative sont plus sensibles que celles à l'état d'endospores;
- les cellules jeunes sont plus sensibles que les cellules matures.
c- La durée d'exposition :
d- La température:
2
e-la concentration ou l'intensité de l'agent antimicrobien:
Un agent antimicrobien peut être chimique ou physique.
- En général, plus un agent chimique est concentré ou plus un agent physique est intense, plus les
microorganismes sont détruits rapidement.
- Cependant, certains Agent Chimiques sont plus efficaces à plus faible concentration. Ex: l'éthanol à 70° est plus efficace que l'éthanol à 95° car son activité au ente en résence d'eau.
B- TECHNIQUES de STERILISATION
li
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f-L'environnement local:
Certains facteurs de l'environnement où se trouvent les µorganismes peuvent influencer la sensibilité de ces derniers:
- un milieu acide facilite la destruction des µorganismes par la chaleur.
(Ex: la pasteurisation des produits acides est plus facile que celle des produits neutres comme le lait).
- La matière organique qui piège les µorganismes, les protège contre la chaleur et les agents chimiques.
(Ex: les Biofilms).
Il est donc nécessaire de nettoyer les objets avant de \~s
- La destruction des micro-organismes est indispensable lors de la préparation du matériel et des milieux destinés aux manipulations.
- Le nombre de germes tués est lié à la population et au temps d'exposition. Il est donc nécessaire de travailler avec du
matériel propre et très peu chargé en germes afin de le stériliser pendant un temps
relativement long.
- Différentes techniques sont utilisées :
"
3
1~-
1- STÉRILISATION PAR LES MÉTHODES PHYSIQUES
A- STÉRILISATION PAR LA CHALEUR 1 - Chaleur sèche : { oxydation des protéines)
13
LE FOUR PASTEUR , POUPINEL - C'est un four utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide (tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes Pasteur et récipients divers).
- La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide ou dans des étuis .
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LE FLAMBAGE
Utilisée pour la stérilisation du matériel de manipulation par l'emploi du bec Bunsen : - extrémité de l'ose ou anse,
- extérieur des pipettes,
- col des tubes, erlenmeyers et flacons divers, - étaliers ...
·..____,,, ) Le bec Bunsen, réglé sur une flamme bleue, la plus chaude, crée une zone de stérilité d'un diamètre de 20 cm. Toutes les manipulations d'ouverture de tubes et de boîtes de culture devront être réalisées dans ce diamètre.
Les germes et leurs spores sont détruits en chaleur sèche, par un chauffage de :
30 min à 1 heure à 180°C ; ou 2 heures 30 à 160°C ; ou
4 heures à 140 °C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton.
- Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement complet, puis stocké à l'abri des poussières.
- Compte tenu des températures relativement élevées, il est conseillé d'utiliser le plus possible de la verrerie résistante <tvoe « Pvrex "). ,.
4 ,
!
2 - Chaleur humide: Autoclavage
Destruction par dénaturation des protéines des microorganismes; c'est la méthode là plus efficace, elle combine trois paramètres :
- la Pression, - la Température,
- le Temps de Stérilisation.
L'appareil utilisé est appelé AUTOVLAVE: c'est une enceinte contenant de l'eau et une résistance.
En milieu saturé d'humidité et sous pression, la stérilisation s'opère à des températures inférieures à celles qui sont nécessaires en milieu sec. 11
- La chaleur humide est utilisée pour stériliser les milieux de culture neufs ou souillés, mais peut également stériliser tout autre matériel de microbiologie : matériel en caoutchouc, la verrerie, les instruments de prélèvement et la stérilisation du matériel après son utilisation.
On peut utiliser à la place une cocotte minute, mais avec un temps de chauffage prolongé de la moitié du temps nécessaire en autoclave car . la température atteinte ne dépassant pas 11
s ..
0c
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- Dans une atmosphère de vapeur d'eau
exempte d'air, toutes les bactéries y compris les spores sont tuées en 20 min à 120°C
correspondant à une pression de 1 bar.
- Pour un volume donné, la température est fonction de la pression ; on obtient la
température requise de 120°C, très supérieure à la température normale d'ébullition de l'eau, en chauffant en surpression, c'est à dire en vase clos.
PRECAUTION à prendre :
- la verrerie doit être bouchée au coton et recouvert de papier aluminium,
- les récipients contenant un milieu de culture doivent être remplis aux 3/4,
"
- les instruments métalliques sont déposés sur un plateau de boites spéciales contenant une solution de carbonate de soude à 2% contre la rouille ... , - Ne convient pas pour les produits liquides
thennolabiles ( milieux albumineux, lait, gélatine ... ) '"
5
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I ' · _
B/ Pasteurisation et Tyndallisation:
Pasteurisation
- Consiste à porter le liquide à une température de 70 à 90°C pendant quelques minutes, puis on le refroidit brusquement à 10°C.
-Utilisé pour la conservation des produits naturels pendant un temps limité, ne détruit que les formes végétatives mais pas les spores.
- Ex: le Lait. 21
C/ Stérilisation par filtration:
on utilise surtout un appareil de filtration muni d'un filtre dont le diamètre des pores est de 0.45 µm (inferieur à celui des bactéries).
- Ce filtre retient à peu près tous les µorganismes en dehors des virus.
- But: stériliser les milieux de culture et solutions thermosensibles (huiles, antibiotiques ... ).
- L'air dans les salles ou les hottes de travail peuvent être aussi stérilisées par cette méthode d~
filtration.
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Tyndallisation
Consiste en une série de 3 pasteurisations de l heure à 70 - 80°C, séparées par un intervalle de 24 heures à température ambiante.
- Pendant les 24 hrs, les spores restantes vont germer en cellules végétatives qui seront détruites à leur tour par la 2ème et la 3ème pasteurisation.
- Cette méthode de destruction est opérée sans l'emploi d'une température excessive, elle est do~c utilisée pour les milieux fragiles conlenant du serum, des œufs o~ toute substance thermosensible de f°,;te viscosité qui ne peut être stérilisée par filtration.
. .
D-STÉRILISATION PAR LES RADIATIONS - La stérilisation par les UV est utilisée pour la décontamination de l'air et des paillasses situées sous ta hotte de protection: le rayonnement n'agit que de façon directe et sa pénétration est faible. Des instruments ou des récipients tels que les boîtes de Pétri peuvent être stérilisées de la sorte.
- D'autres radiations telles que les rayons X (peu utilisées), peuvent cependant servir pour la
stérilisation industrielle des boîtes de Pétri en matière plastique : stérilisation par ionisation.
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II Action des aeents chimiques : 1 / Antiseptiques
- Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantannée.
lis agissent à l'intérieur de l'organisme ou à sa surface: teinture d'iode, mercryl laurylé, permanganate de potassium, eau oxygénée ...
- Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses
3 / Antibiotiques
'"
Substances d'origine naturelle ou obtenues par synthèse chimique.
On distingue :
- les antibiotiques bactériostatiques qui stoppent la multiplication des bactéries sans~
les détruire ·
- les antibiotiques bactéricides qui tuent les bactéries
- Utilisation in vivo.
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2 / Désinfectants
- Empêche les contaminations humaines et animales - vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène ) - liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permanganate de potassium )
- solide ( chaux vive ).
- Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme : eau, air, sol ( objets inanimés, désinfection du matériel plastique utilisé en
microbiologie) ,.
7 '·
/
MICROBIOLOGIE GENERALE S3 / Pr. Mouslim
♦
INTRODUCTION
♦
STRUCTURE DE LA CELLULE BACTERIENNE - FORME et DIVISION
- PAROI CELLULAIRE
-MEMBRANE CELLULAIRE
- ---- -- - -- -- -C-YfOPLASME-et
sesINCLUSl6NS - -- -- - - - - - SPORULATION
-CAPSULE -MOBILITE
- PILLI et FIMBRIAE
♦
CROISSANCE BACTERIENNE
♦
INITIATION A LA vmoLOGIE
♦
GENETIQUE BACTERIENNE
♦
NUTRITION BACTERIENNE
♦
TECHNIQUES DE STERILISATION
8
I -INTRODUCTION
La microbiologie est une science moderne et pluridisciplinaire qui s'occupe de l'étude des microorganismes. Fondée véritablement par L. Pasteur et R. Koch puis par Tescherich et A Fleming et enfin A. lwoff, F Jacob et J. Monod.
C'est une science qui traite principalement de la biologie des microorganismes, de leur nomenclature, de leur physiologie et de leur écologie.
Ella a des applications dans de nombreux domaines tels que : La médecine humaine et vétérinaire
La production de médicament, d'antibiotiques et de vaccin La production de biomasse et de protéines
La bioconversion
La production d'enzymes, d'acides aminés et de vitamines L'agronomie et l'agriculture
L'environnement
La lute biologique et la dépollution des eaux La récupération des métaux
La production d'énergie propre (Hydrogène, méthanol, éthanol...)
. --La - valonsâff on des· dèëhets · 1a préparation êfairriieiifs :femîentés· .
La biotechnologie
La conservation des denrées ...
Les microbiologistes classent les organismes en 5 règnes au moins, selon 3 critères principaux: le type cellulaire (procaryote ou eucaryote), le niveau d'organisation (unicellulaire ou multicellulaire) et le type de nutrition
0-
On distingue:- Règne plantae - Règne animaliae
- Règne fungi (protistes sup ): organismes eucaryotes multinuclués (levures, moisissures et champignons).
- Règne protista (protistes sup ): organismes eucaryotes à organisation unicellulaire ( algues, protozoaires et de nombreux mycètes simples)
- Règne procaryote (protistes inf): microorganismes procaryotiques qui n'ont pas de vrais noyau (algue bleu-vert ou cyanophycée, bactéries ou shizomycètes).
Les microbiologistes s'intéressent essentiellement aux 3 dernières règnes. Les virus, bien qu'ils soient classées à part, sont aussi étudiés par les microbiologistes.
La microbiologie est donc une science qui englobe la bactériologie , la mycologie, la parasitologie et la virologie.
Il y a une très grande variété de microorganismes et on les rencontre pratiquement partout dans la nature. C'est la forme de vie la plus abondante et la plus répandue sur notre planète (sol, eau et atmosphère), on les rencontre aussi sur toute les surfaces de notre corps et orifices naturelles (bouche, nez ... ). On retrouve en abondance les microorganismes là où la nourriture, l'humidité et la température favorisent leur croissance et leur multiplication. ·
9
I\
Le monde bactérien est l'un des groupes les plus importants par leurs nombres, leur - importance en écologique et biotechnologique et leur utilisation dans la compréhension des
mécanismes biologiques (biochimique et biologie moléculaire .. ).
II -CELLULE PROCARYOTE: Structure et Fonctions
1) FORMES
Il y a une grande diversité morphologique chez les bactéries. On note deux types de forme : - les formes sphériques ou coques présentant plusieurs modes de groupement dont chacun est caractéristique d'une espèce particulière. Elles peuvent être:
- individuelles
- groupées en deux ( diplocoques : cellule se divise et restent ensemble en paire) - en chaîne de coques (cellules restent attacher après plusieurs divisions)
- en grappe de raisin (groupe irrégulier de cellules)
- en tétrade (après division dans deux plans donnant quatre cellules symétriques. Il est rare de voir les cellules d'une espèce donnée se grouper exactement de la même façon, c'est le
· groupèmfaif predoiiiinanl qui esfiiriporlârit. · · - · -- - · · · --· - - ---· · - -· · -
Les formes cylindriques, bâtonnet ou bacille avec une diversité dans le rapport longueur/largeur. Les cellules peuvent être solitaire, en paire (diplobacille) ou en chaîne (streptobacille). Certains bâtonnets sont( incurvés en virgule ou spirale incomplète.
Les coccobacilles sont de forme intérmidiaire par leur forme courte et large et sont donc proche de la forme cocci.
Les spirilles ou spirochète ont une forme bâtonnet tordue en spirale.
Certaines bactéries présente une forme mycélienne sous forme de filaments appelés mycélium.
La forme ovale ou en poire avec un bourgeon à l'extrémité.
Les bactéries pléomorphes n'ont pas de forme caractéristique et change de forme.
2) TAILLE
Les bactéries présentent différentes tailles allant de 100 nm à 7µm de diamètre. La plus part des espèces ont une dimension comprise entre 1 et 1 0µm
L'examen microscopique des cellules bactériennes montre l'existence de structure à l'extérieur et à l'intérieur de la paroi cellulaire. Certaines de ces structures sont communes à toutes les cellules, d'autres sont présentes seulement sur ou dans la cellule de certaines espèces.
9
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3) LA PAROI de la CELLULE BACTERIENNE
La paroi cellulaire est l'un des constituants les plus importants d'une cellule procaryote. Elle se trouve en dessous des substances extracellulaires comme la capsule ou les gaines, et au dessus de la membrane cytoplasmique.
C'est une enveloppe rigide qui donne à la cellule sa forme et la protège contre la lyse osmotique et les chocs (thermique ... ). Elle peut protéger aussi certaines cellules contre les substances toxiques et être le site d'action de plusieurs AB. Chez certains agents pathogènes, la paroi contribue au pouvoir pathogène grâce à un constituant appelé ... ;
On peut mettre en évidence la rigidité de la paroi en soumettant les bactéries à des pressions très élevées, à des températures très basses ou à plusieurs autres facteurs physiques intenses.
La majorité des bactéries conservent leur forme originale pendant et après de tels traitements.
En éliminant la paroi, la cellule adopte une forme sphérique fragile appelée protoplaste.
La paroi constitue de 10 à 40% du poids sec de la bactérie. Elle est essentielle à leur croissance et à leur division. Mis à part les mycoplasmes et quelques Archéobactéries, toutes les bactéries possèdent une paroi cellulaire rigide.
-cette-rigidité-esl atffibuée à-fui polymère·appèle-peptidôglycane -Crrïurêinè- :muccipêptidé)""qw·
n'existe que chez les procaryotes.
Ce polymère est composé principalement de chaînes polysaccharidique linéaires formées d'unités monomérique qui sont deux sucres aminés: le N acetylglucosamine et l'acide N acétylmuramique et un petit nombre d'acides aminés dont certains sont inhabituels.
L'altérnance de ces deux ~osucres forme une chaîne glycane qui peut être- constituées de 10 à 65 unités disaccharidiques.
Un tetrapeptide constitué d'acides aminés L alternant avec des acides aminés D est lié au groupement carboxyle de l'acide N acétylmuramique. La séquence la plus connue est l' Acide m-L-alaline-D glutamique- acide L diamino- acide D alanine-COOH;
Chaz certaines bactéries l'acide diamino en 3 position peut être remplacé par un autre acide aminé tel que la L-lysine.
Les chaînes de peptidoglycane sont reliées entre elles par des liaisons
interpeptidiques entre le groupement carboxyle de la D alanine terminale et le groupement aminé de l'acide diaminopémilique.
Dans certains cas et essentiellement chez les bactéries Gram+, la liaison se fait par un pont interpeptidique formé de 1 à 6 acides aminés.
La technique de coloration de Gram développé par le Danois Christian Gram en 1984, a permis de classer les bactéries en deux groupes principaux: les Gram+ et les Gram-. Si on traite des bactéries tuées par la chauffage (fixation) par un colorant le violet de gentiane, puis par l'iode (fixateur du colorant) les bactéries se trouvent colorées en violet par ce complexe colorant-iodé. Cependant, si on soumis les bactéries colorées à l'action d'un solvant organique comme l'acétone ou l'éthanol (différentiateur), certaines bactéries gardent leur coloration violette et sont dites Gram+, alors que d'autres perdent leur coloration et deviennent incolores et sont dites Gram-.
10
7
i \
La différence de structure entre ces deux groupes a été découverte grâce au microscope électronique.
PAROI GRAM+
La parois du type Gram + présente un aspect homogène en une seule couche, et elle est plus épaisse que la parois Gram - (20-80 nm). Elle est constituée principalement du peptidoglycane qui représente 40 à 90 % du poids sec de la paroi cellulaire.
A la différence de la paroi Gram-, la paroi Gram+ contient aussi une grande quantité d'un polymère hydrosoluble de glycérol ou de sorbitol reliés par des groupements phosphates appelé acide téichoîque (AT).
Les AT sont liés soit directement au peptidoglycane soit aux lipides de la membrane plasmique; dans ce cas, ils s'appellent de l'acide lipotéichoîque.
Ces AT sont chargés négativement et conrere à la paroi des G+ leur charge négatives ce qui permis la fixation des ions bivalents comme le Mg2+ et contrôlent leur passage à travers la paroi. Ils seraient aussi important pour le maintien de la structure de la paroi.
PAROIGRAM-
La paroi Gram- est plus complexe que celle des Gram+ avec une fine couche de peptidoglycane (PG) de 2 à 7 nm d'épaisseur, adjacente à la membrane plasmique et entourée d'une membrane externe (ME) épaisse de 7 à 8 mn. Cette dernière est un peu comparable à la membrane cytoplasmique, elle est formée de :
- Lipoprotéine de Brawn, protéine abondante attaché par des liaisons covalentes au peptidoglycane et enfouie dans la membrane externe par son extrémité hydrophobe. C'est une protéine de liaison entre PG et ME
- Lipopolysaccharides (LPS), molécules complexes et importantes formée de 3 parties :
- une partie lipidique ; Lipide A, constituant majeur de la membrane externe et formé de quelques· acides gras et des phosphates. Il contribue à la charge négative de la surface bactérienne et aide à la stabilisation de la structure membranaire et qui est souvent toxique et peut donc agir comme endotoxine.
- polysaccharide central lié au lipide A
- Chaîne latérale O ou antigène O : c'est un polysaccharide constitué de quelques sucres particuliers dont la composition varie selon les souches bactériennes. Les bactéries
11
peuvent changer la nature de leurs chaînes latérales O ce qui leur permet d'échapper à la défense de l'hôte en étant non reconnaissable par les antigènes de ce dernier.
La membrane externe constitue donc une barrière de protection en empêchant ou diminuant l'entrée de certaines substances toxiques comme les antibiotiques. Cependant, le passage de petites molécules à travers cette ME est due à la présence de molécules spéciales, les porines.
Les molécules les plus grosses sont transportées au travers de la ME par des transporteurs spécifiques.
La différence de comportement des cellules vis à vis des colorants est donc due à la composition de leur paroi. En effet le paroi Gram- est plus mince, peu ponté et contient un ,.., plus fort % de lipides que les bactéries Gram+ avec de larges pores. On pense que pendant la
\ coloration Gram par le violet de gentiane, l'alcool extrait la couche lipidique, ce qui augmente
~
la perméabilité de la paroi et la cellule se trouve décolorée.? ,'
Il · paraît que· le -.(,ëplîdoglycane· agit -·avéc -les -lîpotéichoïques·-
coniïne - une
barrière-de perméabilité empêchant la perte du éolorant ; et comme la paroi Gram + a un faible contenu en lipide, elle se trouve déshydratée après traitement par l'éthanol ce qui réduit les dimensions des pores de la paroi et le complexe colorant-iode reste à l'intérieur de la cellule.BIOSYNTHESE DU PEPTIDOGLYCANE
Les réactions de synthèse du peptidoglycane ont lieu à la fois à l'intérieur et à l'extérieur de la cellule et se déroulent sur huit étapes avec l'intervention de deux transporteurs, }'uridine diphosphate (UDP) et le bactoprénol. Voir planche
Ces étapes sont sensibles à certains antibiotiques dont l'inhibition affaiblit la paroi et conduit à la lyse osmotique :
- Les Pénicillines (transpeptidation) , - le V ancomycine,
- le Cyclosérine,
- la Bacitracine (bloque la déphosphorylation du bactoprénol- pyrophsphate ...
FONCTIONS DE LA PAROI CELLULAIRE
L'une des fonctions principales de la paroi est la protection contre la pression osmotique. En effet, durant l'osmose, l'eau tend à entrer dans la cellule bactérienne, ce qui entraîne une
12
7'
augmentation da la pression osmotique avec un gonflement de la cellule mais limité par la présence de la paroi.
En absence de la paroi, la membrane cytoplasmique sera désorganisée puis détruite par le gonflement de la cellule, c'est la lyse.
Durant la plasmolyse, le cytoplasme diminue de volume par perte d'eau et se détache de la paroi cellulaire. Ce phénomène est très utile à la préservation de la nourriture (beaucoup de bactéries ne se multiplie pas dans la nourriture séchée ou dans les produits concentrées (confiture) car il ne peut pas éviter la plasmolyse.
Pour démontrer le rôle protecteur de la paroi cqntre la lyse osmotique on traite les cellules bactériennes par une enzyme, la lysozyme qui attaque le peptidoglycane ou par un antibiotique tel que la pénicilline qui inhibe la synthèse du peptidoglycane. Si ce traitement est fait en milieu isotonique, les Gram
+
se transforment en protoplaste et les Gram - en sphéroplaste (une partie de la paroi existe toujours) qui continuent à se développer··normale-ment en-nïilîeu•isotofiique•mâ.is-devieooent sensible à la pression osmotiquë.
NB : Les mycoplasmes sont des bactéries dépomvues de paroi et pourtant sont résistant à la pression osmotique, car ils présentent une membrane plasmique très résistante, ce sont des cellules pléomorphes ( change de forme). . .,
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4) LA SPORULATION /
l ,.J.-,•~·-C'est une structure de résistance, trouvée chez certaines bactéries Gram+. Elle permet aux cellules de rentrer en dormance et de résister aux conditions sévères de l'environnement comme la chaleur, les radiations UV, les désinfectants chimiques, le manque d'élément nutritifs et la dessiccation. Mises dans des conditions favorables, ces spores se transforment en cellules végétatives.
On peut la mettre en évidence au microscope optique par des techniques de coloration : les spores étant imperméables à la plus part des colorants, apparaissent incolores dans les bactéries colorées.
Suivant l'espèce, elle peut être localisée au centre ou en position subterminale ou terminale.
Sa présence est donc un critère d'identification des bactéries. Elles caractérisent trois genres pnnc1paux:
- genre Bacillus (ex: bacillus anthracis, maladie du charbon)
:.: genre.
ëiostndium {ex : . ëiostridium
Ïetani, agent du tétanos· et cl. Botuiin~~,--;_g~nt du botulisme)- genre Sporosarcina
A cause de leur thermorésistance et du fait que certaines espèces bactériennes formant des endospores sont pathogènes, les endospores causent de nombreux dégât en microbiologie industrielle et médicale; c'est pourquoi il faut ·stériliser les solutions et les objets par autoclavage.
Structure: La spore est entourée de plusieurs enveloppes:
- l' exosporiom : enveloppe mince lipoprotéique.
- la tunique : formée de quelques couches protéiques, riche en soufre, imperméable et responsable de la résistance des spores aux produits chimiques.
- le cortex avec la paroi de la spore, est constitué de peptidoglycane avec moins de ponts que celui dans la cellule végétative.
- le protoplaste avec des structures cellulaires normales telles que les ribosomes et nucléoïde mais il est métaboliquement inerte.
La résistance des spores est encore mal connue, plusieurs facteurs_ pourraient y participer : - la stabilisation del' ADN par le complexe acide dipicolinique-calcium.
- la présence de protéines spécialisées se fixant à l' ADN et le protégeant.
14
7
- l'état déshydraté de protoplaste (sortie d'eau par osmose) avec seulement 15 à 20% d'eau au lieu de 95% dans la cellule végétative.
- la tunique avec son action protectrice à l'égare de certaines enzymes et substances chimiques.
- la présence d'enzyme de réparation de l' ADN de la spore qui devient active au cours de la germination en milieu favorable.
- stabilité des protéines à des températures élevées.
La sporulation ou sporogenèse passe par 7 phases: (voir planche).
Le processus inverse c à d la transformation en cellule végétative se déroule en 3 phases : l'activation, la germination et la croissance.
- L'activation est essentielle à la germination, elle prépare la spore à la germination et se fait par choc thermique ou d'un agent chimique ou autres.
- Lors de la germination, le peptidoglycane du cortex est détruit, il y a autolyse et la spore qui --devîenl pemïéable, -
se
-gonfle-â' eau~ përd--sa résistance, aevièiit coloràblë-püis augmente -son
activité métabolique.
- La croissance correspond à la destruction des téguments (tunique et cortex) et la libération de la cellule.
15
1- .
· . ,
5) LES COMPOSANTS EXTRAP ARIETALS :
CAPSULE - COUCHE MUCOÏDE - GLYCOCAL YX - COUCHES
Certaines bactéries présentent à l'extérieur de leur paroi une couche supplémentaire plus ou moins organisée, appelée capsule ou couche mucoïde ou glycocalyx.
Quand cette structure est bien organisée et bien adhéré à la paroi on parle de capsule et dans le cas contraire on parle de couche mucoïde qui est une substance plus fluide, qui tend à diffuser dans le milieu. Ces deux structures sont en général composées de polysaccharides et peuvent être mises en évidence au microscope optique par des colorations négatives.
La capsule n'est pas nécessaire à la croissance bactérienne mais elle permet : - de résister à la phagocytose par les cellules phagocytaires de l'hôte
- de protéger les bactéries contre la dessiccation puisqu'elle est chargée en eau,
Le glycocalyx: c'est un réseau de polysaccharide recouvrant la surface des bactéries et d'autres cellules voisines (capsule et couche mucoïde) et permet aussi l'attachement des bactéries sur des surfaces solides dans des environnements aquatiques et sur les tissus animaux et végétaux.
La couche S: C'est une couche régulière, structurée, composée de protéine et de glycoprotéine. Elle a un rôle protecteur contre les fluctuations ioniques, les variations de pH, le stress osmotique et les prédatrices. Elle aide à maintenir la forme et la rigidité de certaines bactéries, favorise l'adhésion des cellules à des surfaces et contribue à la virulence de certaines bactéries pathogène en les protégeant de la phagocytose et de l'attaque par le complément.
16
······-· -... _
6)
FLAGELLES ET MOBILITE
Les flagelles sont des structures de locomotion minces (
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20 nm de. 0 et 15 à 20 µm de long) dont la structure détaillée ne se voit qu'au microscope électronique; mais on peut les voir au microscope photonique en augmentant leur épaisseur à l'aide des mordants comme l'acide tannique et l'alun de potasse, suivi des techniques de coloration ce qui apporte des informations taxonomiques importantes.En effet, le type et la distribution des flagelles varient d'une espèce à l'autre. On peut distinguer :
- les bactéries monotriches avec un seul flagelle qm peut être polaire s'il est situé à l'extrémité.
- les bactéries amphitriches avec un seul flagelle à chaque extrémité.
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- les bactéries lophotriches ont une touffe de flagelle.
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- les bactéries péritriches avec des flagelles sur toute la surface cellulaire.
On peut distinguer 3 parties dans un flagelle :
- le filament s'étend depuis la surface cellulaire et constitué d'une seule protéine, la flagelline.
- le corps basal est enfoui dans la cellule avec une structure complexe formée de plusieurs anneaux attachés à un axe central.
- le crochet lie le filament au corps basal
La flagelline est le support d'une antigénicité flagellaire, elle provoque la formation d'anticorps ce qui entraîne une agglutination.
Ces bactéries sont douées de chimiotactisme, elles peuvent être attirées par certaines substances tels que des sucres, c'est le chimiotactisme positif. Cette attr.action est due à des récepteurs de nature protéique en fixant les substances attractives à l'intérieur de la cellule. La spécificité de ces récepteurs n'est pas absolue; le récepteur pour le galactose par ex. reconnaît le glucose et le saccharose.
Les bactéries peuvent être aussi repoussées par certaines substances comme les phénols, les acides, les bases ... , c'est le chimiotactisme négatif.
17
7)
LES PILI ET LES FIMBRIAE
Ils sont différents des flagelles, visibles au microscope électronique. Ils sont fréquents chez les bactéries à Gram-, sont rare chez les bactéries à Gram+. Il existe deux types:
- les pili COillil!_~ ou fi1111:?riae : sont nombreux sur la surface bactérienne, plus minces et plus cours que les flagelles. Ils ne sont pas impliqués dans les mouvements et sont fréquent chez les bactéries immobiles. Certains types de fimbriae permettent aux bactéries d'adhérer à des surfaces solides.
- l~_pi!i sex!!:els : ces pili interviennent au cours de là conjugaison bactérienne. Cette dernière est un phénomène au cours duquel il y a un transfert du matériel génétique d'origine chromosomique ou plasmidique d'une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice . Cette bactérie donatrice est une bactérie mâle, elle possède un facteur F qui est constitué d'ADN extrachromosomiques qui représentent un plasmide. Ces pili sont toujours en petit nombre mais ils sont plus grands et plus épais que les pili communs. Ils se terminent par un gonflement et leur structure est celle d'un cylindre creux. Sur ces pili peuvent se fixer des bactériophages spécifiques.
8) LES MEMBRANE DES CELLULES PROCARYOTES
*
La membrane cytoplasmique est essentielle à la survie des microorganismes. Elle remplit non seulement les fonctions spécifiques aux membranes comme chez la cellule eucaryote, mais aussi les fonctions prises en charge par les membranes des organites. Elle est douée donc d'un grand nombre de rôle différents comme : la sélectivité dans la perméabilité, la respiration, la photosynthèse, la synthèse des lipides et des constituants de la paroi, la présence des molécules réceptrices ... Ceci explique la forte richesse de la membrane plasmique bactérienne en protéine par rapport à celle de la cellule eucaryote.Cette membrane est constituée essentiellement de lipides et des protéines. Les lipides, principalement des phospholipides sont appelés amphipathique avec une partie hydrophile et l'autre hydrophobe, ce qui leur permet de former une double couche de molécules dans la membrane. A la différence de la membrane eucaryote, la membrane bactérienne est dépourvue de stérols comme le cholestérol. Cependant, elle peut contenir des stérols pentacycliques appelés hopanoïdes, probablement des stabilisateurs de la membrane.
18
La structure de la membrane est une mosaïque fluide avec deux types de protéines, les uns constituant 20 à 30% de protéines totaux, sont extrinsèques (périphériques) faiblement associées à la membrane et solubles dans les solution aqueuses ; les autres sont intrinsèques, fortement associées à la membrane et insolubles dans les solutions aqueuses ~t sont ainsi amphipathiques doués d'une capacité de se déplacer latéralement dans la membrane.
La structure de la membrane bactérienne est donc très organisée, asymétrique, flexible et dynamique. Suivant l'espèce, la structure et la capacité fonctionnelle de la membranaire sont variables et constituent donc un critère d'identification des bactéries.
* Les mésosomes sont des invaginations de la membrane plasmique en forme de vésicules, de tube ou de lamelles. Elles jouent probablement un rôle dans la formation de la paroi ou dans la réplication du chromosome.
* Certains microorganismes comme les bactéries photosynthétiques ou les bactéries
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nitrifiantes qui ont une activité respiratoire intense, présentent des replis membranaires très étendus et complexes donc une surface membranaire plus importante, permettant probablement d'assurer une activité métabolique plus intense.
9)
LE CYTOPLASME ET SES INCLUSIONS
Le cytoplasme est· constitué de 30% d'eau, d'ions minéraux, de composés organiques d'enzymes, d'acide nucléaire et différentes înclusons.
Les ribosomes
Sont des granules sphériques qui remplissent sont le cytoplasme. Ces ribosomes sont constitués d 'ARN et de protéines, ils interviennent dans la biosynthèse des protéines. Ils se distinguent des ARN eucaryotes par leur constante de sédimentation.
Les substances de réserve
• réserves carbonés: amidon, polysaccharide de glycogène. On les trouve chez les amkeverbactzré ; chez les bactéries, chotsythétisants, chez les clostoridium.
• Réserves lipidiques : sous forme d'acide poly B hydroxybactyrique, pentre colorie en rouge par des colorants spécifiques ex le saudon.
I 19
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• Polyphosphates inorganiques =(ATP): constituent des graines de volutine, ils sont mis en évidence par le colorant d'Albert, ils se rencontrent chez le coznebactzerium diphteriae.
• Des inclusions de soufre : réserve d'énergie. Certaines bactéres trient leur reco chimique d'oxydo-ré en oxydant le S. H2S S, le soufre et magnésium dans la cellule lorsqu'il n'y a plus d'H2S dans la bactérie, il y aura oxydo le soufre en S04.
H2S-S-S04
• Inclusions de fer : chez les sidérobactéries.
Ils se trouvent chez les bactéries photosynthétisantes lorsqu'elles sont cultivées en lumière et en anaérobiose. Ils se distinguent des choroplastes des Eucaryotes. Ce sont des S très simples constitués de petites vésicules très petites avec une mb d'un double feuillet, et un centre une particules. Dans les chlorophastes des Eue on trouve la chlorophile B, chez les bactéries, il y a la bactériochyphile. On distingue 2 types de B photosynthétisantes
• Bactéries pourpres : couleurs foncées, les chromatych sont rattaches à la mbphsée chez le Rhodispirullium rubrum, 5 à 6 milles par cellule.
• Bactéries vertes : chez lesquelles les chromatophores sont totalement distincts de la mscy. (Ils ont toujours besoin à la lumière, elles possèdent des vésicules à gaz)
Ils permettent à la B, de vivre dans la lumière, elles peuvent être en très grand nombre à la surface de l'eau et constituent les fleurs d'eau.
Appelés aussi corps polyhedriques, on les rencontre chez les B autotrophes (assimilent le C02) parmi eux, il y a les cynobactéries (algues bleues), les bactéries nutrifientes, vont transformer l'azote amrnonicale en nitrate (NH4-N03), les bactéries sulfoxydantes;
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COURS DE VIROLOGIE
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Les virus, ils sont nombreux, variés dans leur forme, leur dimension, leur matériel génétique. Hommes, animaux ou plantes, tout ce qui est vivant peut être utile à leur survie. Ils ont à leur actif 60% des maladies infectieuses connues à ce jour, mais sont également responsable de certains cancers.
Ce sont des particules extrêmement petites.
Leur taille est le plus souvent comprise entre 0,05 et 0,lµm.
Leur nom «virus» signifie poison •
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IDSTORIQUE - DEFINITION - STRUCTURE ET
CLASSIFICATION DES VIRUS
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12:45
1- HISTORIQUE
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EXPERIENCE D'NANOWSKY (1892)
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maladeToxine ou agent infectieux ? •
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2
IVANOWSKY conclue: qu'il s'agit d'une toxine mais BEIJERINCK (1898) démontre qu'il s'agit d'un agent infectieux nouveau et l'appela inframicrobe.
ll
C'est un parasite absolu(= obligatoire) car ne possède pas dans son génome l'information nécessaire pour la synthèse de ses métabolites essentiels. Le virion les trouve dans la cellule qu'il infecte. li détourne à son usage les systèmes enzymatiques préexistants. De même il utilise pour la synthèse de ses propres protéines, les ribosomes et les ARNt de la cellule qu'il infecte.
li présente une structure définie, possédant une symétrie cubique, ou hélicoïdale ou mixte.
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2-DEFINITION:
Selon le biophysicien Loria:" Les virus sont des entités dont le génome est un élément d'acide nucléique, ADN ou ARN, qui se reproduisent à l'intérieur de cellules vivantes et qui utilisent les mécanismes synthétiques de ces cellules pour diriger la synthèse de particules spécialisées (les virions) qui contiennent le génome viral et le transmettent à d'autres cellules".
Symétrie cubique
IU
Symétrie hélicoïdale Protéines
structurales ARN
12:43
1
REMARQUE:
Virus = virion = particule virale infectieuse
13
En somme, les structures du virus autour de l'acide nucléique ont pour fonction de protéger le génome, de permettre au virus de se fixer sur un récepteur cellulaire, et c'est contre ces structures qu'est dirigée la réponse immunitaire.
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3- STRUCTURE DES VIRUS : Le virus est constitué :
♦ d'une seule espèce d'acide nucléique soit ADN soit ARN
♦ d'une structure protéique, la capside, qui protège l'acide nucléique; l'ensemble (acide nucléique+ capside) est appelé nucléocapside.
♦ parfois une enveloppe.
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3-1- Les génomes viraux:
bicaténaire, mais il existe des ADN viraux monocaténaires.
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♦ soit de I' ARN qui est habituellement monocaténaire, mais il existe des virus à ARN bicaténaire organisé en double hélice.
jamais les deux à la fois (ADN + ARN).
Les génomes viraux sont infectieux, mais ils ne peuvent s'exprimer que dans une cellule hôte. ,.
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gros en contiennent plusieurs centaines. Cette quantité d'information reste toutefois bien inférieure à celle contenue dans le génome des mammifères : une centaine de milliers de gènes.
Notons, pour le génome des mammifères que seulement 10% de I' ADN semble être codant alors que dans le cas des virus 90°/4 du matériel génétique est codant.
» 17
Les protéines de la capside sont agencées de manière symétrique dans une architecture
régulière. Les virus ont inventé 2 façons différentes de remplir cette condition de régularité: les capsides à symétrie icosaédrique (ou cubique) et les capsides à symétrie héliale (ou b~licoïdale). Il existe un 3e type de capside dit à symétrie mixte.
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1
3.::z_ Les capsides virales :
Le virion doit sa forme à sa capside qui constitue, à elle seule, la plus grande part de la masse de la particule virale. Elle est fabriquée à partir de protéines codées par les gènes viraux.
Il
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L'adsorption et la pénétration dans la cellule hôte du génome viral, est assurée par la capside ou l'enveloppe qui conditionnent donc le pouvoir infectieux.
Grâce à la microscopie électronique à transmission (1935), on a pu mettre en évidence 3 types de capsides:
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