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Théorie et applications des systèmes
polyphasiques dispersés aux cultures cellulaires en chémostat.
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R R é é s s u u l l t t a a t t s s g g é é n n é é r r a a u u x x . .
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Volume caractéristique et pseudo-homogénéité.
II.2. Volume caractéristique et pseudo-homogénéité.
La notion de pseudo-homogénéité ne peut être opérationnelle que si un système peut être divisé en éléments de volumes statistiquement équivalents du point de vue de ses propriétés. Il faut encore que ces éléments de volume soient assez petits devant le volume total pour que le milieu, considéré à une assez petite échelle, puisse apparaître comme continu. Le même problème se pose en physique lorsque l’on tente d’expliquer les propriétés macroscopiques d’un système (thermodynamiques, par exemple) au départ des propriétés du niveau microscopique (atomes, molécules, …). Dans ce cas, les dimensions des particules sont de l’ordre de l’angström (Å ; 10-10 m) et leur nombre, de l’ordre du nombre d’Avogadro (6.023 1023). A cette échelle, un système macroscopique d’une solution d’HCl, ou d’un gaz à l’équilibre de, mettons, 1 cm3, peut être considéré comme parfaitement homogène. C’est le rôle de la physique statistique d’analyser le rapport entre les distributions microscopiques et les propriétés macroscopiques, et elle représente une branche considérable de la physique. Le but n’est évidemment pas ici de développer une théorie statistique sophistiquée, mais simplement d’essayer d’appréhender plus quantitativement la notion de pseudo-homogénéité, qui est souvent acceptée de manière simplement intuitive.
Quiconque a vu une suspension de levure de boulangerie bien agitée dans un erlen de 250 ml admet volontiers comme « homogène » ce liquide beige laiteux, uniformément coloré. Un simple examen microscopique fait cependant apparaître un système hétérogène, formé de structures cellulaires, bien différenciées du milieu de culture et plus ou moins irrégulièrement disposées dans le champ du microscope. A ce niveau d’observation, il ne fait aucun doute que le système soit hétérogène et cependant nous sommes tous prêts à considérer quelques dizaines de cm3 de cette suspension comme homogène.
La notion d’homogénéité d’un système pourrait être définie de la manière suivante : deux (ou plusieurs) éléments de volume égaux, prélevés au hasard en deux (ou plusieurs) points du
système présentent exactement les mêmes propriétés (physiques, chimiques, etc.). Nous savons déjà que ce type d’homogénéité n’existe pas dans la réalité et que le terme
« exactement » doit être remplacé par « statistiquement ». La question qui est alors pertinente est de savoir à partir de quelle taille deux éléments de volume peuvent avoir statistiquement les mêmes propriétés. Pour revenir à notre exemple de la suspension de levures, il semble inévitable de considérer qu’elle est en réalité hétérogène mais que si l’on considère un volume assez grand, on peut admettre qu’elle puisse paraître homogène. A une certaine échelle, on peut dire qu’elle est « pseudo-homogène ». Cependant, nous ne pouvons utiliser cette propriété pour étudier le système que si l’élément de volume à partir duquel la suspension peut être dite pseudo-homogène est petit devant le système entier.
Nous pouvons tenter une démarche « naïve » pour estimer l’ordre de grandeur de cet élément de volume. Nous allons considérer que chaque micelle du système peut être caractérisée par une valeur comprise entre 0 et 1. Dans le cas d’une cellule, il peut s’agir, par exemple, de sa dimension, caractérisée par le rapport de sa taille actuelle et sa taille maximale avant division ; ou le rapport d’une quantité d’enzymes constitutives à la teneur maximale qu’elle peut présenter ; ou le rapport du nombre actuel d’un nombre de récepteurs membranaires par rapport à la quantité maximale, etc.. On définit donc une grandeur caractéristique ξ (une propriété) comme :
1 0 ; )
max( ≤ ≤
= ξ
ξ x
x (II.2.1)
Nous supposons le cas équiprobable où chaque micelle a la même probabilité de se trouver dans l’état ξ1 que dans l’état ξ2. En d’autres termes, nous envisageons pour ξ une distribution uniforme. Sur l’intervalle [0,1], la valeur moyenne de ξ est alors ξ=0.5et la variance vaut
12 /
2=1
σξ (Kaufman, 1965).
Par simulation numérique, nous avons estimé la moyenne et la variance de la propriété ξ dans deux éléments de volume comportant un nombre croissant de micelles. L’estimation de la moyenne a été calculée par
= ∑=n
i
n 1 i
1 ξ ξ et celle de la variance par
−
=n ∑i=n i n ∑n i
s
1
2 1 2
2 1 ξ 1 ξ
ξ
(Dagnelies, 1980,1981) où n est le nombre de micelles contenues dans un élément de volume.
log(n)
1e+0 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7
moyennes
0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70
Volume 1 Volume 2
Figure II.2.1. Moyennes en fonction du nombre de micelles.
Lorsque l’on calcule les valeurs moyennes d’une propriété micellienne distribuée uniformément sur l’intervalle [0,1] dans deux éléments de volume (1 et 2), on constate des valeurs moyennes très différentes lorsque le nombre de micelles (n) est inférieur ou égal à 10000. Vers 105 micelles par élément de volume, les deux moyennes convergent vers la même valeur, correspondant à la valeur théorique de la distribution (0.5). Cette valeur de 105 peut être considérée comme le plus petit nombre de micelles nécessaires pour que les propriétés moyennes des deux éléments de volume soient considérées comme statistiquement égales. (La ligne en pointillé indique la valeur théorique de 0.5.)
Les figures II.2.1. et II.2.2. montrent que la différence des valeurs moyennes de ξ obtenues dans les deux volumes sont significativement différentes jusqu’à 104 micelles par élément de volume.
log(n)
1e+0 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7
abs(moy(1)-moy(2))
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
La figure II.2.3. montre que la variance atteint sa valeur théorique dans les deux volumes vers 105 particules environ, valeur pour laquelle les valeurs moyennes sont également quasiment les mêmes et très proches de 0.5.
Figure II.2.2. Valeur absolue de la différence entre les deux moyennes.
Le graphique reprend les valeurs absolues de la différence entre les deux valeurs moyennes de la figure précédente. La différence décroît rapidement avec le nombre de micelles et peut être considérée comme nulle au-delà de 105 micelles par élément de volume.
log(n)
1e+0 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7
S²(x)
0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
Volume 1 Volume 2
Ainsi, dans le cas où chaque micelle a la même probabilité d’avoir une propriété comprise entre 0 et 1 (distribution uniforme), il faut environ 105 micelles par élément de volume pour que deux de ces éléments de volume, choisis au hasard, aient la même propriété moyenne. Sur cette base, nous pouvons essayer de trouver l’ordre de grandeur du plus petit élément de volume qui satisfasse au critère de pseudo-homogénéité. La réponse n’est évidemment pas universelle et dépend du système étudié. Prenons, par exemple, un bioréacteur de 1 litre, où l’on cultive Escherichia coli. La masse d’une cellule est estimée à 2.8 10-13 g (en poids sec ; Neidhardt et al.,1994). Imaginons que la biomasse totale dans le réacteur soit de 1 g (en poids sec). Le système contient alors Mc/mc=1/2.8 10-13 soit 3.6 1012 cellules (obtenu comme le rapport de la masse totale par la masse d’une cellule). Un litre de culture contient donc ce
Figure II.2.3. Estimation de la variance en fonction du nombre de micelles.
Lorsque le nombre de micelles est peu élevé, les variances de la propriété entre les deux éléments de volume sont différentes et révèlent par-là une plus grande hétérogénéité des
« états physiologiques » entre les micelles d’un élément de volume à l’autre. De même que dans le cas de la moyenne (cf. figs. II.2.1. et II.2.2.), les variances convergent vers la valeur théorique (1/12 ; en pointillé) lorsque le nombre de micelles excède 105 par élément de volume.
nombre de cellules, ce qui permet de calculer le volume ∆V* qui en contient 105, nombre nécessaire à la pseudo-homogénéité. On a que
c
T T
N n V*=V *
∆
où VT est le volume total, NTc, le nombre total de cellules et n* le nombre de cellules nécessaires pour la pseudo-homogénéité. On trouve que ∆V*=105/3.6 1012, soit ∆V*=2.8 10-8 litre, ce qui correspond à peu près à 3 cent millièmes de millilitre. Le système entier est alors plus de 35 millions de fois plus grand que l’élément de volume à considérer. Par ailleurs, le volume cellulaire est égal à
c c mc
v =δ
où δc est la masse volumique d’une cellule « mouillée», que l’on peut estimer à 1000 g/l (Dammel et Schroeder (1991), Kubitschek et al. (1984), Baldwin et Kubitschek (1984), Kubitschek et al. (1983)) . Le volume cellulaire d’une cellule « humide », à 70% d’eau (Neidhardt et al., 1994), est alors égal à 2.8 10-13/(0.3x1000) ce qui vaut environ 9 10-16 litre.
L’élément de volume est alors 30 millions de fois plus grand que la cellule. Dans cet exemple, on peut donc sans conteste affirmer que l’élément de volume est bien « sensiblement » plus grand que la micelle (la cellule) et « suffisamment » plus petit que le système entier (le bioréacteur). (En estimant le volume de E. coli à 4 10-16 l (d’après des données de Neidhardt et al., 1994), on trouve que l’élément de volume est 70 millions de fois plus grand.)
Si les considérations qui précèdent montrent que le concept de pseudo-homogénéité est bien théoriquement applicable aux cultures de microorganismes en suspension, il faut cependant introduire une remarque pratique importante sur les ordres de grandeurs calculés précédemment. En effet, comme nous l’avons déjà mentionné, les systèmes dispersés que nous envisageons sont instables, dans le sens qu’ils ne se maintiennent en dispersion que si l’on apporte de l’énergie sous forme d’agitation. Les calculs précédents reposent sur
l’hypothèse (implicite) que le système soit parfaitement mélangé. Il n’existe, dans ce cas, aucune distribution spatiale, aucun gradient, etc. C’est à cette seule condition que deux éléments de volume de même taille pris au hasard peuvent avoir des compositions moyennes identiques. Or, cette condition de mélange parfait, qui est essentiellement un problème de génie chimique, est extrêmement difficile à réaliser dans la pratique. De très nombreux facteurs interviennent (vitesse de rotation, forme des agitateurs, géométrie du réacteur, viscosité du milieu, etc.) qui rendent la maîtrise du mélange parfait très ardue. En réalité, le mélange parfait n’existe pas dans un système concret et n’est qu’une idéalité. Nous avons observé, dans une suspension de boues activées de station d’épuration soumise simultanément à une agitation mécanique (500 rpm ; agitateur à hélice) et à une agitation par bulles d’air (débit d’air de 100 l/h environ par un tube de 3 mm de diamètre sans diffuseur), l’établissement d’un gradient vertical de 0.5gMS/l/m dans une tourie de PTFE de 10 litres, avec une hauteur de colonne d’eau de l’ordre du mètre. (La valeur moyenne de la biomasse était de 3 gMS/l). Le gradient représente donc une variation de 17% environ entre le haut et le bas de la tourie. Ces remarques montrent à quel point les phénomènes d’agitation sont importants et difficiles à maîtriser, et ce d’autant plus que le système est grand. Cela montre aussi que l’élément de volume calculé ci-dessus est probablement trop petit de plusieurs ordres de grandeurs. Heureusement, le rapport VT/∆V* est tellement élevé que cette modification de ∆V* reste sans conséquence pratique.
Pour conclure, nous dirons que les résultats des calculs très simplifiés confirment l’intuition : à savoir qu’une suspension de microorganismes peut être conceptuellement considérée comme pseudo-homogène dans un dispositif à l’échelle du laboratoire ou de l’industrie.
Néanmoins, lorsque l’on passe du conceptuel à l’appliqué, il convient de s’assurer que toutes les précautions sont prises au niveau du génie chimique pour que le système puisse être
considéré comme « raisonnablement parfaitement mélangé ». Malheureusement, dans la littérature, les articles à l’échelle du laboratoire ne mentionnent pratiquement que très peu de renseignements sur l’agitation des petits bioréacteurs. Lorsque nous traiterons des exemples de ce genre, nous ferons en général l’hypothèse que le mélange est suffisant.
