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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Salmon, I. (1993). Contribution de la description quantitative du faciès chromatinien pour l'aide au diagnostic et au pronostic des tumeurs de la glande thyroïde et du système nerveux (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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V. ^

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Laboratoire d'HistoIogie de la Faculté de Médecine

Service d'Anatomie Pathologique de l'Hôpital Erasme

CONTRIBUTION DE LA DESCRIPTION QUANTITATIVE DU FACIES CHROMATINIEN POUR L'AIDE AU DIAGNOSTIC ET AU PRONOSTIC DES

TUMEURS DE LA GLANDE THYROÏDE ET DU SYSTEME NERVEUX.

wUOTHEQliî DE KEÜECIHE ■ CAMPUS ERASME Route de Leniiik, 808 (Bât. E - CP 607)

1070 BRUXELLES tf 555-61-70

Travail effectué en vue de l'obtention du titre d'Agrégé de l'Enseignement Supérieur

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE

Epreuve publique pour l'obtention du titre légal d'agrégé de l'enseignement supérieur

Mademoiselle Isabelle SALMON

Docteur en Médecine, Chirurgie et Accouchements

défendra publiquement le mardi 30 novembre 1993 à 18 heures, une thèse d'agrégation intitulée :

"CONTRIBUTION DE LA DESCRIPTION QUANTITATIVE DU FACIES

CHROMATINIEN POUR L'AIDE AU DIAGNOSTIC ET PRONOSTIC DE TUMEURS DE LA GLANDE THYROÏDE ET DU SYSTEME NERVEUX"

Mlle SALMON fera une leçon sur le sujet suivant :

"ADAPTATION DES METHODES DE DIAGNOSTIC ANATOMOPATHOLOGIQUE AUX TECHNIQUES MODERNES DE PRELEVEMENT"

Auditoire Bordet (local F2.304) route de Lennik 808 -1070 Bruxelles

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Laboratoire d'Histologie de la Faculté de Médecine

Service d'Anatomie Pathologique de l'Hôpital Erasme

CONTRIBUTION DE LA DESCRIPTION QUANTITATIVE DU FACIES CHROMATINIEN POUR L'AIDE AU DIAGNOSTIC ET AU PRONOSTIC DES

TUMEURS DE LA GLANDE THYROÏDE ET DU SYSTEME NERVEUX.

Volume I

Travail effectué en vue de l'obtention du titre d'Agrégé de l'Enseignement Supérieur

Isabelle Salmon

1993

REMERCIEMENTS

J'adresse mes remerciements les plus vifs au Professeur Jean-Lambert Pasteels qui m'a permis d'entreprendre ces travaux dans son Laboratoire et n'a cessé de me prodiguer ses en­

couragements et son aide.

Je remercie le Professeur Jacqueline Flament-Durand pour l'aide apportée au cours de ce travail.

J'aimerais également témoigner ma reconnaissance au Dr. Robert Kiss pour ses précieux conseils et sa bienveillance.

Je tiens à remercier le Professeur Jacques Brotchi ainsi que tous les membres du Ser­

vice de Neurochirurgie pour leur soutien constant.

J'ai bénéficié de nombreux conseils de la part du Professeur Pierre Vereerstraeten, qu'il en soit remercié.

Mes remerciements vont aussi à Thierry, Katja, Bob et Serge, dont l'enthousiasme et la gentillesse m'ont beaucoup aidée.

Que la Fondation Erasme trouve ici ma reconnaissance profonde pour la Bourse qui me fut accordée et sans laquelle ce travail n'aurait pu voir le jour.

Je remercie le Professeur Rodolphe Heimann pour l'acceuil qu'il m'a réservé dans son Service et la générosité avec laquelle il m'a initiée à la pathologie thyroïdienne.

J'ai bénéficié de la compréhension du Professeur Alain Verhest qui m'a octroyé le temps nécessaire pour la réalisation de mes travaux de recherche, qu'il en soit remercié.

THESE: VOLUME I

PLAN

I. BUT DU TRAVAIL (page 12).

IL INTRODUCTION (pages 13 - 39).

A. Recherche de marqueurs nouveaux en pathologie tumorale : généralités (pages 13 - 18).

B. L'outil informatique et statistique pour l'aide à la caractérisation de l'agressivité des cancers (pages 18 - 23).

1. La cytométrie de flux.

2. La cytophotométrie appliquée à la coloration de Feulgen.

C. Description de certains paramètres calculés par l'ordinateur et pouvant servir de marqueurs d'agressivité des tumeurs malignes (pages 23 - 25).

1. Les paramètres liés à la morphométrie du noyau cellulaire.

2. Les paramètres liés à la densitométrie du noyau cellulaire. Définition de la ploïdie.

3. Les paramètres liés à la texture, l'organisation et la distribution de la chromatine au sein du noyau cellulaire.

D. Choix des modèles d'étude (pages 26 - 39).

1. Description sommaire de la pathologie et de l'évolution clinique des lésions et tumeurs de la thyroïde étudiées dans le cadre du présent travail.

a. Les goitres multinodulaires.

b. Les adénomes.

c. Les cancers.

2. Description sommaire de la pathologie et de l'évolution clinique des lésions et tumeurs du système nerveux central et périphérique étudiées dans le cadre du présent travail.

a. Les tumeurs des nerfs périphériques.

b. Les méningiomes.

c. Les tumeurs astrocytaires.

III. MATERIELS ET METHODES (pages 40 - 66).

A. Les séries cliniques (pages 40 - 43).

1. Les lésions et tumeurs de la thyroïde.

2. Les lésions et tumeurs du système nerveux central et périphérique.

B. Obtention des préparations cytologiques (pages 44 - 45).

1. A partir de ponctions à l'aiguille fine.

2. A partir d'empreintes de tissus fraîchement prélevés.

3. A partir de matériel d'archives.

C. Coloration des préparations (pages 45 - 46).

1. Principe de la coloration de Feulgen et Rosenbeck.

2. Exploitation de la coloration par un analyseur d'images.

D. L'outil d'analyse: l'analyseur d'images (pages 47 - 59).

1. Description physique de l'analyseur d'image.

2. Principes de segmentation et de numérisation de l'image.

3. Description des paramètres calculés par l'ordinateur.

a. La taille nucléaire.

b. La densitométrie du noyau.

b. 1. Le calcul du taux de ploïdie.

b.2. Le typage de l'histogramme d'ADN.

b.3. Le calcul de l'indice de prolifération.

c. Le faciès chromatinien.

E. Description sommaire des analyses mathématiques et statistiques (pages 60-66).

1. L'analyse monovariée (l'analyse de la variance).

2. L'analyse multivariée: les analyses en composantes principales avec transfor­

mations canoniques, suivies d'analyses discriminantes.

3. Les tests de corrélations.

4. Le modèle de Cox.

IV. RESULTATS (pages 67 - 99).

A. Etudes quant à la reproductibilité des résultats obtenus (pages 67 - 74).

1. Influence des techniques de laboratoire (annexe 1).

2. Influence du mode de prélèvement des échantillons biologiques.

a. La ponction à l'aiguille fine versus l'empreinte de cancers du sein (annexe 2).

b. Evaluation du taux de ploïdie sur du matériel cytologique obtenu par prélèvement stéréotaxique de tumeurs cérébrales (annexe 3).

B. Les lésions et les tumeurs de la thyroïde (pages 75 - 85).

1. Etude de l'évolution des paramètres chromatiniens au sein de lésions tumorales bénignes et malignes et de lésions péritumorales (annexe 4).

2. Caractérisation des paramètres morphonucléaires des lésions malignes de la thyroïde (annexe 5).

3. Caractérisation des paramètres morphonucléaires de lésions potentiellement

"pré-malignes" de la thyroïde (annexe 6).

4. Apport de la mesure de la ploïdie et du taux de prolifération pour la caractérisation des tumeurs thyroïdiennes (annexe 7).

C. Les lésions et tumeurs du système nerveux central et périphérique: apport des mesures morphométriques et densitométriques quant à la caractérisation de l'agressivité de ces tumeurs (pages 86 -99).

1. Mesure de l'indice d'ADN et détermination du type d'histogramme d'ADN des tumeurs de type PNET (annexe 8).

2. Mesures de la taille nucléaire, de la ploïdie et de l'indice de prolifération des

3. Mesures de la taille nucléaire, de la ploïdie et de l'indice de prolifération des méningiomes (annexe 10).

4. Description du faciès chromatinien des méningiomes (annexe 11).

5. Valeur diagnostique de la mesure de la ploïdie sur une série de 709 tumeurs du système nerveux central et périphérique (annexe 12).

6. Mesure de la ploïdie dans les tumeurs astrocytaires: comparaison de la valeur pronostique de l'indice d'ADN à celle de l'histogramme d'ADN (annexe 13).

7. Etablissement d'un score pronostique dans les tumeurs astrocytaires lié au type d'histogramme d'ADN de la tumeur, à son grade anatomopathologique et à l'âge du patient (annexe 14).

8. Relation entre type d'histogramme d'ADN et taux de prolifération dans les tumeurs du système nerveux central et périphérique (annexe 15).

V. DISCUSSION (pages 100 - 119).

A. Justification du choix de l'analyse d'image comme outil d'investigation (pages 1(X) - 102).

B. La méthode de Feulgen (pages 102 - 103).

C. Discussion des paramètres morphométriques utilisés (pages 103 - 106).

1. Taille des noyaux.

2. Teneur des noyaux en ADN.

a. Indice de prolifération.

b. DNA index (DI).

c. Profil de ploïdie de la tumeur.

3. Texture de la chromatine.

D. Justification du choix des modèles pathologiques (pages 106 - 107).

E. Résultats probants obtenus vis-à-vis des pathologies thyroïdiennes (pages 107 - 111

).

F. Résultats probants obtenus vis-à-vis des pathologies du système nerveux central et périphérique (pages 111 - 116).

G. Conclusions et perspectives (pages 116 - 118).

VI. REFERENCES (pages 119 - 128).

THESE: VOLUME II (ANNEXES)

ANNEXE n°l:

Kiss R, Salmon I, Camby I, Gras S, Pasteels JL: Characterization of the factors in routine laboratory protocols which significantly influence the Feulgen reaction. J Histochem Cytochem, sous presse, 1993.

ANNEXE n°2:

Salmon I, Coibion M, Larsimont D, Badr-El-Din H, Verhest A, Pasteels JL, Kiss R: Fine needle aspirations of breast cancers compared to imprint smears by means of digital cell image analysis. Anal Quant Cytol Histol, 13:193-200, 1991.

ANNEXE n°3:

Salmon I, Levivier M, Camby I, Rombout K. Gras T, Pasteels JL, Brotchi J, Kiss R: Assess- ment of nuclear size, nuclear DNA content and prolifération index heterogeneities in stereotaxic biopsies from brain tumors. Soumis pour publication dans "Neuropathology & Ap­

plied Neurobiology" en février 1993.

ANNEXE n°4:

Salmon I, Kiss R, Franc B, Gasperin P, Heimann R, Pasteels JL, Verhest A: Comparison of morphonuclear features in normal, benign, and neoplastic thyroid tissues by digital cell image analysis. Anal Quant Cytol Histol, 14:47-54, 1992.

ANNEXE n°5:

Collin F, Salmon I, Rahier I, Pasteels JL, Heimann R, Kiss R: Quantitative morphonuclear cell image analyses of thyroid tumors from archivai material. Hum Pathol, 22:191-196, 1991.

ANNEXE n°6:

Salmon I, Gasperin P, Pasteels JL, Heimann R, Kiss R: Relationship between histopathologie typing and morphonuclear assessments of 238 thyroid cases: Digital cell image analysis per- formed on Feulgen-stained nuclei from formalin-fixed paraffm-embedded materials. Am J Clin Pathol, 97:776-786, 1992.

ANNEXE n°7:

Salmon I, Gasperin P, Remmelink M, Rahier I, Rocmans P, Pasteels JL, Heimann R, Kiss R:

Ploidy level and proliférative activity measurements in a sériés of 407 thyroid tumors or other pathological conditions. Hum Pathol, sous presse, 1993.

ANNEXE n°8:

Dangou JM, Salmon I, Moreira C, Budel V, Demba Ndiaye P, Pasteels JL, Verhest A, Kiss R: DNA histogram typing in retinoblastoma and neuroblastoma. Modem Pathol, sous presse,

1993.

ANNEXE n°9:

Salmon I, Kiss R, Segers V, Carroyer JM, Levivier M, Pasteels JL, Brotchi J, Flament- Durand J: Characterization of nuclear size, ploidy, DNA histogram type, and prolifération in­

dex in 79 nerve sheath tumors. Anticancer Res, sous presse, 1993.

ANNEXE n°10:

Salmon I, Kiss R, Levivier M, Remmelink M, Pasteels JL, Brotchi J, Flament-Durand J:

Characterization of the nuclear DNA content, prolifération index and nuclear size in a sériés of 181 meningiomas, including benign primary, récurrent, and malignant tumors. Am J Surg Pathol, sous presse, 1993.

ANNEXE n°ll:

Salmon I, Camby I, Rombout K, Gras T, Pasteels JL, Kiss R: The use of digital cell image analysis of Feulgen-stained nuclei to quantitatively describe morphonuclear heterogeneities in a sériés of 174 meningiomas. Soumis pour publication dans "The Journal of Neurocytology" en février 1993.

ANNEXE n°12:

Salmon I, Kruczynski A, Camby I, Levivier M, Pasteels JL, Brotchi J, Kiss R; DNA his­

togram typing in a sériés of 707 tumors of the central and peripheral nervous Systems. Am J Surg Pathol, sous presse, 1993.

ANNEXE n°13:

Salmon I, Kiss R, Dewitte O, Gras T, Pasteels JL, Brotchi J, Flament-Durand J: Relationship between histopathological grading and DNA ploidy as opp>osed to survival in 206 astrcxytic tumors. Cancer, 70:538-546, 1992.

ANNEXE n°14:

Salmon I, Dewitte O, Pasteels JL, Flament-Durand J, Brotchi J, Vereerstraeten P, Kiss R:

Setting up of prognostic scores in adult gliomas using patient âge, histopathological grading, and DNA histogram type. Soumis pour publication dans "Cancer" en août 1992.

ANNEXE n°15:

Salmon I, Kiss R: Relationship between proliférative activity and ploidy level in a sériés of 530 human brain tumors including astrocytomas, meningiomas, schwannomas, and métastasés.

Hum Pathol, sous presse, 1993.

ABREVIATIONS LES PLUS COURAMMENT UTILISEES

ADN : Acide désoxyribonucléique.

C : Contraste (paramètre n°15).

CV : Variance des coefficients de la matrice (paramètre n°14).

D-Q : Diff-Quik.

DI : DNA index.

DOI : Densité optique intégrée (paramètre n°2).

DOM : Densité optique moyenne (paramètre n°3).

E : Energie (paramètre n°13).

GLD : "Gray level distribution" (paramètre n°9).

HE : Hématoxiline-éosine.

lOD : "Integrated optical density" (paramètre n°2).

K : indice de Kurtosis (paramètre n°6).

LM : "Local mean" (paramètre n°12).

LRL : "Long run length emphasis" (paramètre n°8).

NA : "Nuclear area" (paramètre n°l).

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

RLD : "Run length distribution" (paramètre n°10).

RLP : "Run length percentage" (paramètre n°ll) . SK : indice de Skewness (paramètre n°4).

SRL : "Short run length emphasis" (paramètre n°7).

SURF: Surface (paramètre n°l).

VOD : Variance des densités optiques (paramètre n°5).

I. BUT DU TRAVAIL.

Les critères histologiques permettant de poser un diagnostic de malignité sont décrits par de nombreux pathologistes. Parmi ces critères, l'organisation de la chromatine et le dessin nucléaire qui en résulte sont prépondérants. Ils interviennent également comme facteurs de pronostic puisqu'ils sont repris dans de nombreux gradings histologiques. Il est vrai que l'utilisation pratique de ces différents critères s'est révélée efficace pour de nombreuses pathologies, comme par exemple pour le grading des cancers prostatiques et celui des cancers astrocytaires. En revanche, ces critères ne sont pas applicables à certains groupes de tumeurs, tels les méningiomes et les tumeurs endocrines. Depuis toujours les pathologistes ont appliqué aux prélèvements histologiques différentes techniques dans le but d'améliorer leur diagnostic et de trouver de nouveaux facteurs pronostiques. Ils évaluent par exemple le degré de différenciation tumorale par immunohistochimie ou l'hormonosensibilité d'une tumeur mam­

maire en dosant les récepteurs d'oestrogènes.

Depuis une dizaine d'années le noyau cellulaire et plus particulièrement son contenu en ADN ont suscité beaucoup d'intérêt. Ce dosage de l'ADN, appelé également mesure de la ploïdie, peut être obtenu à l'aide de deux techniques différentes: la cytométrie de flux et l'analyse informatisée de l'image nucléaire. L'analyse informatisée de l'image nucléaire permet également de caractériser le faciès chromatinien.

Le but du présent travail est d'utiliser l'analyse informatisée de l'image nucléaire afin de proposer de nouveaux critères diagnostiques et pronostiques en cancérologie. Les modèles biologiques retenus ici sont les tumeurs de la glande thyroïde et du système nerveux central et périphérique. L'originalité du travail a consisté en l'utilisation de paramètres morphonucléaires soumis à des analyses mathématiques et statistiques relativement sophistiquées. Nous proposons ce type de technologie dans le but de réduire la subjectivité du pathologiste face à certains cas.

Les résultats que nous rapportons dans le présent travail montreront que certains problèmes pathologiques ont pu être résolus grâce à cette technologie. Nous avons de plus découvert une nouvelle entité biologique, la tumeur dégénérescente.

IL INTRODUCTION.

A. RECHERCHE DE MARQUEURS NOUVEAUX EN PATHOLOGIE(S) LIEE(S) AU(X) CANCER(S): GENERALITES.

Certaines formes de cancers étaient déjà reconnues dans la médecine de l'Antiquité. Par exemple, Hippocrate en donnait une description précise et Galien les distinguait par leur dureté, leur fixité et les douleurs qui en dérivaient. Ces affections furent considérées pendant des siècles comme un écoulement d'humeurs organiques et ce n'est qu'au XVIIème siècle, avec le développement de l'anatomie pathologique, que l'on s'aperçut que le cancer était la résultante d'une croissance anarchique des tissus. Au cours du siècle dernier, les perfectionne­

ments apportés au microscope et aux techniques histologiques ont permis de différencier les tumeurs d'après les tissus qui les composent. Ceci a conduit à l'établissement des premières classifications morphologiques et d'une nomenclature encore utilisée aujourd'hui. Elles ont été perfectionnées plus récemment par l'établissement de critères tentant de les départager en fonc­

tion de leur malignité croissante (grading). Citons pour exemple la classification proposée par Bloom & Richardson en 1957 pour les cancers mammaires.

Comme le soulignent de nombreux ouvrages de vulgarisation sur l'histoire de la médecine, c'est vers la fin du siècle dernier que les premières théories étio-pathogéniques ont été proposées. A titre d'information, signalons que Jules Cohnheim (1839-1884) soutint la théorie du cancer à partir de résidus embryonnaires restés isolés dans l'individu adulte. Récemment, Conway (1983) proposait un parallèle entre le développement du placenta et de certains can­

cers. Virchow (1821-1902) voyait l'origine de certains cancers dans l'irritation chronique des tissus alors que Charles Thiersch (1821-1895) considérait les tumeurs comme étant une maladie de nature dégénérative. Aujourd'hui la recherche s'intéressant à la compréhension des mécanismes sous-jacents à la genèse du (des?) cancer(s) fait surtout appel à des techniques de biologie moléculaire. La découverte des premiers oncogènes vers le début des années 1980 a laissé entrevoir pendant un court laps de temps la possibilité d'effectuer un bond prodigieux dans la compréhension de la genèse des cancers. Aujourd'hui, plus de cent oncogènes ont été découverts et il est très difficile pour la plupart d'entre eux de savoir s'ils agissent en tant que

"cause" ou "conséquence" de la néoplasie à laquelle ils sont associés (Schultz & Vande Woude, 1991). La situation est plus nette en ce qui concerne les "gènes suppresseurs" RB et P53 qui, lorsqu'ils sont mutés, permettent le développement de divers cancers (Hollingsworth

& Lee, 1991; Livingstone et coll., 1992).

La figure ci-dessous, présentée lors d'une réunion récente de l'EMBL (European Molecular Biology Laboratory), illustre de manière un peu simpliste la façon dont un biologiste

cer. On y compare l'étude des oncogènes pratiquée par le biologiste moléculaire au travail d'un ingénieur qui analyserait les microprocesseurs défectueux d'une carte informatique. En prolongeant la comparaison, on peut dire que dans ce travail nous considérons également les cancers comme des maladies "dégénératives de l'ordinateur central" qu'est le noyau cellulaire.

Notre approche en tant que morphologiste intéresse toutefois les différents composants de cet ordinateur traités dans leur ensemble. Nous développerons cet aspect ci-dessous.

riNrnccNCC ONn rnnnTii rniMTnm

ui iLuuciiCD nu U biKuUIrl LuHTRuL

EMBL Heidelberg 13-16 April 1992

Figure 1: représentation symbolique de l'approche du biologiste moléculaire face aux mécanismes régulant la prolifération cellulaire normale ou tumorale. Chaque gène contrôlant la prolifération cellulaire (myc, erb, nif, etc...) est symbolisé par un microprocesseur.

Ce bref survol de l'évolution des connaissances liées à la genèse des cancers montre que de nombreuses théories ont été élaborées et ont parfois abouti à des thérapies efficaces. Malgré le taux de mortalité important qui l'affecte, cette maladie ne doit pas être considérée comme in­

curable. En effet, à l'heure actuelle on peut espérer obtenir une rémission complète de certains cancers à condition de traiter les patients à un stade précoce de l'évolution de la maladie. Il faut donc que le pathologiste définisse le plus rapidemment et le plus exactement piossible l'agressivité du cancer analysé afin d'appliquer la thérapie la plus appropriée.

De nombreuses techniques sont utilisées à cette fin. Citons à titre d'exemple le dosage biochimique des récepteurs d'oestrogènes pour les cancers du sein visant à orienter le choix entre une chimiothérapie agressive ou une hormonothérapie douce (Paridaens et al., 1987) ou l'application de l'immunohistochimie pour le typage précis et l'évaluation du pronostic des différentes classes de lymphomes (Delsol et colL, 1988).

La mesure de la ploïdie des tumeurs a été proposée comme critère objectif de gradation de leur malignité (Atkin et coll., 1979; Barlogie et coll., 1983). Rappelons qu'au sens strict la ploïdie d'une cellule définit le nombre de fois que son noyau contient la garniture chromosomiale haploïde, qui est spécifique de l'espèce (23 chromosomes chez l'homme). Les gamètes sont haploïdes, la plupart des cellules somatiques sont diploïdes mais, si l'on se réfère à la quantité d'ADN qu'elles contiennent, elles deviennent tétraploïdes en phase G2.

En cancérologie, la mesure du taux de ploïdie est basée sur le dosage de la quantité d'ADN présente dans les noyaux cellulaires. Soit c la quantité d'ADN contenue dans un noyau haploïde normal. Une population cellulaire sera dite diploïde lorsque la valeur moyenne de la teneur des noyaux est proche de 2c, compte tenu de l'existence d'une proportion de cellules 4c en phase G2. Elle sera tétraploïde pour des valeurs doubles, octoploïde pour des valeurs encore doublées. Comme ces valeurs peuvent être rencontrées dans des tissus normaux, on qualifie ces cellules d'euploïdes. En revanche, dans les tissus tumoraux, bénins et malins, on peut trouver des cellules aneuploïdes en proportions variables. Ces cellules aneuploïdes seront triploïdes, c'est-à-dire possédant trois jeux de chromosomes ou 3c quantité d'ADN, pentaploïdes. c'est-à-dire possédant cinq jeux de chromosomes ou 5 c quantité d'ADN, etc...

Une telle qualification des noyaux cellulaires en termes de nombre de chromosomes ou de quantité d'ADN exprimée en unités arbitraires s'appelle la mesure de la ploïdie, permettant de définir le taux de ploïdie d'un tissu. Nous sommes conscients du fait que cette définition de la ploïdie par le taux d'ADN n'est qu'une approximation de celle qui est basée sur le nombre de garnitures chromosomiales normales car elle ne tient pas compte de la possibilité de perte ou de duplication d'un chromosome isolé ou d'une partie de chromosome. Nous devons toutefois

nous y rallier dans ce travail car elle est consacrée par l'usage systématique qui en est fait dans la littérature. Qu'il soit donc bien convenu que dans le présent travail, la "ploïdie" est définie par le taux d'ADN selon l'usage en cancérologie.

Comme nous le verrons plus loin, la cytométrie de flux, qui est la méthode la plus utilisée pour la détection de la ploïdie des tumeurs, ne permet qu'une mesure globale de la teneur moyenne en ADN sans détection précise des cellules de ploïdie différente et sans contrôle visuel de chaque cellule.

L'originalité de la technique de cytophotométrie que nous utilisons dans ce travail est qu'elle permet un dosage individuel de la quantité d'ADN contenue dans chaque noyau cellulaire, ce qui a attiré notre attention sur l'hétérogénéité des tumeurs. Bon nombre d'entre elles sont constituées de plusieurs populations cellulaires de ploïdie différente (Kruczynski et colL, 1992;

Jannot et coll., 1993). La définition de l'hétérogénéité des structures est le principal progrès qu'apporte l'approche morphologique. Nous verrons qu'elle présente des avantages non négligeables, à condition bien entendu qu'elle ne prétende pas se substituer aux autres méthodes de la biologie cellulaire, mais qu'elle vienne y apporter un complément, parfois es­

sentiel. Nous avons pu constater en effet que lors de l'évolution d'une tumeur, la proportion des populations cellulaires de ploïdie différente change, ce qui suggère que la tumeur est constituée à ce stade de plusieurs clones évoluant de manière asynchrone (Kruczynski et coll.,

1992; Jannot et coll., 1993).

La figure 2 a été établie pour prolonger la comparaison proposée dans la figure 1, en l'appliquant à la ploïdie des tumeurs. Le tissu tumoral schématisé dans le bas de la figure con­

tient non seulement des noyaux "normaux 2C" comme le tissu normal dont il est issu, mais aussi des noyaux anormaux. Il est à souligner qu'un noyau 2C au sein d'une tumeur peut apparaître normal en termes de quantité d'ADN alors qu'il possède déjà des anomalies chromosomiques que l'on ne peut détecter par la présente approche méthodologique.

Dans la figure 2, les noyaux normaux (diploïdes) sont symbolisés par un même type d'ordinateur. Les "gros" noyaux anormaux (noyaux aneuploïdes) sont symbolisés soit par de gros ordinateurs soit par plusieurs ordinateurs. En d'autres termes, un même taux de ploïdie pourrait conférer au noyau cellulaire des fonctionnalités différentes. Ainsi, le noyau "5C-A" de la figure 2 peut correspondre à un noyau parfaitement fonctionnel puisque "entier", alors que le noyau "5C-B", constitué de fragments d'ordinateurs, serait dégénérescent.

Un des buts poursuivis dans la présente thèse est d'essayer de discriminer les taux d'agressivité de ces deux types de noyaux anormaux. En d'autres termes, un type particulier de noyaux anormaux caractérisé par une forme déterminée d'aneuploïdie pourrait conférer à la tumeur des propriétés de dégénérescence qui en améliorent le pronostic.

Figure 2; représentation symbolique de notre approche du problème de la prolifération tumorale. Chaque noyau cellulaire est symbolisé par un type d'ordinateur. La partie supérieure de la figure représente un tissu normal constitué de cellules ("ordinateurs") diploïdes (2C). La partie inférieure représente un tissu tumoral constitué de cellules diploïdes (2C) et de cellules

Nous estimons de plus que l'agencement de ces "gènes-microprocesseurs" qui se traduit par un dessin chromatinien peut également app>orter une information précieuse quant au degré de différenciation et/ou d'agressivité d'un cancer. Rappelons qu'empiriquement les différentes classifications histologiques des tumeurs utilisent l'aspect de la chromatine comme critère dis­

criminant les groupes de pronostic différent. Nous avons évalué un tel paramètre par le biais de la caractérisation de la texture de la chromatine de noyaux cellulaires colorés selon la méthode de Feulgen et Rosenbeck (1924). Enfin, nous estimons que le volume dans lequel est enfermé tout ce "matériel informatique", c'est-à-dire la taille du noyau est également porteur d'information. Nous y avons accédé par le calcul de la "surface nucléaire".

Deux techniques majeures sont offertes aujourd'hui à l'expérimentateur pour réaliser ce type de mesure: ce sont la cytométrie de flux et la cytophotométrie.

La première permet l'analyse d'un très grand nombre de cellules pour un échantillon donné, à savoir de quelques milliers à quelques dizaines de milliers, tandis que la seconde se limite à l'analyse de quelques centaines à quelques milliers de cellules par échantillon analysé. En revanche, la première technologie ne permet pas de contrôler visuellement l'échantillon analysé, alors que la seconde le permet aisément.

B. L'OUTIL INFORMATIQUE ET STATISTIQUE POUR L'AIDE A LA CARACTERISATION DE L'AGRESSIVITE DES CANCERS.

1. La cytométrie de flux.

La cytométrie de flux fut mise au point par un ingénieur d’IBM au début des années 1960 (Katmentsky, 1965). Le principe général de la cytométrie de flux est illustré dans la figure 3. Ce principe consiste à incuber des cellules en présence de molécules ayant une forte affinité pour l'ADN, c’est-à-dire dotées d'un mécanisme d'action de type "intercalant". Les molécules les plus utilisées sont le bromure d'ethydium ou bien un dérivé de la proflavine, l'acridine orange. Ces molécules sont capables "d'autofluorescence" (Melamed et colL, 1991).

En d'autres termes, il suffit de les exciter par un rayonnement laser pour obtenir en retour un signal de fluorescence, qui à son tour peut être quantifié par des capteurs appropriés (voir figure 3). Ainsi, ces molécules intercalantes qui vont se fixer de manière stoechiométrique, c'est-à-dire de manière quantitative, sur l'ADN, vont offrir, après excitation au laser, une in­

tensité lumineuse directement proportionnelle au matériel absorbant, dans le cas présent l'ADN (Melamed et colL, 1991).

On a coutume d'exprimer les résultats de façon relative, c'est-à-dire par rapjxjit à un "standard diploïde externe", à savoir des lymphocytes humains ou des érythrocytes de poulet (Melamed et coll., 1991).

Figure 3: représentation schématique d'un cytomètre de flux.

Myron Melamed, jeune pathologiste du Memorial Sloan-Kettering Cancer Center de New-York, comprit immédiatement les retombées importantes que ce type de technologie pourrait apporter au domaine de l'anatomie pathologique. Il fut le premier à appliquer avec succès cette technologie "du futur" à l'étude de la biologie de cellules vivantes, normales ou pathologiques (Katmentsky et coll., 1965; Katmentsky & Melamed, 1967; Koenig et coll., 1967). Hedley et ses collaborateurs (1983) ont mis au point une technique permettant de travailler sur du matériel d'archive, ce qui a permis d'établir des corrélations précises entre le taux de ploïdie d'un type de cancer donné et son agressivité; en effet leur technique permet d'utiliser rétrospectivement le matériel histologique collecté depuis de nombreuses années, pour lequel l'évolution clinique des patients était connue a posteriori. Jusqu'alors, seules les études prospectives étaient réalisées et la corrélation clinique nécessitait de nombreuses années.

Citons également les travaux de l'équipe de Barlogie qui a défini le "DNA index", lequel DNA index vaut 1.00 unité arbitraire dans le cas d'un tissu diploïde et, par définition, 2.00 unités arbitraires dans le cas d'un tissu tétraploïde (Barlogie et colL, 1983). Ce DNA index reste aujourd'hui l'unité la plus utilisée dans la littérature scientifique p>our exprimer le taux de ploïdie d'une tumeur. Néanmoins, comme le démontreront nos résultats, cette mesure ne représente qu'une "mesure moyenne" de la quantité d'ADN au sein d'une tumeur et introduit par conséquent un biais vis-à-vis de la notion d"hétérogénéité cellulaire" de la tumeur, notion pourtant combien importante quant à la relation entre l'agressivité d'un type de cancer donné et l'évolution clinique du patient qui en est atteint (De Vitta et coll., 1989).

Au début des années 1980, les travaux du groupe de recherche auquel appartenaient Barlogie et Andreeff laissaient entrevoir la possibilité d'établir une "empreinte digitale" de l'agressivité des cancers en termes de mesure de leur taux de ploïdie (Barlogie et coll., 1983). Avec le recul apporté par près de trois décennies de recherches intensives, depuis les travaux de pion­

nier de Melamed dans ce domaine, il se révèle qu'aucune règle absolue ne peut être établie entre l'agressivité du cancer, au sens global du terme, et son taux de ploïdie (Auer et coll., 1989; Koss et coll., 1989; Wied et coll., 1989). En revanche, pour certaines entités anatomocliniques, une telle relation a pu être démontrée. Pour exemples, il a été clairement établi que dans le cas des cancers de la vessie (Tribukait, 1987), du colon et du rectum (Chang et coll., 1987; Giaretti et coll., 1991; Kouri et coll., 1990) et de l'ovaire (Miller et coll., 1991), l'aneuploïdie s'accompagne d'un mauvais pronostic. A l'inverse, en ce qui concerne les neuroblastomes de l'enfant, les tumeurs aneuploïdes s'avèrent très significativement moins agressives que les tumeurs euploïdes, et plus précisément que les diploïdes (Taylor & Locker,

1990) . Dans le cas des tumeurs de la thyroïde, il semblerait qu'aucune règle générale ne puisse être tirée, puisque certaines tumeurs bénignes s'avèrent autant, sinon plus, aneuploïdes que leurs congénères malignes (Joensuu et coll., 1986; Johannessen et coll., 1982). Enfin, dans le cas du cancer du sein, les données de la littérature sont totalement contradictoires (Frierson,

1991) .

2. La cvtoDhotométrie appliquée à la coloration de Feul²en,

C'est la recherche menée de manière intensive dans trois domaines totalement indépendants qui a conduit à la création et au développement des analyseurs d'images modernes tels que le SAMBA (Alcatel-TITN, France) et le CAS (Becton-Dickinson, USA).

Ces trois domaines, outre la cytophotométrie elle-même, concernent d'une part la recherche dans le domaine de l'informatique, d'autre part, l'étude des nombreux paramètres qui peuvent influencer la coloration de Feulgen.

Ce sont des recherches militaires qui ont conduit à la "découverte" de l'ordinateur et de ses applications telles que nous les connaissons aujourd'hui (Leprince-Ringuet, 1991). En ef­

fet, von Neumann se vit confier par Oppenheimer, au Laboratoire de Los Alamos, la respion- sabilité de mettre au point des techniques permettant de faire face aux calculs colossaux liés à l'aventure de la recherche atomique (von Neumann, 1992). Le premier ordinateur était né.

Nous utilisons l'informatique à deux niveaux dans nos recherches. Le premier niveau concerne la transformation (numérisation) des images analogiques en images numériques. Le second niveau concerne le traitement mathématique des données (analyses en composantes principales, transformations canoniques des données, analyses discriminantes, etc...). La puissance de l'ordinateur dont nous disposons conditionne directement la précision de nos analyses. A titre d'information, quand nous avons commencé, en 1988, les recherches qui ont conduit au présent travail, nous travaillions sur un analyseur d'image équipé d'un ordinateur de type

"Victor AT/286 xxMHz". Aujourd'hui, en 1993, ces mêmes analyseurs d'images sont équipés d'ordinateurs de type "Compaq 486/33MHz" et les calculs se font sur une "station périphérique" de type "SUN/SPARC". Pour les profanes dont je fais partie, cela signifie simplement, vu la mémoire vive du Victor, qu'il nous était impossible de calculer simultanément les 15 paramètres morphonucléaires (dont il sera maintes fois question dans le présent travail) d'un groupe de noyaux contenant plus de 2500 individus. De plus les calculs (analyses en composantes principales) prenaient quelques heures. Aujourd'hui il ne faut que quelques secondes pour calculer le pouvoir discriminant de 50 variables sur un ensemble de noyaux cellulaires contenant plus de 100000 individus. Nous mentionnons ceci simplement dans le but d'attirer l'attention du lecteur sur le fait que la façon dont nous avons abordé cer­

tains problèmes était en partie conditionnée par la "qualité" de l'informatique associée à l'analyseur d'image. Je pense qu'un des points forts du groupe de recherche dans lequel j'ai travaillé est d'avoir constamment introduit au laboratoire l'informatique dite de pointe et d'y avoir adapté les logiciels en conséquence.

Le second domaine qui a conduit à la naissance de l'application de la cytophotométrie à la coloration de Feulgen concerne bien entendu cette dernière. Ce sont en fait Feulgen et Ros- senbeck qui mirent cette coloration au point en 1924. Aujourd'hui, près de 70 ans après la découverte de cette coloration, il n'existe toujours pas de protocole parfaitement établi pour la réaliser. On peut en effet modifier par exemple la température d'hydrolyse ainsi que la con­

centration des réactifs, ou bien la qualité du colorant utilisé pour le réactif de Schiff (voir Giroud & Montmasson, 1989). Rappelons que la chromatine présente des régions dont le degré de condensation peut être très variable au sein d'un même noyau cellulaire. Ainsi, du point de

condensée (hétérochromatine) ou décondensée (euchromatine). Comme on peut s'en douter, l'hétérochromatine et l'euchromatine présentent des sites d'accessibilité variable au réactif de Schiff après hydrolyse acide, car cette dernière agit plus facilement sur l'euchromatine que l'hétérochromatine (Giroud & Montmasson, 1989). Le même type de problème, à savoir l'accessibilité du noyau à la molécule "colorante" en fonction de la condensation de la chromatine, se présente lorsqu'on utilise la cytométrie de flux (Dressler & Bartow, 1989).

Signalons aussi que l'équipe de recherche dans laquelle j'ai travaillé, et qui s'intéresse particulièrement à la coloration de Feulgen en termes de validation, de spécificité et de reproductibilité de la méthodologie, a montré qu'il était impossible d'utiliser du matériel d'archive conservé dans le liquide de Bouin dont l'un des constituants, l'acide picrique, hydrolyse partiellement et de manière anarchique l'ADN bien avant l'étape d'hydrolyse effectuée spécifiquement dans le cadre de la coloration de Feulgen (de Launoit et colL, 1990).

Enfin, le troisième domaine concerne la cytophotométrie proprement dite. Ce troisième aspiect de la cytophotométrie concerne les organes permettant la numérisation des images. Ces organes correspondaient à des photomultiplicateurs à miroirs vibrants vers la fin des années 1970 (Brugal et coll., 1979). Aujourd'hui ces organes de numérisation correspondent à des caméras placées sur les sorties "photo" des microscopes.

Comme nous ne nous sommes intéressés, dans le présent travail, qu'à un seul aspect de l'analyse informatisée de l'image d'objets biologiques, à savoir celle de noyaux cellulaires colorés selon la méthode de Feulgen, nous nous sommes restreints à cette seule application quant aux définitions suivantes. La cytophotométrie est fondée sur la mesure, en chaque point d'un noyau observé au travers d'un microscope, de la quantité de lumière absorbée ou émise.

En itérant la mesure, par balayage de tous les points du noyau et du fond qui l'entoure, son image peut être représentée sous la forme d'une matrice numérique qui sera traitée par l'ordinateur selon les étapes suivantes:

l'acquisition des images nucléaires à l'aide de capteurs (caméras);

le prétraitement de l'image qui permet d'améliorer ses contrastes et de calculer les paramètres photométriques de référence du fond;

*

la paramétrisation de l'image qui permet de calculer pour chaque noyau des paramètres caractérisant sa taille, sa densitométrie et sa texture;

* le traitement des données qui permet d'extraire, parmi les 15 paramètres calculés sur les noyaux d'une population cellulaire, ceux qui présentent une variation statistique­

ment significative.

L'analyseur d'image que nous avons utilisé est composé d'organes d'acquisition des images microscopiques et d'organes de traitement de ces images. Le type d'appareillage utilisé est décrit en détails dans le chapitre Matériels et Méthodes.

C. DESCRIPTION DE CERTAINS PARAMETRES CALCULES PAR L'ORDINATEUR ET POUVANT SERVIR DE MARQUEUR

D'AGRESSIVITE DES TUMEURS MALIGNES.

1. Les paramètres liés à la morphométrie du noyau cellulaire.

Il existe de nombreux paramètres pour décrire la morphométrie du noyau cellulaire. On peut par exemple décrire la "forme d'un noyau" en utilisant le paramètre "périmètreVsurface"

(Brugal et colL, 1979) ou bien en mesurant sa "plus grande longueur" (Baak et colL, 1982).

Nous n’avons utilisé qu'un seul paramètre pour décrire la morphométrie des noyaux cel­

lulaires. Ce paramètre correspond à la "taille" du noyau. Cette taille correspond en fait à la surface (en nombre de "point-images" ou "pixels") ocupée par la projection du noyau cellulaire sur la lame histologique. Le calcul de ce paramètre est détaillé dans le chapitre Matériels et Méthodes.

Rappelons que ce type de paramètre morphométrique fut utilisé avec succès par divers groupes de recherche, dont celui auquel j'appartiens, pour discriminer entre diverses pathologies du sein (Baak et colL, 1982; Larsimont et colL, 1989b), du colon (Ambros et colL, 1990), de la thyroïde (Lee et colL, 1987), de la vessie (DePrez et colL, 1990; Levi et colL, 1969) ou de la prostate (Bibbo et colL, 1990; Petein et colL, 1990).

2. Les paramètres liés à la densitométrie du noyau cellulaire.

Par définition, nous avons considéré comme "densitométriques" uniquement les paramètres qui permettent l'évaluation de la quantité d'ADN nucléaire. Ils sont principalement au nombre de deux, à savoir la densité optique intégrée (DOI) et la densité optique moyenne (DOM). Leur calcul est défini dans le chapitre Matériels et Méthodes qui montre de plus que le paramètre DOI permet également d'avoir accès au calcul du taux de ploïdie (voir paragraphe b.l page 52) et à celui du taux de prolifération. Ce paramètre DOI est l'équivalent du

première fois par Barlogie et coll. (1983). Ainsi, il est possible de décrire le contenu en ADN des noyaux tumoraux de manière "machine-indépendante", c’est-à-dire soit par le biais de l'analyse de la cytométrie de flux, qui permet le calcul du paramètre DI, soit par le biais de l'analyse d'image, qui permet le calcul du paramètre DOI.

3. Les paramètres liés à la texture, l'organisation et la distribution de la chromatine au sein du noyau cellulaire.

Comme le rappelle Giroud dans sa thèse de doctorat (Giroud, 1987), "il est important de noter que parmi les particularités reconnues dans les cellules par les cytologistes et les anatomopathologistes, nombreuses sont celles qui résultent d'une description détaillée de l'organisation, au sein du noyau cellulaire, des différentes entités colorées. Le morphologiste introduit ainsi une notion de texture nucléaire qu'il associe à l’état fonctionnel des cellules observées." La définition donnée par cet auteur vis-à-vis de la paramétrisation du faciès chromatinien est la suivante; "la texture peut être interprétée de façon générale comme étant la modélisation d'un phénomène de surface organisée".

Nous avons utilisé dans le présent travail 13 paramètres morphonucléaires décrivant le faciès chromatinien. Ces 13 paramètres appartiennent à trois familles distinctes, à savoir:

1. les paramètres tirés de l'histogramme des valeurs de densités optiques: à titre d'exemple, comme le rapporte de Launoit (1989), la forme de l'histogramme est très révélatrice de la texture de l'image. En effet, s'il présente un seul pic étroit, il s'agit d'une image de faible dynamique donc peu contrastée. En d'autres termes, ceci cor­

respondra à un noyau présentant un aspect relativement homogène du point de vue de sa texture. En revanche, un histogramme plurimodal suggère l'existence de régions de luminance différente et correspondra à un noyau cellulaire présentant un faciès chromatinien hétérogène. Quatre paramètres appartiennent à cette première famille: la densité optique moyenne (DOM), la variance de la densité optique (VOD), l'indice de Kurtosis (K) et l'indice de Skewness (SK). Ainsi les paramètres tirés de ('histogramme des valeurs de densités optiques vont nous renseigner essentiellement quant à l'aspect homogène ou hétérogène du noyau cellulaire;

2. les paramètres tirés des matrices de longueurs de sections: ces paramètres cor- resf>ondent essentiellement à la description du faciès chromatinien en termes de fréquence d'apparition du nombre de petites et de grosses mottes de chromatine au sein du noyau. Cette famille comporte cinq paramètres, à savoir la fréquence du nombre de

petites mottes de chromatine (SRL), celle du nombre de grosses mottes de chromatine (LRL), leur pourcentage (RLP) ainsi que leur distribution (RLD) relatifs, et la distribu­

tion des niveaux de gris au sein du noyau (GLD). Ces paramètres furent décrits en détail par Galloway en 1975 et leur mode de calcul figure dans le chapitre Matériels et Méthodes. Ces paramètres vont nous renseigner principalement quant à l'aspect granulaire du noyau (finement motté, grossièrement motté, etc...);

3. les paramètres tirés des matrices de co-occurrence: quatre paramètres texturaux ap­

partiennent à cette troisième famille, à savoir la moyenne locale (LM), l'énergie (E) et le coefficient de variance (CV) des valeurs tirées de la matrice de co-occurrence, ainsi que le contraste (C). Ces quatre paramètres vont nous renseigner essentiellement quant au degré de condensation de la chromatine telle qu'elle apparaît dans les présentes con­

ditions expérimentales. Ces paramètres furent décrits par Haralick et coll. (1973) et leur mode de calcul figure dans le chapitre Matériels et Méthodes.

Sans vouloir entrer dans le détail, nous signalons que ce type d'analyse du faciès chromatinien a permis à certains chercheurs du groupe dans lequel j'ai effectué mon travail de décrire les phénomènes suivants. L'étude multiparamétrique de la texture de la chromatine a permis, par exemple, de reconnaître les cellules épithéliales du col utérin infectées par les virus de type HPV 16 et 18 de celles qui ne l'étaient pas (d'Olne et coll., 1989). De même, dans le cas du cancer mammaire, il a été montré que la texture de la chromatine des noyaux provenant de cancers contenant des taux significatifs de récepteurs d'oestrogènes diffère significativement de celle des noyaux provenant de cancers ne contenant pas ou peu de récepteurs d'oestrogènes (Larsimont et coll., 1989a). Ce type d'analyse a également permis de distinguer les tumeurs carcinoïdes atypiques du poumon des cancers dits "à-petites-cellules" (Larsimont et coll., 1990). Enfin, l'analyse quantitative du faciès chromatinien de noyaux cellulaires soumis à la coloration de Feulgen suggère fortement que les dysplasies sévères de la prostate seraient en fait des carcinomes in situ (Petein et coll., 1991).

D. CHOIX DES MODELES D'ETUDE.

Nous illustrons ci-dessous par diverses microphotographies les pathologies que nous avons étudiées en détail. Bien entendu, des ouvrages importants existent sur ces sujets. Pour ne rappeler que quelques exemples, citons le livre publié par LiVolsi sur la thyroïde (LiVolsi, 1990), celui de Al-Mefty sur les méningiomes (Al-Mefty, 1991), ou encore celui de Burger et coll. (1991) et Rubinstein et coll. (Russel et Rubinstein, 1989) sur les tumeurs du système ner­

veux central et périphérique. Dès lors, les illustrations et définitions rappiortées ci-dessous doivent être considérées par le lecteur comme une aide à la compréhension des termes qui seront utilisés tout au long du présent travail. Toutefois, dans le cas des pathologies thyroïdiennes, la notion de goitre multinodulaire avec hyperplasie adénomateuse n'est pas une entité reconnue universellement dans le cercle des pathologistes. Aussi avons-nous cru bon d'illustrer ici ce type de pathologie.

1. Description sommaire de la pathologie et de l'évolution clinique des lésions et tumeurs de la thyroïde.

a. Les goitres multinodulaires.

Le terme "goitre" correspond simplement à une augmentation de volume de la thyroïde.

Le goitre multinodulaire est la maladie thyroïdienne la plus fréquemment rencontrée dans nos contrées. Son incidence parmi la population adulte varie de 5% (séries cliniques) à 50% (séries autopsiques) (LiVolsi, 1990). Dans ce cas précis, macroscopiquement, la thyroïde est déformée par de nombreux nodules et remaniée par de la fibrose, des calcifications et des zones de dégénérescence kystique hémorragique. Microscopiquement, les nodules sont constitués de follicules de grande taille dilatés par de la colloïde et bordés par un épithélium aplati. En bordure des kystes, on observe des proliférations pseudo-papillaires et de la métaplasie oncocytaire. Certains follicules peuvent se rompre et entraîner des réactions à cel­

lules géantes. Certains goitres présentent, outre ces aspects, des zones constituées de follicules de petite taille tassés les uns contre les autres et contenant peu de colloïde. Ces follicules sont bordés de cellules cubiques ou cylindriques. Ces goitres présentant des aspects microfol­

liculaires sont appelés goitres avec hyperplasie adénomateuse (LiVolsi, 1990). Il ne faut pas les confondre avec les goitres hyperplasiques associés à la maladie de Graves qui constituent une entité anatomopathologique bien définie.

Figure 4; microphotographies d'un goitre multinodulaire simple, dégénérescence kystique = K (A - HExlOO) et d'un goitre multinodulaire avec hyperplasie adénomateuse = HA (B - HE

x200).

b. Les adénomes.

Macroscopiquement, ces tumeurs bénignes se présentent comme un nodule unique limité par une capsule. Plus rarement on peut observer des formes multiples appelées polyadénomes. Microscopiquement, la tumeur est constituée de follicules thyroïdiens qui peuvent être de taille moyenne à grande et contenir des quantités variables de colloïde. Ce type d'adénome est dénommé normo- et macro-folliculaire. Dans le présent travail nous avons regroupé au sein de la seule entité "normomacrofolliculaire" ces deux sous-groupes d'adénomes.

Lorsque les follicules sont peu développés et ne contiennent pas de colloïde, l'adénome est qualifié de microfolliculaire. Dans certains cas l'architecture folliculaire est remplacée par une architecture trabéculaire.

Les adénomes oncocytaires sont une variante cytologique des adénomes folliculaires. Ils présentent les différents aspects décrits ci-dessus mais sont constitués de cellules

Hürthle. Ces cellules possèdent un cytoplasme abondant et éosinophile ainsi que des noyaux anisonucléosiques dont la chromatine est "épaisse". Le caractère éosinophile du cytoplasme est lié à la présence de nombreuses mitochondries.

L'évolution clinique de ces différents sous-groupes histologiques est identique.

Figure 5; microphotographies d'un adénome normomacrovésiculaire (A - HE x 200) et de sa capsule (B - Trichrome x 100), d'un adénome microvésiculaire (C - HE x 100),d'une ponction d' adénome oncocytaire (D - D-Q x1600); C = capsule.

c. Les cancers.

Dans le présent travail nous avons étudié quatre types de cancers thyroïdiens que nous décrivons ci-dessous selon les définitions données par l'OMS:

les cancers papillaires sont des tumeurs épithéliales malignes qui présentent une différenciation cellulaire de type folliculaire intégrée dans une architecture de type papillaire ou folliculaire. Du point de vue cytologique, les noyaux cellulaires sont caractéristiques. En effet, ils présentent un aspect "clair", "vidé", "en verre dépoli". Ils peuvent aussi présenter des "fentes chromatiniennes" et des inclusions éosinophiles. Les psammomes, qui sont des structures lamellaires calcifiées, sont également caractéristiques des cancers papillaires. Ces psammomes correspondraient à des axes papillaires momifiés.

* les cancers folliculaires sont des tumeurs épithéliales qui présentent une différenciation folliculaire sans les caractéristiques cytologiques spécifiques des cancers papillaires.

Tout comme les adénomes folliculaires, les cancers folliculaires peuvent présenter des aspects morphologiques variés qui ne sont pas corrélés à leur évolution clinique. On reconnaît deux entités clinico-pathologiques distinctes en fonction du pouvoir d'invasion de la tumeur; le cancer folliculaire encapsulé (avec invasion minimale) et le cancer folliculaire largement invasif. Les cancers folliculaires de "type à cellules oxvphiles". communément appelés oncocytomes malins, se définissent comme un sous-groupe des cancers folliculaires décrits ci-dessus;

* les cancers anaplasiques sont des tumeurs morphologiquement peu différenciées qui s'accompagnent d'un mauvais pronostic. Macroscopiquement, on remarque que le tissu thyroïdien est remplacé par une masse nécrotique et hémorragique. Microscopique­

ment, on observe une combinaison de cellules fusiformes, polygonales et géantes. Les atypies nucléaires sont importantes et les mitoses nombreuses;

* les cancers médullaires se développent à partir des cellules sécrétant la calcitonine (cellules C). Le polymorphisme de ces tumeurs est considérable tant au niveau architec­

tural qu'au niveau cellulaire. Une des caractéristiques de ces tumeurs médullaires est la présence d'amyloïde au niveau du stroma. Une autre caractéristique de ces tumeurs est leur capacité de synthétiser de nombreuses hormones et/ou facteurs de croissance (LiVolsi, 1990).

Figure 6; microphotographies d'un carcinome papillaire (A - HE x 600), d'un carcinome fol­

liculaire, effraction capsulaire ( -^ ) (B - HE x 200), d'un carcinome anaplasique (C - HE x 600) et d'une ponction de carcinome médullaire (D - D-Q x 500).

2. Description sommaire de la pathologie et de l'évolution clinique des lésions et tumeurs du système nerveux central et périphérique.

a. Les tumeurs des nerfs périphériques, a. 1. Les tumeurs bénignes.

Nous reconnaissons trois sous-groupes de tumeurs bénignes;

le névrome n’est pas une prolifération néoplasique mais une cicatrice exubérante en réponse à un traumatisme. Il s'agit d'un nodule constitué de faisceaux nerveux disposés de manière anarchique et entourés de collagène.

Le schwannome, appelé aussi neurilemmome ou neurinome, a une prédilection à se développer au niveau des nerfs crâniens et des racines spinales. On l'observe également au niveau du médiastin et du rétropéritoine. Cette tumeur est limitée par une capsule développée aux dépens de l'épinèvre. Microscopiquement, les cellules tumorales sont fusiformes et s'organisent en faisceaux entrelacés ou s'alignent en palissades constituant les corps de Verocay. De rares cas de transformation maligne sont rapportés dans la littérature mais la majorité des schwannomes sont des lésions bénignes à croissance lente.

Le neurofibrome se développe à partir des nerfs de petit calibre et s'étend souvent aux tissus sous-cutanés. Les cellules tumorales sont allongées, disposées en faisceaux et mêlées intimement à des fibres de collagène. Lorsqu'il s'agit d'un neurofibrome solitaire, l'évolution clinique est favorable et l'on observe rarement une transformation maligne.

a.2. Les tumeurs malignes.

Enzinger (1969) utilise le terme de schwannome malin lorsqu'un sarcome se développe à partir d'un nerf normal ou d'un neurofibrome. Ces tumeurs sont souvent peu différenciées et constituées de cellules allongées disposées en faisceaux. Les atypies nucléaires sont marquées et les mitoses fréquentes.

Il faut dissocier les schwannomes malins solitaires des schwannomes malins associés à la maladie de von Recklinghausen. appelée aussi neurofibromatose. Il s'agit d'une maladie autosomale dominante caractérisée entre autres par l'association de lésions cutanées pigmentées ("taches café au lait"), de neurofibromes multiples et de schwannomes malins.

La survie à 5 ans de patients présentant un schwannome malin solitaire est de 75%, alors qu'elle n'est que de 30% pour des patients atteints d'une neurofibromatose.

Figure 7; microphotographie d'un schwannome bénin, corps de Verocay (HE x 4(X)).

b. Les méningiomes.

Les méningiomes sont des tumeurs relativement fréquentes puisqu'elles constituent 15 à 40% des tumeurs primitives intracrâniennes selon les séries cliniques publiées dans la littérature (Schmidek, 1991). En revanche, les méningiomes malins sont des tumeurs relative­

ment rares, comptant pour 1 à 9% de l'ensemble des méningiomes (Schmidek, 1991).

Ces tumeurs ont pour origine les leptoméninges et leur polymorphisme s'expliquerait en partie par une origine mixte ecto-mésodermique, comme le suggèrent des études embryologiques (O'Rahilly et Müller, 1986).

Les classifications modernes divisent ces tumeurs en deux groupes en fonction de leur origine embryonnaire. On trouve d'une part les méningiomes "classiques" dont l'origine est ectoder- mique ,développés à partir de l'arachnoïde, et d'autre part les méningiomes "angioblastiques"

d'origine mésodermique, développés à partir des parois vasculaires (Al-Mefty, 1991). Sur le plan clinique, on reconnaît deux entités distinctes, à savoir les méningiomes bénins et les méningiomes malins alors que sur le plan anatomopathologique on reconnaît trois entités, à

savoir les méningiomes classiques, les méningiomes angioblastiques et les méningiomes malins. Comme il est décrit ci-dessous, les méningiomes classiques comportent cinq sous- groupes qui sont tous considérés comme bénins. Les méningiomes angioblastiques sont constitués de deux sous - groupes, les méningiomes hémangioblastiques qui sont considérés comme bénins et les méningiomes hémangiopéricytiques qui sont considérés comme malins.

Enfin, par définition, les méningiomes malins sont reconnus comme malins tant du point de vue du clinicien que de l'anatomopathologiste puisqu'ils sont caractérisés par l'envahissement du cortex cérébrcd.

Les méningiomes dits classiques sont donc divisés en cinq sous-groupes:

1. les méningiomes méningothéliomateux sont ceux qui ressemblent le plus aux cellules arachnoïdiennes. En effet, ces tumeurs présentent un aspect dit "en pelure d'oignon", comme celui observé au niveau des granulations de Pacchioni, composées exclusive­

ment de cellules arachnoïdiennes.

2. Le centre de ces formations peut dégénérer et se calcifier en formant des psamommes.

Lorsque ceux-ci sont nombreux, ils caractérisent le deuxième sous-groupe de méningiomes, à savoir les méningiomes psamommateux:

3. les méningiomes fibroblastiques sont constitués de cellules fusiformes disposées en fais­

ceaux entrelacés et dissociés par des fibres de collagène;

4. les méningiomes transitionnels qui sont constitués d'entités de type méningotéliomateux et fibroblastiques;

5. les méningiomes angiomateux sont caractérisés par une vascularisation constituée de nombreux petits capillaires à parois épaisses.

Les méningiomes dits angioblastiques sont divisés en deux sous-groupes qui sont:

1. les méningiomes hémangioblastiques ont le même aspect macroscopique et micros­

copique que les hémangioblastomes cérébelleux. Ils sont constitués de logettes vas­

culaires bordées d'un endothélium. Les méningiomes hémangioblastiques se distinguent des hémangioblastomes cérébelleux par leur localisation intraméningée. Pour certains auteurs (Kepes, 1989) ces méningiomes hémangioblastiques ne seraient pas apparentés aux méningiomes mais seraient des hémangioblastomes à localisation méningée;

2. les méningiomes hémangiopéricytiques sont constitués d'hémangiopéricytes qui sont des cellules situées dans la paroi vasculaire et qui entourent les cellules endothéliales.

Ces hémangiopéricytes présentent des caractéristiques morphologiques et enzymatiques intermédiaires entre celles des cellules endothéliales et celles des cellules des muscles lisses.

Figure 8: microphotographies de méningiomes méningothéliomateux (A - HE x 400) et fibroblastique (B - HE x 600).

Ainsi, ces différents sous-groupes présentent une évolution clinique similaire, excepté les hémangiopéricytomes qui montrent une agressivité importante en ce qui concerne les récidives locales, l'invasion corticale et la propension à métastasier (Al-Mefty, 1991). La ten­

dance actuelle est de considérer les hémangiopéricytomes comme une entité clinico- pathologique distincte des méningiomes, et de plus de leur attribuer le qualificatif de tumeurs malignes.

La plupart des méningiomes montrent un potentiel d'invasion important au niveau de la dure- mère, de l'os et même des muscles sans être accompagnés d'une évolution clinique maligne.

La majorité des anatomopathologistes n'acceptent comme critère de malignité pour les méningiomes classiques que l'invasion du cortex cérébral ou évidemment la mise en évidence de métastase(s).

Les figures ci-dessous illustrent différents types de méningiomes.

Figure 9; microphotographies de méningiomes transitionnel (A - HE x 400), hémangioblastome (B - HE x 400), d'un hémangiopéricytome (C - HE x 400), et d'un

c. Les tumeurs astrocytaires.

Les tumeurs astrocytaires sont les tumeurs primitives cérébrales les plus fréquentes de l'enfant et de l'adulte. Il s'agit d'un groupe morphologiquement très hétérogène. L'élaboration et l'utilisation simultanées de différents systèmes de grading et de classification engendrent une terminologie confuse. Actuellement les deux classifications les plus utilisées dans le cadre des corrélations anatomocliniques sont: 1) la classification de Burger (Burger et colL, 1985) et 2) le grading de Daumas-Duport (Daumas-Duport et coll., 1988).

La classification de Burger (Duke University, Durham, NC) divise les tumeurs astrocytaires en trois groupes: les astrocytomes qui sont des tumeurs de bas-grade et s'accompagnent d'un pronostic qualifié de relativement bon puisque associé à une survie à 5 ans d’environ 50%

(Shapiro, 1992). Ils sont caractérisés par une hypercellularité modérée accompagnée d'atypies nucléaires peu marquées. L'originalité de cette classification réside dans la discrimination que l'on peut faire facilement entre les deux groupes de tumeurs astrocytaires réputées malignes, à savoir les astrocytomes anaplasiques et les glioblastomes multiformes. Les astrocytomes anaplasiques présentent une hypercellularité importante, de nombreuses atypies nucléaires, de la prolifération endothéliocapillaire, mais ne présentent pas de nécrose. Les glioblastomes mul­

tiformes, outre les critères descriptifs des astrocytomes anaplasiques, présentent en sus de la nécrose. La médiane de survie à 2 ans des patients présentant un astrocytome anaplasique varie de 38% à 50% selon l'âge du patient, alors qu'elle ne varie que de 8% à 12% pour les patients atteints d'un glioblastome multiforme (Burger et coll., 1985).

Le grading selon Daumas-Duport (Clinique St-Anne, Paris) définit quatre sous-groupes en fonction de la présence (ou de l'absence) des quatre critères morphologiques suivants; a) atypies nucléaires, b) mitoses, c) nécrose, et d) prolifération endothélio-capillaire. Le grade est établi de la façon suivante: "pas de critères présents = grade 1", "1 critère présent = grade 2", "2 critères présents = grade 3", "3 ou 4 critères présents = grade 4".

Signalons qu'outre leur localisation cérébrale, on observe également des tumeurs astrocytaires se développant par exemple au niveau du nerf optique ou de la moelle.

Au niveau phylogénétique, les tumeurs astrocytaires appartiennent au groupe des tumeurs d'origine neuro-gliales, tout comme les tumeurs oligodendrogliales et les épendvmomes (Russel et Rubinstein, 1989).

Figure 10; microphotographies des trois types d'astrocytomes selon la définition de Burger et coll. (1985), à savoir l'astrocytome (A - HE x 300), l'astrocytome anaplasique (B - HE x 400) et le glioblastome multiforme, nécrose = N et prolifération endothélio-capillaire = f (C - HE

Figure IIA; microphotographie d'un frottis (stéréotaxie) d'oligodendrogliome, vaisseaux =

— > (A - Hemalin Floxine x 600) et d'une biopsie (à ciel ouvert) d'un épendymorne (B - HE

X 200).

d. Les tumeurs de type "PNET".

Les tumeurs de type PNET ("Primitive NeuroEctodermal Tumor") regroupent des tumeurs de l'enfant qui ont le même aspect histologique mais présentent différentes localisa­

tions. Elles peuvent se développer au niveau cérébelleux (médulloblastomes). au niveau cérébral (neuroblastomes), au niveau de la glande pinéale (pinéaloblastome) et au niveau de la rétine (rétinoblastome). Il est à noter qu'il existe également des neuroblastomes à localisation extra-crâniale.

Les cellules tumorales sont petites, rondes et possèdent un noyau hyperchromatique entouré d'un halo cytoplasmique. Elles s'agencent focalement en rosettes dites de Homer-Wright. Au sein de cette population cellulaire tumorale peu différenciée, on peut observer quelques cellules de type astrocytaire, oligodendrocytaire, ép>endymaire, neuronal, voire même musculaire.