Chapitre V : Discussion et conclusions. Le présent travail sur la région

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Chapitre V : Discussion et conclusions.

Chapitre V : Discussion et conclusions.

Le présent travail sur la région cop du plasmide pMOL30 de C. metallidurans CH34 vise à élucider les fonctions des gènes cop au moyen des outils expérimentaux suivants :

• l'analyse phénotypique de 15 mutants cop (sur 19 gènes) dont 13 dans deux contextes génétiques : celui du cosmide pMOL1024 (îlot cop) et celui du plasmide pMOL30,

• l'analyse physiologique par cytométrie de flux de la réponse au cuivre dans différents contextes génétiques,

• l’étude biochimique et structurale des protéines CopK et CopI,

• une étude écologique centrée sur la présence des gènes copK et copA dans des biotopes très riches en cuivre.

L'ensemble de ces données permet de jeter un regard neuf sur l'îlot cop et d'appréhender sa déconcertante complexité.

En particulier, l’analyse phénotypique des mutants a permis de mettre en évidence deux groupes distincts. Le premier montre un phénotype sensible au cuivre, ce qui suggère que ces gènes codent pour la résistance acquise par efflux du métal. Le second, plus surprenant, montre un phénotype identique et parfois plus résistant que la souche parente.

V.1. L'îlot cop et la structure génomique du pMOL30.

Le plasmide pMOL30 comprend deux grands îlots génomiques (GI) (figure I.10) : CMGI30a et CMIGI30b (Monchy et al., 2007, Mergeay et al., en préparation).

La région cop de pMOL30 fait partie de l’îlot génomique CMGI30b (figure I.10). Elle comprend 19 gènes appelés cop sur base d'observations transcriptomiques (Monchy et al., 2006^a et Monchy et al., 2007), deux orfs récemment identifiées (présent travail) et aux extrémités deux orfs fragmentaires codant pour des recombinases à tyrosine (« intégrases ») tronquées. La région cop pourrait constituer ce qu’on appelle un îlot niché (« nested island » ou NI) dans CMGI30b : nous nous référerons donc à l'îlot cop.

Un autre « îlot niché » de CMGI30b adjacent à l’îlot cop contient les gènes RND sil et ncc, des gènes gtr, le gène mmrQ (homologue à copQ et copW), un gène ompP2 (codant pour une porine), et un gène impliqué dans la synthèse des flagelles. Cette combinaison de gènes, en apparence hétéroclite, s’observe aussi pour un autre îlot niché dans CMGI30a (l'îlot czc) et pourrait être liée à des fonctions de réponse aux métaux lourds qui s'exprimeraient dans le même contexte physiologique. L'îlot cop et son voisin (qui va de ompP₂ à mmrQ) interviennent tous deux dans la réponse au cuivre codée par pMOL30 (figure I.12), mais la concentration minimale inhibitrice (CMI) semble déterminée par le seul îlot cop (voir point IV.1.1.). Les deux autres NI de CMGI30b contiennent essentiellement des gènes hypothétiques dont certains sont surexprimés en présence de métaux lourds.

Une relecture de l’annotation de la région cop (voir point IV.2.1) suggère d'inclure deux orfs supplémentaires : copO et copW. Les gènes copO et copF sont organisés en opéron. Le gène copW est lui identique à 47% à mmrQ (une orf induite par tous les métaux lourds testés en transcriptomique - figure I.12).

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Le clonage de l'îlot cop entier dans un cosmide, dérivé d'un plasmide à large spectre d'hôte (pLAFR3), a généré le pMOL1024 porté par la souche AE1744 et a permis d'analyser cet îlot hors du contexte de pMOL30 et peut-être d'aborder son phénotype tel qu'il était dans un éventuel hôte antérieur avant sa probable acquisition par pMOL30. La fonction spécifique à l’îlot cop se reflète dans le phénotype de la souche AE1744. La difficulté réside dans la discrimination qui doit être faite entre l’effet de l’ensemble des gènes de pMOL30 et ceux de l’îlot cop isolé.

V.2. L'îlot cop serait spécialisé dans la réponse au stress aigu et est intégré dans un système sélectionné pour répondre à un stress chronique.

Quatre types d'arguments appuient cette spécialisation dans la réponse rapide et immédiate au stress aigu: (i) le fait qu'en conditions induites, la CMI de la souche AE1744 ne varie guère (figure IV.5), (ii) le phénotype des mutants de l'îlot cop (cosmide pMOL1024) (voir ci- dessus), (iii) la cytométrie de flux et (iv) l'expression de CopK mesurée par Western blot au moyen d'anticorps antiCopK.

La cytométrie montre une réponse homogène pour l’ensemble des cellules qui ont crû en présence de Cu(II) (population adaptée) et pour celles soumises à un choc de Cu(II) (stress aigu). Les deux types de stress conduisent à des réponses très différentes pour les trois souches CH34, AE104 et AE1744. Ces différences entre souches ont été observées même à des concentrations sub-létales en Cu(II). Nous avons pu mesurer l’état physiologique des cellules porteuses de l’îlot cop (AE1744) qui ont crû sous en présence de Cu(II) : leur taux d’oxygène radicalaire est basal (niveau de CH34) mais leur perméabilité membranaire est plus altérée par le stress cuivrique ambiant que CH34.

Dans le cas du stress aigu, l’activité réductase et le potentiel de membrane sont liées à l’îlot cop : chez AE1744, l’activité réductase, qui reflète le taux de transfert électronique dans la chaîne respiratoire, augmente de 700% et le potentiel membranaire est consommé à 50 % après seulement une heure de contact. Ces observations suggèrent que les électrons transférés pour modifier la valence du cuivre passent par la chaîne respiratoire et que le potentiel de membrane s’en trouve affecté.

Une manipulation complémentaire (voir annexe 1.C) où CH34 et AE1744 sont induites à 0,3 mM en Cu(II) durant 30 minutes seulement, montre que la CMI de la souche AE1744 monte à 3 mM en Cu(II) au moins, alors que celle de CH34 n’atteint que 2 mM. Le système Cop pourrait fonctionner de manière incontrôlée lorsqu’il est isolé du contexte pMOL30 : il déploie très rapidement la résistance via les mécanismes de détoxication cytoplasmique et périplasmique. Son intégration dans le plasmide pMOL30 permettrait à la bactérie de maintenir sa viabilité sur le long terme, dès lors que les concentrations environnementales dépassent de loin les concentrations utilisées en laboratoire.

L’expression basale de CopK mesurée par les Western blot de protéines dans les mutants de pMOL1024 (en absence de Cu(II)) est considérablement augmentée par rapport à la souche CH34. Cette expression est inductible dès 1µM de Cu(II). Cela pourrait s’expliquer par une augmentation du pool intracellulaire de Cu(I) qui est toujours élevé du fait de l’absence de système d’efflux du cuivre cytoplasmique. Cette explication suggère donc que ce taux puisse contrôler l’expression de la protéine CopK.

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V.3. Les phénotypes des mutants cop : une famille de mutants plus sensibles au cuivre et une autre de mutants à phénotype quasi sauvage ou plus résistant que le parent.

De fait, les différences phénotypiques observées pour les mutants des gènes cop dans le cosmide pMOL1024 ou dans le plasmide pMOL30 sont flagrantes (voir table IV.3). Comme mentionné ci-dessous, il faut considérer deux groupes de mutants : ceux qui sont impliqués dans les mécanismes déjà bien connus de détoxication du cytoplasme et du périplasme et ceux qui ont un phénotype sensible dans le contexte du cosmide (îlot cop) : copSRABD, copJ, copF et copE et les mutants qui sont apparemment plus résistants que leurs parents : copK, copV, copT, copM, copG, copL et copQ.

1. Les mutants affectés dans la résistance proprement dite: copSRABD, copF, copJ et copE.

• Dans pMOL1024, les mutations dans copA et copF suppriment la résistance au cuivre, celles dans les gènes copS, copR, copD, copJ ont également un phénotype sensible intermédiaire entre le phénotype parental (AE1744) et celui de la souche sans plasmide (AE104). La mutation copB conduit même à un phénotype hypersensible, c'est-à-dire encore plus sensible que la souche AE104. Cette hypersensibilité fait penser aux mutants merA (transposons mercure) devenus hypersensibles au mercure suite à la perte de la réductase mercurique cytoplasmique et à l'entrée du mercure dans le cytoplasme via merT. Mais CopB, clairement une protéine essentielle à la résistance au cuivre, est une protéine du périplasme attachée à la membrane externe, et on ne comprend pas bien comment son absence peut à ce point compromettre la survie de la cellule même à des concentrations relativement basses en cuivre.

• Par contre, dans pMOL30, les mutations copA, copB ou copF entraînent des phénotypes différents et contrastés. Au départ de précultures sans Cu(II), les trois mutants sont plus sensibles au Cu(II) : intermédiaires entre le contrôle sauvage et le contrôle sensible (sans plasmide, AE104). Après induction, le domaine de concentrations dans lequel on peut mesurer la survie des bactéries est considérablement étendu : le phénotype sensible intermédiaire du mutant copA se retrouve (de même pour copR, copS et copD). De façon inattendue, le mutant copB est hyperrésistant sur toute la gamme de concentration excepté autour de la CMI où sa viabilité chute brutalement. Quant au mutant copF, son phénotype est d'abord intermédiaire, ensuite sa viabilité reste quasi stable au point que le mutant semble plus résistant que son parent aux fortes concentrations. Le phénotype du mutant de copE en conditions induites se rapproche de celui de copF mais sa viabilité reste identique à celle du sauvage jusqu’à sa CMI où le mutant devient plus résistant que CH34.

2. Les mutants à phénotype apparemment plus résistant copV, copT, copM, copK et copL (et sans doute copQ) ou quasi identique à leur parent (copG).

• Dans le contexte du cosmide pMOL1024, ces mutants sont plus résistants au cuivre que leur souche parentale (AE1744) comme si l'allèle sauvage des gènes correspondants interférait de façon négative, c'est-à-dire affectait la viabilité de la souche parentale. (Cet effet pourrait résulter d’une entrée accrue de cuivre

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dans le cytoplasme promue par les protéines CopV, CopT, CopK et CopM, cette entrée étant non souhaitable.) Toutefois, par rapport à CH34, tous ces mutants ont une CMI inférieure.

• Dans le contexte pMOL30, les mutants copV et copM ont pratiquement le phénotype sauvage en toutes conditions. Le mutant copK est même plus résistant que son parent en conditions non induites mais en conditions induites, son phénotype est sauvage. En conditions non induites, le phénotype des mutants copT et copQ est quasi parental excepté aux approches de la CMI.

On retrouve ici pour copT le phénotype observé dans le cosmide; ce phénotype se confirme en conditions induites et le mutant copT perd aussi le phénotype persistant. En conditions induites, le mutant copQ a un phénotype sensible intermédiaire avec décroissance progressive de la viabilité (mutant de régulation).

V.4. Le système Cop et la persistance bactérienne.

Le phénotype persistant correspond à un état de « dormance cellulaire » des bactéries Gram négatives, et est encore mal défini dans la littérature. On commence à admettre que la persistance pourrait être aux bactéries Gram négatives ce que la sporulation est aux Gram positives. La persistance est un phénomène qui se confond avec résistance bactérienne due à la formation d’un biofilm, dans lequel il n’est pas possible de distinguer les cellules

« dormantes » des cellules qui poussent effectivement (Caraher et al., 2006). La comparaison d’un stress dû à des oxyanions d’arsénite, d’arséniate ou de chromate imposé à une culture liquide d’E. coli ou à une culture sous forme de biofilm a permis de mesurer que moins d’1%

de la population planctonique était capable de passer dans un état de persistance (Harrison et al., 2005). Il semble toutefois qu’une population d’E. coli en apparence homogène contienne des cellules dont la croissance est plus lente et qui sont celles capables de passer à l’ état persistant. (Balaban et al., 2004).

Le profil particulier de la courbe de viabilité de la souche CH34, où la viabilité se maintient (en dessous de 1%) aux concentrations élevées, nous incite donc à utiliser le terme de

« phénotype persistant » sans être absolument sûr qu'il s'agit bien du phénomène décrit pour d'autres protéobactéries.

Dans ce contexte, toutefois, des colonies prélevées sur milieu solide à 3 mM en Cu(II), mises en culture liquide sans Cu(II) et restriées ensuite sur le même milieu solide à 3 mM en Cu(II), sont incapables de croître (voir annexe 1.B). Les colonies qui ont poussé à 3 mM ne sont donc pas des mutants résistants. De plus, la fréquence de mutation spontanée d’une bactérie est d’environ 10^-7, et celle des persistants de l’ordre de 10^-3, il ne peut s’agir de mutants spontanés.

Il serait intéressant de chercher un phénotype persistant pour la résistance à d’autres métaux et de tester le comportement des mutants cop affectés dans ce phénotype. Il faudrait aussi étudier la persistance chez des bactéries exposées à plusieurs métaux (cas des biotopes katangais étudiés dans cette thèse) ou encore à des combinaisons de métaux lourds et d’autres agents biocides.

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Les concentrations moyennes (pour un même site) en cuivre biodisponible dans les sites pollués sont comprises entre 1.000 à 10.000 ppm environ, soit 16 à 160 mM. Ces concentrations ne sont jamais utilisées en laboratoire et sont tellement hautes qu’on peut émettre l’hypothèse que la grande majorité des cellules de ces sols riches en cuivre sont en état persistant. Il n’est donc pas surprenant qu’un contact préalable Cu(II)/cellule favorise le passage à la persistance comme décrite dans ce contexte-ci.

Le phénomène de persistance est un souci majeur dans les lieux sensibles, comme les centres hospitaliers, les unités de production agro-alimentaire, et les « clean rooms » de mise au point d’électronique de pointe (satellites en particulier) où la stérilité doit être constante. On a pu montrer que l’utilisation d’un mélange de biocides et d’H2O2 ne permet pas d’éliminer totalement les souches persistantes, parmi lesquelles se trouve C. metallidurans (La Duc et al., 2003).

Les mutants des gènes copT, copA, copB, copR et copG ne montrent pas de phénotype persistant : soit il disparaît complètement, soit la fréquence de persistance diminue. Ces gènes semblent donc liés (directement ou pas) à ce phénotype. Les mutants de copT et copG sont remarquables car leur phénotype par rapport au parent ne se marque que dans la zone de concentrations où le phénotype persistant est visible (2,1 à 3 mM en Cu(II)) en conditions induites.

L’étude du phénotype persistant de C. metallidurans CH34 par une approche générale (et pas sous l’angle de la résistance au cuivre uniquement) permettrait d’élucider le rôle des gènes cop qui semblent impliqués dans cet état physiologique.

V.5. Comment les gènes cop de pMOL30 sont-ils régulés ?

Les gènes copRS sont connus pour coder pour les régulateurs des gènes copABCD dans diverses bactéries (Mills et al., 1993, Mills et al., 1994, Mergeay et al., 2003). Les gènes copR et copS sont dupliqués sur le mégaplasmide et leurs homologues sont respectivement identiques à 86 % et 61 %.

L’étude phénotypique des mutants de copRS montre que les gènes du mégaplasmide compensent peu ou pas la mutation dans les gènes copRS de pMOL30. Ces mutants apparaissent toujours, dans les deux contextes génétiques et dans les deux conditions d’induction, plus sensibles que leur parent. Il faut souligner une différence majeure dans les courbes de viabilité des deux mutants : dans le mutant de copR le phénotype persistant disparaît alors que dans le mutant de copS, il se maintient. Il semble donc que copR code aussi pour une fonction de régulation (d’induction) du système persistant.

L’étude de l’expression de CopK dans les mutants de pMOL1024 montre que CopR et CopS régulent l’expression de cette protéine. Par rapport aux deux phénotypes principaux (sensibilité accrue ou résistance et survie à la CMI) observés pour les mutants, il apparaît donc que les « deux systèmes » sont soumis, au moins partiellement, à des régulateurs communs.

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Outre les gènes copRS, les gènes cop(L)QHEW pourraient constituer un ensemble de gènes de régulation. Les gènes copQ et copW sont homologues à mmrQ, un gène induit par tous les métaux lourds testés en transcriptomique et qui serait un régulateur de la réponse générale aux métaux lourds (Monchy et al., 2007). La protéine codée par copH lie le Ni(II) et le Zn(II) en plus du Cu(II) (Sendra et al., 2006). CopH pourrait donc être une protéine impliquée dans les réponses croisées entre métaux. La composition des roches ultramafiques est telle que l’exploitation minière génère toujours une pollution mixte de métaux. Dans le cas de nos échantillons katangais, du cobalt et du zinc sont présents dans presque tous les échantillons, bien que le cuivre y soit presque toujours majoritaire. Le phénotype du mutant de copE change très fortement suivant les conditions de préculture et le contexte génétique, mais aussi suivant la concentration en Cu(II).

On peut aussi poser la question de savoir si, à l’intérieur des cellules, c’est le Cu(I) ou le Cu(II) qui induit la résistance au cuivre : la mesure de l’activité kinase de CopS mise en présence de Cu(I) ou Cu(II) permettrait de répondre partiellement à cette question.

S’il apparaît que CopR est un inducteur de la transcription des gènes copABCD, l’analyse bioinformatique montre également que cette protéine porte un motif « winged helix repressor DNA-binding » (table IV.1). CopR pourrait réprimer certains gènes en absence de cuivre. Il pourrait s’agir de gènes impliqués dans l’entrée du cuivre, pour autant qu’on accepte le principe que la détoxication du cuivre codée par pMOL30 passe par une importation de l’ion avant son expulsion, comme pour le Pb(II) (Borremans et al., 2001).

V.6. Les gènes copK, copV, copT, copM, copL, copG et copQ semblent ne jouer aucun rôle dans la détoxication mais bien dans la survie à la CMI.

A première vue, il est déconcertant de voir que les mutants de ces gènes ont des phénotypes résistants voire hyperrésistants sur presque toute la gamme de concentration en cuivre testée.

Certains, comme copV, copM dans le contexte pMOL30 ont un phénotype sauvage. Un examen attentif des courbes de viabilité montre que la viabilité de ces mutants comparée à celle de la souche sauvage CH34, s'affaisse à l'approche immédiate de la CMI : c'est le cas de copK, copV, copT, copM et copL dans le contexte du cosmide (réponse à la CMI en choc aigu) et de copT, copV, copG, copB et copQ (conditions non induites) et copQ, copB, copG et copT (conditions induites) dans le contexte du pMOL30. On peut donc se poser la question de savoir si les protéines correspondantes n'ont pas pour fonction de protéger les cellules contre une mort certaine et les maintenir dans un état persistant qui leur permettrait de « ressusciter » lorsque les conditions deviennent moins toxiques. La résistance/hyperrésistance de ces mutants aux concentrations inférieures à la CMI s'expliquerait par le fait que l'expression de ces protéines perturberait le processus de résistance et donc la viabilité, mais ce phénomène serait compensé par la possibilité de survivre à l’état latent dans un biotope toxique.

CopK (et CopB), régulés par CopR, jouent un rôle important dans ce processus. CopT semble être aussi indispensable à ce processus dans les deux contextes.

Cette hypothèse de protection bactérienne à la CMI par les produits des gènes copVTMKBGLQ devra être confirmée par diverses expériences physiologiques : courbes de viabilité, essais de réanimation de cellules exposées à la CMI en Cu(II), interaction avec le phénotype persistant, étude sur la perméabilité des cellules, les activités enzymatiques et redox impliquées, le statut de l'ADN, …

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V.7. Présence de Cu(I) intracellulaire et absence apparente de phénotype vis-à-vis du Cu(I) exogène : pourquoi ?

La toxicité du Cu(I) pour les bactéries a été mise en évidence depuis longtemps (Cramp, 1967). Vu le potentiel redox du cytoplasme, le cuivre intracellulaire est exclusivement du Cu(I), mais on ne sait pas, pour des bactéries Gram négatives, si le mécanisme de réduction du Cu(II) en Cu(I) intervient à la surface de la cellule (avant le transport), durant le transport ou à la surface de la membrane cytoplasmique (Silver et Phung, 2005). Chez la bactérie Gram positive E. hirae, le Cu(II) est réduit à la surface de la membrane cellulaire par la protéine CorA avant l’influx du Cu(I) (Solioz et Stoyanov, 2003).

Le Cu(I) est donc celui présent dans le cytoplasme des bactéries Gram négatives. On peut se demander pour quelles raisons le système Cop de pMOL30 ne confère aucune résistance particulière au Cu(I) exogène alors que plusieurs protéines Cop (CopK, CopF, CopA, CopB, CopC, CopI) présentent des motifs de liaison au Cu(I) et que CopK lie le Cu(I) avec une affinité de l’ordre du nanomolaire.

La première réponse relève de la thermodynamique : le Cu(I) est un élément instable qui dismute lorsqu’il est libre en solution, dès lors, il n’est pas présent dans l’environnement, et les bactéries ne porteraient pas de gènes pour répondre à la toxicité du Cu(I) exogène.

Deux autres hypothèses liées à la physiologie peuvent être avancées :

• le groupe de gènes cop de pMOL30 ne serait pas impliqué directement dans la résistance au Cu(I), cette fonction pouvant être remplie par un ou des gènes du mégaplasmide ou du chromosome (par exemple cusABC qui code pour un système de type RND spécifique du cuivre, cupA qui code pour une ATPase, pour ne citer que les systèmes identifiés à ce jour).

• la concentration minimale toxique en Cu(I) exogène est si faible qu’elle est insuffisante pour induire les gènes cop, mais est trop toxique que pour permettre la survie.

La première explication n’a pas notre faveur, car elle va à l’encontre tant de nos observations biochimiques (liaison de CopK et CopI au Cu(I)) que bioinformatiques (répétition de motif Met/His et Cys de liaison au Cu(I) parmi les protéines Cop). Quant à la seconde, nous savons que CopK est exprimé dans la souche sauvage dès 8,5 µM de Cu(II), mais nous n’avons pas, il est vrai, regardé si CopK était exprimé en présence d’une concentration identique de Cu(I).

Des manipulations complémentaires seront donc nécessaire pour essayer de trancher la question de la toxicité du Cu(I) exogène.

Outre l’observation de l’expression de la protéine CopK en présence de Cu(I), une courbe de viabilité en conditions induites par le Cu(I) devrait être réalisée : si on n’observe d’induction pour aucune des souches, c’est que la résistance au Cu(I) exogène ne dépend pas des gènes portés par les plasmides. Dans le cas contraire, une perspective serait de réaliser une puce à ADN où le Cu(I) est le métal inducteur, ce qui permettrait de mettre en évidence d’éventuels gènes spécifiques à la résistance au Cu(I) exogène. Les données transcriptomiques montrent que les gènes cup et cus ont des taux d’induction par le Cu(II) négligeables (1,4 et 1,9). Ces gènes pourraient être induits par le Cu(I), puisqu’on sait qu’ils sont impliqués dans l’homéostase du cuivre essentiel.

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Mise à part la question du Cu(I) exogène, la question du Cu(I) généré au départ du Cu(II) présent dans le milieu reste ouverte. Le système d’efflux cytoplasmique, du à l’action de CopF, ne prend que le Cu(I) en charge. Il semble également que ce soit du Cu(I) qui soit pris en charge par le système d’efflux périplasmique, le motif Met/His de liaison à cet ion étant en tout cas présent chez CopA, CopB et CopC.

Une hypothèse plausible est qu’une réductase multicuivre, comme pourrait l’être CopI, soit un avantage pour la cellule à deux conditions : (i) le Cu(I) généré, beaucoup plus toxique que le Cu(II), doit être parfaitement séquestré et pris en charge ; (ii) le mécanisme de génération du Cu(I) doit être modéré et donc parfaitement régulé pour ne pas saturer les sites de liaison au Cu(I).

La première condition peut être remplie par l’action de CopB qui porte un motif Met/His répété onze fois, mais CopK est un autre partenaire potentiel de CopI pour la stabilisation du Cu(I). Enfin, CopG pourrait également être impliquée dans cette prise en charge, mais elle ne porte qu’un motif de type CXXC (identique au motif de CopF) et CopG pourrait être la chaperonne périplasmique qui récupère le Cu(I) expulsé du cytoplasme par CopF pour le stabiliser sur CopB.

La question de la régulation est abordée plus haut, et il se pourrait que le phénotype de la souche qui ne porte que l’îlot cop soit du à une mauvaise gestion du Cu(I) généré par le système Cop. Ce serait la raison pour laquelle 90% de la population initiale d’AE1744 est incapable de croître à une concentration où 100 % des souches sauvages survivent (soit entre 0,4 et 0,8 mM en Cu(II)).

Enfin, le système de génération de Cu(I) doit être contrebalancée par un mécanisme de retour vers la forme Cu(II). Il a été démontré que CopA de pMOL30 de C. metallidurans CH34 était capable de se substituer dans E. coli à la protéine CueO, une oxydase multicuivre (Rensing et Grass 2001). Par ailleurs, ces protéines dont l’activité est de convertir le Cu(I) en Cu(II) sont très répandus parmi les protéobactéries, ce qui suggère leur importance.

V.8. Existe-t-il un mécanisme d’entrée du cuivre vers le cytoplasme gouverné par l'îlot cop?

La réponse à cette question semble évidente, puisque « oui », une étude en particulier montre que CopC et CopD fonctionnent ensemble pour réaliser l’entrée du cuivre et charger CopA en cuivre dans le cytoplasme avant que celui-ce rejoigne le périplasme. Toutefois, on ne peut considérer cette réponse comme suffisante : si les deux CopC codés chez C. metallidurans CH34 sont des homologues proches, il n’en est pas de même pour les deux CopD qui n’ont que 49% d’identité. De plus, la transcriptomique montre que les deux gènes de copD sont induits de la même façon (Monchy et al., 2007), ce qui suggère un rôle simultané pour les deux CopD.

Le phénotype du mutant de copD est identique, dans les deux contextes et quelles que soient les conditions de préculture, à celui du mutant de copQ dont on sait qu’il est homologue à mmrQ, un régulateur de la réponse générale aux métaux lourds. Une hypothèse serait donc que CopQ, localisée dans le périplasme, présente le cuivre à CopD (spécifiquement celui codé sur pMOL30) qui induit alors par un régulateur inconnu la résistance au cuivre. CopE et CopL, dont la localisation pourrait être cytoplasmique, pourraient réguler la résistance au cuivre.

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Une autre hypothèse dans la régulation de la résistance au cuivre est le rôle de CopR comme répresseur lié à l’ADN : CopE ou CopL pourrait porter le cuivre de CopD à CopR fixé sur l’ADN.

Par ailleurs, le phénotype des mutants de copVTMK dans le contexte pMOL1024 pourrait suggérer que les protéines codées par ces gènes soient responsables d’une entrée incontrôlée du cuivre. Le profil biphasique de la souche AE1744 pourrait donc s’expliquer par l’entrée incontrôlée du Cu(I) dans la cellule. Cette hypothèse est la seconde pour expliquer le profil biphasique de la courbe de viabilité et pourraient même être plus spécifique que celle liée à une réponse incontrôlée du système Cop : ce serait alors l’entrée du cuivre qui serait mal contrôlée.

CopT est homologue au domaine cytochrome-c de PbrT (une protéine qui réalise l’entrée du Pb(II)), le canal transmembranaire de PbrT n’étant pas présent dans CopT. Dès lors, si les gènes copVTMK intervenaient dans l’entrée du cuivre, il leur manquerait une protéine de la membrane interne pour réaliser l’entrée du cuivre. La protéine CopD codée sur pMOL30 pourrait donc être ce canal d’entrée. Pour vérifier cette hypothèse, il serait nécessaire de construire un vecteur portant les gènes copVTMK et copD : la souche porteuse de ce vecteur devrait alors être hypersensible au cuivre. Il pourrait cependant être nécessaire de déléter les gènes cop du mégaplasmide afin que ces gènes n’interagissent pas dans cette étude.

La protéine CopK pourrait être impliquée dans le transfert du Cu(I) du périplasme vers le cytoplasme via CopD. CopK se substituerait alors à CopC pour présenter le cuivre à CopD.

V.9. Quels sont les autres gènes de pMOL30 susceptibles d’intervenir, en plus de l’îlot cop, dans la réponse au cuivre ?

Outre les gènes cop, d’autres gènes de pMOL30 (voire pMOL28) sont impliqués dans la résistance au cuivre. Ceux-ci peuvent être subdivisés en deux groupes : (i) des gènes de régulation qui contrôlent un ou des gènes cop et (ii) des gènes qui vont prendre part effectivement à la prise en charge du cuivre.

Parmi les gènes du premier groupe, mmrQ est très probablement impliqué dans la réponse au cuivre. CzcE -codée dans un système de réponse au cadmium-zinc-cobalt- lie deux Cu(II) par monomère (Zoropogui et al., 2008) et pourrait aussi intervenir dans les régulations croisées.

Les gènes cnr de pMOL28, codant pour des résistances au cobalt/nickel, sont induits entre 4 et 8 fois par le Cu(II) (Monchy et al., 2007) : ils pourraient eux aussi intervenir des dans mécanismes de régulation croisées.

Le rôle de tous ces régulateurs pourrait être de temporiser la réponse de l’îlot pour assurer son fonctionnement sur le long terme, et permettre ainsi une survie dans un environnement qui n’est pas du tout favorable à la croissance bactérienne.

Les gènes de pMOL30 les plus susceptibles de coder pour des fonctions qui interviennent dans la réponse au cuivre sont les gènes gtr et sil. Les gènes gtr codent pour des protéines de réparations de membranes : la cytométrie de flux montre que l’intégrité membranaire est mieux préservée dans la souche sauvage CH34 par rapport à AE1744 et AE104, ce qui pourrait être la résultante de l’action des protéines Gtr.

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Les gène sil codent pour un système d’efflux de type qui prendrait en charge l’Ag(I), mais dont le Cu(I) pourrait aussi être un substrat. Si les gènes sil étaient associés aux gènes cop, nous retrouverions des mécanismes de transport des métaux : RND (SilABC), ATPase (CopF), Influx (CopCD, hypothétiquement CopVTMKD). Seul un système de type CDF manque à l’appel.

Un gène codant pour une porine est situé entre les gènes cop et gtr (l’orf183 ou ompP2, induite 4,72 fois par le Cu(II), Monchy et al., 2007). Cette porine semble impliquée dans le transport de petites molécules hydrophiles au travers de la membrane externe : elle pourrait intervenir dans l’efflux final du cuivre par expulsion d’ions Cu(I) ou Cu(II). Une autre hypothèse serait que cette protéine interagirait directement avec CopB, elle aussi dans la membrane externe, pour finaliser l’expulsion du cuivre.

V.10. De la fonction des gènes cop considérés individuellement à un modèle de la résistance/réponse au cuivre.

Les gènes copVTMK :

Un rôle dans la réponse autour de la CMI: assurer la survie des bactéries ?

Si copV et copM n’ont pas d’homologues de fonctions connues, copT porte un motif cytochrome-c similaire à celui des protéines d’entrée du Pb(II) ou Fe(II).

Les phénotypes résistants des mutations copVTMK dans pMOL1024 suggèrent que l'expression de leurs allèles sauvages affecte négativement la survie cellulaire dans le domaine principal de concentrations de cuivre. Toutefois, la viabilité des mutants est moindre que celle du sauvage à l'approche immédiate de la CMI.

En conditions induites, les phénotypes de copV et copM dans pMOL30 sont identiques à la souche parente, le mutant copT semble perdre le phénotype persistant.

Le gène copK code pour une protéine périplasmique fixatrice du Cu(I) .

CopK est une protéine périplasmique qui lie le Cu(I) avec une affinité élevée. Plusieurs hypothèses de fonction peuvent être émises : stockage du cuivre aux fins de détoxication, stockage du cuivre pour les besoins métaboliques, transport de l’ion dans le périplasme, transfert de l’ion à la protéine d’entrée du cuivre dans le cytoplasme.

Son expression dans l’îlot cop seul est sous le contrôle du régulateur CopR.

CopK pourrait avoir des homologues dans les milieux pollués au cuivre observés dans cette étude, ce qui refléterait son importance pour les microorganismes de ce biotope.

Le gène copN :

Une protéine qui stabilise les radicaux libres ?

copN code pour une protéine Cop susceptible de stabiliser les radicaux libres générés par les interactions entre le cuivre et le contenu cellulaire et pourrait jouer un rôle essentiel dans la protection de la bactérie aux approches de la CMI.

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Les gènes copR et copS :

La kinase senseur et l’inducteur des gènes cop de pMOL30.

Le couple CopR/CopS est un régulateur de l’îlot cop, mais il n’est pas le seul régulateur des gènes cop dans le contexte pMOL30.

De plus, le gène copR semble être nécessaire à l’établissement du phénotype persistant et il contrôle l'expression de copK.

Les gènes copABCD :

Les gènes copAB sont impliqués de la résistance au cuivre.

Les gènes copAB sont très répandus et bien étudiés dans d’autres organismes.

copA est essentiel à la résistance au cuivre pour l’îlot cop seul, (phénotype sensible) et dans pMOL30 (phénotype sensible intermédiaire).

copB est essentiel ou important dans les conditions non induites. En condition induite (chronique), copB n'est nécessaire (et alors absolument indispensable) qu'autour de la CMI et sinon semble être un handicap pour la cellule.

La multiplication dans copB de sites de liaison au Cu(I) (48 méthionines) serait capitale dans pMOL1024 et répondrait aux besoins d’une réponse « explosive ». Cela semble aussi vrai dans pMOL30, en stress chronique, à l'approche de la CMI.

Les gènes copCD sont impliqués dans le transport périplasmique.

Le rôle connu de CopC (chez P. syringae, Cha et Cooksey, 1993) est d’amener le cuivre à CopD, canal dans la membrane interne, qui réalise entrée de l’ion pour en charger CopA.

Le phénotype du mutant copD dans pMOL30 est identique à celui du mutant de copQ : il est plus sensible que le parent. La PCR quantitative montre que le gène copC est le plus surexprimé de tous les gènes cop, et de loin (Monchy et al., 2007). Malgré les efforts entrepris, le mutant correspondant n'a pas été obtenu.

Le gène copI :

Code pour une protéine qui combine des caractéristiques des protéines bleues à cuivre et des oxydases multicuivre.

CopI aurait une activité similaire à celle des oxydases multicuivre malgré sa petite taille.

L'interconversion Cu(I)/Cu(II) semble jouer un rôle important dans le système cop mais le mutant copI fait défaut. CopI pourrait agir en complément de CopA, comme réductase multicuivre.

Le gène copJ :

Un gène lié à la résistance de copABCD et copF.

Sur base de prédictions bioinformatiques, la protéine CopJ serait un cytochrome-c : le mutant copJ du cosmide est sensible au cuivre. Nous n'avons pas sa contrepartie dans pMOL30.

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Le gène copG :

Un gène impliqué dans la survie maximum.

Le phénotype du mutant copG est sauvage hormis sa sensibilité accrue aux alentours de la CMI et la disparition de la persistance dans le seul contexte de pMOL30. CopG serait une chaperonne qui interviendrait dans la survie maximale en stress chronique.

Les gènes copOF :

L’ATPase d’efflux du cuivre indispensable à la fonction de CopABCD.

CopF est l’ATPase d’efflux indispensable dans pMOL1024 à la résistance au cuivre. Son importance semble plus limitée dans pMOL30, où elle pourrait être substituée par d’autres. Le phénotype du mutant copF est à cet égard assez extraordinaire : il permet la plus haute viabilité (8%) à 3 mM de Cu(II) (la plus haute concentration testée), toutes souches confondues. On peut se demander quelles fonctions surexprimées dans pMOL30 parviennent ainsi à compenser l'absence du produit du gène copF. Nous n’avons pas de données sur copO, qui forme un opéron avec copF.

Les gènes copQHEW : Un ensemble de régulateurs ?

Sur base de ses phénotypes dans pMOL30, copQ serait impliqué dans la réponse (« protection ») à la CMI que le produit de ce gène induirait. Le gène copQ est très fortement induit par le cuivre, cadmium ou nickel, et de façon record par le zinc (Monchy et al., 2007).

Il partage ces propriétés avec mmrQ et czcJ qui pourraient aussi intervenir pour la protection de la bactérie autour des CMI de divers métaux autres que le cuivre.

L’étude biochimique de CopH a été publiée : CopH est un dimère de 13 kDa qui lie non seulement le Cu(II) mais aussi le Zn(II) et le Ni(II) sur un site de type II, à raison d’un ion par sous-unité (Sendra et al., 2006). Ceci suggère un rôle dans les régulations croisées entre métaux.

copE coderait pour une lipoprotéine. Le phénotype du mutant copE dans pMOL30 en conditions induites ressemble à celui du mutant de copF.

Le gène copW est homologue aux gènes mmrQ et czcJ, qui codent très probablement pour des régulateurs d’une réponse générale aux métaux lourds.

Un modèle Cop ?

Nous disposons de nombreuses données mais celles-ci ne permettent pas encore d’avancer un modèle global. Nous devinons des mécanismes d’interconversion Cu(I)/Cu(II) (via les oxydoréductases multicuivre CopA et CopI, et les cytochromes-c CopT et CopJ) mais nous ne savons pas comment ils interviennent. Les flux de cations via CopD ou vers l’espace extracellulaire restent incompris.

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Une hypothèse plausible est que les gènes du système Cop répondent de façon « explosive » (car incontrôlée) au cuivre et que d'autres gènes de pMOL30 les modèrent pour les intégrer dans la réponse chronique au cuivre ou dans la survie (état persistant) à très haute concentration. Le modèle de résistance devra donc intégrer ces concepts de différenciation suivant l’état physiologique cellulaire (soit pour une cellule choquée ou adaptée). Le phénotype de CH34 en conditions induites montre l’importance de l’îlot cop dans la réponse au stress chronique. Il n’y a pas d’antagonisme, mais une relative spécialisation des protéines Cop pour une réponse ou l’autre.

Le plasmide pMOL1024 nous permet d'étudier le groupe de gènes cop dans un contexte

« isolé ». Dans ce contexte, l'îlot cop peut être considéré comme proche des mécanismes basiques copSRABCD connus et étudiés dans d'autres organismes (Rensing et Grass, 2003, Puig et al., 2002). Le phénotype des mutants des gènes de fonctions d'efflux (copSRABD, copF) dans pMOL1024 est la perte de la résistance au cuivre. Par contre, dans le contexte pMOL30, une mutation dans un gène d'efflux n'entraîne pas la perte complète du phénotype résistant.

Un modèle de fonctionnement du système Cop ne pourra donc être établi qu'en analysant l'ensemble des gènes codés par pMOL30 (voir du pMOL28 aussi) et en prenant en compte l'état physiologique de la cellule étudiée (choquée, adaptée ou persistante).

V.11. Conclusions et perspectives.

Notre but était de mieux comprendre le système cop de pMOL30, par diverses approches physiologique, biochimique, génétique et écologique.

Le groupe de gènes cop constitue un îlot niché, qu’on pourrait aussi qualifier d’« îlot fonctionnel ». Des essais d’expression hétérologue de l’îlot seul dans des organismes plus ou moins proches de C. metallidurans permettraient de mieux comprendre comment ce système s’est élaboré. L’analyse et le séquençage du « groupe de gènes de résistance au cuivre » des souches katangaises permettra d’établir l’organisation des gènes homologues aux cop dans ces souches spécialement adaptées au cuivre.

L’analyse génétique et physiologique a permis de suggérer la spécialisation de l’îlot dans la réponse au stress aigu. Elle doit être complétée par une étude différentielle des transcriptomes induits par un stress aigu ou chronique. La même approche doit être utilisée en cytométrie de flux par comparaison d’un mutant à son parent après un stress aigu ou chronique.

L’analyse phénotypique des mutants et les analyses biochimiques (ou, à leur défaut, les prédictions bioinformatiques) ont permis de suggérer des fonctions pour presque toutes les protéines Cop. Néanmoins, la complexité du système est telle que de multiples expériences sont encore nécessaires : citons, par exemple, celles qui permettraient de distinguer l'effet bactéricide de l'effet protecteur/bactériostatique qui serait lié à l'expression des gènes copVTKM voire copL et copQ dans le contexte du cosmide (îlot cop) et à l'expression des gènes copT, copV, copQ, copG et copB dans le contexte de pMOL30. Des essais de

« réanimation » sur milieu sans cuivre de bactéries inhibées par des concentrations proches de la CMI pourraient permettre de mieux comprendre les phénotypes des mutants correspondants.

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Il faudra isoler de nouveaux mutants, en particulier de copC, le gène le plus induit de l'îlot cop, mais aussi de copN, copI, copO, copH et copW, ainsi que de copL et copJ dans le contexte pMOL30. A cet égard, on peut mentionner l'obtention, dans le laboratoire du SCK.CEN, de deux banques de mutants insertionnels, l'une avec un transposon portant le gène rapporteur lacZ (marqueur cytoplasmique) et l'autre portant le gène rapporteur phoA (marqueur membranaire/périplasmique). L'expression des gènes rapporteurs pourra aider à la localisation des protéines Cop, comme CopL par exemple.

La construction de souches qui ne portent qu’un ou deux gènes sous le contrôle d’un promoteur indépendant du Cu(II) mais inductible à souhait, permettrait de détecter les effets toxiques éventuels d’une protéine (comme CopF à la limite de la survie bactérienne). Cette approche permettrait de mettre en évidence les candidats « modérateurs » de l’îlot cop en les introduisant dans AE1744 (par exemple le gène mmrQ).

L’analyse biochimique systématique de toutes les protéines Cop purifiées permettrait de mettre en évidence les interactions protéine-protéine et la localisation précise des certaines protéines, comme CopV ou CopL. Compte tenu des données acquises sur CopI, nous suggérons de commencer par CopT et CopJ qui seraient des cytocrhomes-c, et qui seraient donc impliqués dans les transferts électroniques. L’analyse du protéome par protein-array aiderait à distinguer quelles protéines Cop interviennent dans la résistance, la survie à la CMI, la persistance, et pour un choc ou une croissance en présence de l’agent toxique.

Enfin, l’étude transversale du gène copK, de son rôle physiologique à sa dispersion dans l’environnement, nous a montré qu’il n’est pas aisé de lier la fonction d’une protéine à son action dans le biotope. Si les données biochimiques ne laissent que peu de doute sur le fait que CopK soit une protéine chaperonne du cuivre, et plus exactement du Cu(I), sa fonction dans le périplasme n’a pas pu être identifiée. Plusieurs hypothèses de fonction sont plausibles : présentation du Cu(I) à CopD (codée par pMOL30) pour réaliser l’entrée du cuivre, séquestration des ions Cu(I) en attendant leur conversion en Cu(II) par l’action de CopA, transport du Cu(I) expulsé dans le périplasme par CopF vers CopB afin d’y stocker les ions Cu(I) excédentaires. Voire une combinaison de plusieurs fonctions, en fonction de l’état physiologique de la cellule (choquée, adaptée ou persistante).

Outre l’analyse des groupes de gènes cop dans les souches katangaises, la recherche de copK dans une variété de biotopes différents évaluerait son éventuelle spécificité pour les sites industriels pollués par le cuivre en particulier ou par une combinaison de métaux.

La conclusion méthodologique globale est qu’une approche multidisciplinaire est requise pour aborder l’étude d’un système aussi élaboré que celui de l’îlot cop de pMOL30. Il faut étudier des mutants et leurs parents dans divers contextes génétiques induits ou pas et autour de la CMI.

La prise de conscience de l'aspect mosaïque de gènes et d'opérons regroupés en îlots et en structures plus complexes dans le plasmide pMOL30 a mené à aussi étudier ces gènes et leurs mutants dans un contexte génétique aussi réduit que possible. La formation du cosmide pMOL1024 a été un évènement déterminant qui a permis cette réduction à ce qu'on peut considérer comme une forme de l'îlot cop de base même si on n'en connait pas l'origine.

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La conclusion théorique globale est qu’il est important d’étudier les mécanismes de résistance bactérienne (à n’importe quel agent toxique) sous tous les états physiologiques possibles. Il y aurait quatre états physiologiques distincts à considérer : le stress aigu ou choc, l’adaptation à l’agent toxique à une concentration sublétale, l’état cellulaire à la CMI et la persistance.