Dynamique spatio-temporelle du picoplancton eucaryote lacustre : approches moléculaires par FISH et pyroséquençage.

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lacustre : approches moléculaires par FISH et pyroséquençage.

Jean-François Mangot

To cite this version:

Jean-François Mangot. Dynamique spatio-temporelle du picoplancton eucaryote lacustre : approches moléculaires par FISH et pyroséquençage.. Biodiversité et Ecologie. Université de Grenoble, 2011.

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THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE

Spécialité : Sciences de la Terre, de l’Univers et de l’Environnement Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Jean-François MANGOT

Thèse dirigée par Isabelle DOMAIZON et codirigée par Didier DEBROAS

préparée au sein du Centre Alpin de Recherche des Reseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques (UMR CARRTEL 42)

et du Laboratoire Microorganismes : Génome et Environnement (UMR CNRS 6023)

dans l'École Doctorale de Sciences et Ingénieries des Systèmes, de l’Environnement et des Organisations (SISEO-ED 489)

Dynamique spatio-temporelle du picoplancton eucaryote lacustre : approches moléculaires par FISH et pyroséquençage

Thèse soutenue publiquement devant le jury composé de : Laure GUILLOU

Chargée de Recherche, CNRS, Roscoff (Rapporteur)

David MOREIRA

Directeur de Recheche, CNRS, Université Paris Sud (Rapporteur)

Jean-Pierre DESCY

Professeur, Université de Namur (Examinateur)

Télesphore SIME-NGANDO

Directeur de Recherche, CNRS, Aubière (Examinateur)

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REMERCIEMENTS

A l’issue de ces quatre années (et oui, le temps passe vite !!!), le moment est venu, pour moi, de remercier toutes les personnes, et elles sont nombreuses, sans qui cette thèse n’aurait pu être menée à son terme et qui m’ont entourées et rendues cette tâche captivante au quotidien. Cette partie est loin d’être la plus simple à rédiger, car il me faut retranscrire en quelques lignes la gratitude que je ressens à l’égard de toutes ces personnes que j’ai eu la joie de côtoyer, croiser au cours de mes différents passages au sein des laboratoires chambériens, thononais et clermontois. Aussi, s’il m’arrivait d’oublier quelqu’un (e), et qu’il (elle) s’en aperçoit, je m’en excuse par avance.

En premier lieu, je tenais à remercier les deux personnes sans qui ce travail n’aurait pu voir le jour sans leurs encadrements, leurs conseils et leurs soutiens tout au long de ces années. Merci à Isabelle et Didier, pour votre confiance, votre patience et d’avoir su être là lorsque les difficultés pointaient du nez... Merci Chefs !!

Je souhaiterais exprimer ma gratitude à Pierre Faivre, Jean-Marcel Dorioz, Jean Guillard et Christian Amblard, directeurs respectifs du Centre Interdisciplinaire des Sciences de la Montagne (CISM, Chambéry), de la station d’hydrobiologique lacustre (UMR INRA CARRTEL 42, Thonon-les-Bains) et du laboratoire Microorganismes : Génome et Environnement (UMR CNRS 6023 LMGE, Aubière), qui m’ont accueilli successivement dans leurs établissements et permis la réalisation de ce travail.

Toute ma gratitude s’adresse également à Laure Guillou et David Moreira qui m’ont fait l’honneur d’être rapporteurs de cette thèse et à Jean-Pierre Descy et Télesphore Sime- Ngando pour avoir accepté de juger ce travail.

Ce manuscrit n’aurait jamais pu voir le jour sans l’aide et le travail des personnels du laboratoire du CARRTEL et LMGE qui m’ont accompagné lors des prélèvements (Jean- Christophe Hustache, Pascal Perney, Gérard Paolini). Je tenais également à remercier Najwa Taib et Agnès Vellet, pour leurs aides, mes ―deux petits étudiants‖ Solène Lelong et Nemr Marouni pour leur apport et de m’avoir fait confiance en tant que jeune ―maître Jedi‖.

Merci à Emilie Duffaud qui m’a épaulé considérablement dans mon travail et à qui je dois beaucoup…

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Je souhaite également remercier l’ensemble des membres et collègues des différents laboratoires au sein desquels j’ai fait un petit bout de chemin. Un merci particulier à Loulou (Trosset), Jérôme et Brice, collègues pédologues chambériens pour m’avoir notamment initié aux “terres rares” et à l’œnologie (c’est vrai, ils font du bon vin en Savoie, j’admets !). Merci à Lyria, Thomas, Lulu, Lena, Cécile, Anne, Vincent et Clément, collègues thononnais de m’avoir accueilli parmi eux le cours d’un été (plus quelques weekend par ci par là), leur sympathie et gentillesse et pour les petites soirées au ―château‖ mémorables. Un grand merci au grand François qui s’est redonné le sourire à n’importe quel moment et pour son aide sur la fin. Je souhaiterais également ici remercier, Nico, Zaza Bat. et Isa, pour leurs conseils, les petites pauses cafés, les dégustations d’après TP et pour l’une d’avoir supporter au bureau mes sautes d’humeurs et pour son écoute.

Je souhaite maintenant remercier des collègues mais surtout des amis. Merci à Hélène (notre chef à tous), Guillaume et, Jérémy, compagnons des premières heures (du DEUG même c’est dire !!) et à Mélanie (ma petite confidente qui s’est remettre la pêche), petite dernière dans le cercle très fermés des bureaux bleus et jaunes, pour leur amitié, leur soutien moral, leur bonne humeur et petits moments de folies. Merci à Apo, Maman “Marion” et Papa “Charly”, pour les moments passés à vos côtés. Je suis très heureux de vous avoir rencontré et d’avoir fait un bout de chemin avec vous. Vous êtes unique !

Je terminerais ces lignes pour remercier ceux sans qui je n’aurais pas pu mener cette thèse jusqu’au bout. J’adresse donc mes derniers (et forcément les meilleurs) à mes proches, mes parents, ma sœur, qui ont toujours cru en moi et ont toujours été là depuis 27 ans. Je vous dois beaucoup. Merci !

…A mon grand-père

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RESUME

Les analyses de la composition de la communauté eucaryote lacustre de petite taille (< 5 μm) réalisées ces dernières années ont révélé une diversité taxonomique et fonctionnelle importante, et ont soulevé de nombreuses questions quant à l‘importance relative, la répartition et la dynamique de groupes eucaryotes jusque là largement ignorés dans les systèmes planctoniques lacustres. Ces travaux de recherche, menés par une approche écosystémique, ont eu pour objectif (i) d‘acquérir des données quantitatives concernant divers groupes eucaryotes unicellulaires présents dans la fraction picoplanctonique lacustre, (ii) d‘explorer la dynamique spatiale et temporelle de ces groupes picoeucayotes tant en terme d‘abondance que de diversité phylogénétique, et ceci à différentes échelles d‘observation, et (iii) d‘ apporter une profondeur d‘analyse supplémentaire de la diversité et de la structure des picoeucaryotes par l‘utilisation de séquençage massif. Différentes techniques ont été utilisées au cours de ce travail : dénombrement par TSA-FISH, qPCR et pyroséquençage.

La profondeur de lecture obtenue par l‘utilisation du séquençage à haut débit révèle une importante diversité (1017 OTUs) 10 à 100 fois supérieure à celle décrite classiquement (clonage- séquençage de l‘ADNr 18S). L'utilisation de sondes oligonucléotidiques spécifiques, nouvellement élaborées ou issues de la littérature, a permis d‘estimer la contribution relative de huit groupes phylogénétiques au sein de la communauté picoeucaryote lacustre. L‘importance quantitative d‘organismes photosynthétiques (Chrysophycées, Chlorophycées), notamment en période estivale, a ainsi été révélée; et, la présence récurrente de groupes potentiellement parasites-saprophytes (Perkinsozoa, Fungi, LKM11) a également été confirmée. Les résultats obtenus par séquençage haut débit à partir de 23 échantillons environnementaux (période estivale) mettent évidence la dominance de taxa parasites-saprophytes (Perkinsozoa, LKM11) et bactérivores (Ciliophora, Cercozoa).

L‘étude de la répartition spatiale (verticale) et géographique (au sein de trois lacs se différant par leurs statuts trophiques) des groupes phylogénétiques ciblés par TSA-FISH a mis en lumière des différences d‘abondance selon le statut trophique (densités picoeucaryotes croissantes avec la productivité du système) et la profondeur. Ainsi, la présence dans des proportions significatives d‘organismes pigmentés (Chlorophycées, Haptophycées) en zone hypolimnique non éclairée nous a conduit à émettre l‘hypothèse de l'importance de la mixotrophie au sein de la fraction picoplanctonique.

Des variations d‘abondances marquées ont été observées non seulement à l‘échelle saisonnière (e.g. pics d‘abondance estivale pour les Perkinsozoa) mais également à des échelles de temps courtes (quelques jours). Cette instabilité quantitative observée ici à court terme doit être mieux prise en compte dans l‘interprétation des observations faites généralement à des échelles temporelles plus larges et par un nombre restreint d‘échantillon. D‘importants et continuels remaniements sont observés au sein de la communauté picoeucaryote, ils impliquent principalement les 21 OTUs appartenant au ―core taxa‖ (>1%

des séquences), et des taxa présentant des abondances intermédiaires (0,01-1% des séquences). A contrario, l‘assemblage des taxa rares (<0,01%) composant plus de la moitié de la diversité décrite, s‘avère quant à lui relativement stable au cours du temps.

Cette approche écosystémique a permis de révéler une diversité nouvelle notamment au sein des Perkinsozoa (14,3% des séquences) pour lequel les premiers indices d‘un rôle parasitaire en milieu lacustre a été apporté (microalgues potentiellement infectées).Les données acquises au cours de ce travail contribuent à alimenter les débats concernant les patrons de diversité (distribution spatio-temporelle des protistes et des champignons). Ils suggèrent la nécessité de mieux intégrer la notion de diversité fonctionnelle dans ces réflexions, les mécanismes impliqués dans les remaniements de diversité étant a priori différents en fonction des groupes fonctionnels considérés. Notamment, au regard du parasitisme eucaryote (autre que chytridien) pour lequel très peu d‘informations sur les éventuelles co-occurrences entre taxa hôtes et ces agent infectieux sont encore connue en milieu d‘eau douce.

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TABLE DES MATIERES

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TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ET ETAT DE L’ART ... 1

Introduction générale ... 3

I. Le picoplancton eucaryote : définition et caractéristiques ... ….4

II.Abondance et importance écologique du picoplancton eucaryote ... 7

III.Structure de la communauté picoplanctonique eucaryote lacustre ... 9

III.1.Apport des techniques moléculaires en écologie microbienne aquatique……….10

III.2.Richesse spécifique et organisation du pico-eucaryoplancton lacustre ………….13

III.3.Composition taxonomique du picoplancton eucaryote lacustre………...16

III.3.1. Quelques évolutions de la classification des Eucaryotes ... 16

III.3.2. Vue d’ensemble de la diversité des picoeucaryotes lacustres au travers des séquences d’ADNr 18S……….………...17

IV.Rôle du picoplancton eucaryote dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques… ... 34

V. Cas de parasitisme eucaryote aquatique, les perkinsozoa : état des lieux des connaissances actuelles sur ces protistes recemment reveles en milieu lacustre ... 40

Article I : Perkinsozoa, a well-known marine protozoan flagellate parasite group, newly identified in lacustrine systems: a review ... 41

Abstract ... 41

Introduction ... 42

The phylogenetic position of perkinsozoa phyla among the lineage of alveolates ... 44

Perkinsozoa in marine systems: a natural cause of diseases in oyster cultures and of toxic dinoflagellate proliferations ... 46

Life cycle and regulatory factors of perkinsozoa phyla in aquatic systems ... 48

Detection and recent interest in the perkinsozoa phylum in lacustrine systems ... 51

Conclusion ... 52

OBJECTIFS DE TRAVAIL ET PRESENTATION DES ETUDES ... 53

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CHAPITRE I : ETUDE DE LA STRUCTURE ET LA DYNAMIQUE SAISONNIÈRE DE LA COMMUNAUTÉ PICOEUCARYOTIQUE LACUSTRE (0,2-5 µM) PAR

L’UTILISATION DE NOUVELLES SONDES OLIGONUCLÉOTIDIQUES ... 59

I.Préambule ... 61

II.Site d’étude.……….…...….……….………..………...62

Le Lac du Bourget………..62

III.Approche moléculaire utilisée : TSA-FISH ou tyramide signal amplification- fluorescent in situ hybridation ... 63

IV.Résumé de l’étude…….……….…....………...……….………..65

Article II: Community Structure and Dynamics of Small Eukaryotes Targeted by New Oligonucleotide Probes: New Insight into the Lacustrine Microbial Food Web ... 67

Abstract ... 67

Materials and methods ... 69

Study site………..69

Sampling and fixation ………69

Determination of the main limnological parameters………70

Design of new oligonucleotide probes………71

Quantification of small eukaryotic organisms (cell diameter, <5 µm) using TSA-FISH………...72

Statistical analysis………...73

Results ... 73

Main abiotic parameters determined at the study site………..73

Abundance, structure, and dynamics of nano- and microplanktonic organisms……….74

Abundance, structure, and dynamics of the small eukaryotic assemblage (cell diameter, <5 µm) …..76

Correlation of abiotic and biotic factors with the abundances of the different potential parasitic groups………...80

Discussion ... 81

Chrysophyceae, Cryptophyceae, and Chlorophyceae ………82

LKM11 group, Cercozoa, Fungi, and Perkinsozoa………...83

Acknowledgements ... 85

(11)

CHAPITRE II : STRUCTURE VERTICALE DE LA COMMUNAUTÉ

PICOEUCARYOTE CARACTÉRISÉE PAR TSA-FISH DANS TROIS

ÉCOSYSTÈMES LACUSTRES DE STATUTS TROPHIQUES DIFFÉRENTS ... 87

II.Sites d’études……..……….………...………….89

Le Lac d’Aydat………….………..89

Le Lac Pavin……….………90

III.Résumé de l’étude………..91

Article III : Vertical structure of small eukaryotes in three lakes that differ by their trophic status: a quantitative approach ... 93

Abstract ... 93

Study site and sampling………...95

Counts of bacteria and eukaryotic groups (size fraction <5 µm) using TSA-FISH, Probe design, TSA–FISH and DAPI staining….……….97

Statistical analysis………...………98

Results and discussion ... 98

Main physico-chemical and biological characteristics of the three lakes………98

Abundance, diversity and vertical distribution of small eukaryotes (<5 µm size fraction)………...99

Pigmented small eukaryotes: unexpected importance of Chlorophyta and Haptophyta…………..101

Non-pigmented small eukaryotes: the opened black box………105

CHAPITRE III : DYNAMIQUES A COURT TERME DU PICOPLANCTON EUCARYOTE LACUSTRE (0,2-5µM) : IMPORTANCE DES TAXA DOMINANTS DANS LES REMANIEMENTS CONTINUELS DE LA COMMUNAUTE………..………..111

II.Site d’étude ... 114

Le Lac Léman…………..……….114

(12)

III.Approches moléculaires utilisées : PCR quantitative (qPCR) et pyroséquençage sur

amplicons (454 Roche)... 115

Principe de la qPCR……….115

Principe du pyroséquençage 454 sur amplicons………116

IV.Résumé de l’étude ... 118

Article IV : The short-term dynamics of lacustrine small eukaryotes provide evidence of continual reassembly of the community without involving the rare biosphere………...121

Abstract ... 121

Study site and sampling………..123

Small-eukaryote quantification by TSA-FISH………...124

DNA extraction and quantification of 18S rDNA copies ………...124

Pyrosequencing………..125

Data processing………125

Results ... 126

Physicochemical and meteorological characteristics……….126

Quantification of the total small eukaryotes by combining different molecular approaches………..126

Short-term variations in the richness and diversity of the small-eukaryote community…………...126

Taxonomic composition of the small-eukaryote assemblag………..130

The most abundant OTU detected is affiliated to perkinsozoan………..126

Discussion ... 135

Contribution of molecular methods to the study of protist dynamics………..135

New insights into the structure of small eukaryotes ………...137

Short-term reassembly of small eukaryotes did not involve members of the rare biosphere………..138

Microalgae as hosts for Perkinsozoa parasitoids………..139

Supplementary data ... 141

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES……….……….…..145

I. Structure de la communauté picoeucaryote lacustre : réflexion autour des patrons de diversité ... 147

La “biosphère rare”………...150

(13)

Le “core taxa”……….152

II. Variabilité spatio-temporelle des abondances et structures picoeucaryotes ... 153

Variabilités spatiales inter-lacs ou intra-lacs………….………..153

Variabilité temporelle: court terme vs long terme………..156

III. Premiers indices du role fonctionnel des perkinsozoa : des questions cles autour du parasitisme eucaryote ... 158

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 161

CURRICULUM VITAE : ACTIVITES DE RECHERCHE………...……..197

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i

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN (DNA) : Acide désoxyribonucléique

ADNr (rDNA) : Acide désoxyribonucléique ribosomique ARN (RNA) : Acide ribonucléique

ADNr (rDNA) : Acide ribonucléique ribosomal

CCA : Canonical Correspondance Analysis (Analyse Canonique des Correspondances) Cells : Cellules

Chl a : Chlorophylle a

DAPI : 4, 6-diamino-2-phénylindole

DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Electrophorèse sur gel à gradient dénaturant) EDTA : Ethylenediaminetetraacetic

FISH: Fluorescent in situ hybridization (Hybridation in situ Fluorescente) FITC : Fluoresceine Iso Thio Cyanate

HNF :Heterotrophic nanoflagellates (Nano-flagellé hétérotrophe) HF Heterotrophic Flagellates (Flagellé hétérotrophe)

Ind : Individu

NaCl : Chlorure de sodium

NGS : Next-Generation Sequencing (Séquençage de nouvelle génération) NH4-N - N-NH4 : Ammonium

NO3-N - N-NO3: Nitrates

OTU : Operational Taxonomic Units (Unité Taxonomique Opérationelle) PO4-P - PO4-P: Orthophosphates

pb - bp: paire de base (base pair)

PCR : Polymerase Chain Reaction (Reaction en chaîne par polymérase)

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ii

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction (Reaction en chaîne par polymérase quantitative)

RDA : Redundancy Analysis (Analyse de Redondance) SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

T-RFLP : Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Polymorphisme de taille de fragments de restriction Terminaux)

T-RF : Terminal Restriction Fragment (Fragments de restriction terminaux)

TSA-FISH : Tyramide Signal Amplification-Fluorescent in situ hybridization (Hybridation in situ Fluorescente couple à une amplification du signal par la tyramide)

UV : Ultra-violet

(16)

iii

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

Cette liste ne tient pas compte des figures et tableaux contenues dans les articles.

Introduction et état de l’art

Figure I-1 Distribution des différents compartiments trophiques du plancton selon leur classe de taille. D‘après Sieburth et al. (1978)………....……5 Figure I-2 Variation de la richesse spécifique des picoeucaryotes lacustres de la zone épilimnique de différents écosystèmes lacustres différent par leur statut trophique………....……….14 Figure I-3 Arbre phylogénétique consensus du domaine eucaryote basé sur la combinaison de données morphologiques, biochimiques et moléculaires issu de Keeling et al. (2005) et modifié selon les travaux de Burki et al. (2007, 2008, 2009) d‘Archibald (2009) et de Parfrey et al. (2010).18 Figure I-4 Schéma simplifié de réseau trophique intégrant la boucle microbienne d‘après Amblard et al. (1995), extrait de Domaizon (2010)………..34 Tableau I-1 Exemples d‘abondances de picoeucaryotes dans divers écosystèmes aquatiques (d‘eau douce, lagunaire ou marin) triées selon l‘état trophique du système étudié. Les études sont différentiées selon l‘outil de dénombrement utilisé, elles sont marquées d‘un astérisque (*) pour l‘utilisation de la cytométrie en flux et sont soulignées d‘une croix (†) lors de l‘utilisation de la microscopie à épifluorescence………...8

Chapitre I

Figure III-1 : Lac du Bourget, vue de son bord (à gauche, source personnelle) et en vue satellite (à droite, source Google Earth©). La localisation du point de prélèvement lors de notre étude est précisée………...62 Figure III-2 Illustration des différentes étapes de la technique d‘hybridation in situ fluorescente couplée au système TSA d‘amplification du signal par réaction enzymatique faisant intervenir l‘enzyme HRP (Horse Radish Peroxidase) et son substrat, la tyramide. ………..64

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iv Chapitre II

Figure V-1 Lac d‘Aydat, vue de son bord (à gauche, source personnelle) et en vue satellite (à droite, source Google Earth©). La localisation du point de prélèvement lors de notre étude est précisée…90

Figure V-2 Lac du Pavin, vue de son bord (à gauche, source personnelle) et en vue satellite (à droite, source Google Earth©). La localisation du point de prélèvement lors de notre étude est précisée…91

Chapitre III

Figure VII-1 Lac Léman, vue de son bord (à gauche, source personnelle) et en vue satellite (à droite, source Google Earth©). La localisation du point de prélèvement lors de notre étude est précisée.114 Figure VII-2 Réaction d‘incorporation du SYBR Green durant la réaction de PCR………….116 Figure VII-3 Illustration des différentes étapes de la technique de pyroséquençage sur amplicons………..…117

Discussion générale et perspectives

Figure IX-1 Variations des indices de dissimilarité des cinq principaux groupes impliqués dans les changements de dominances de la communauté picoeucaryote se produisant dans les eaux éclairées du lac Léman au cours des 63 jours d'étude (issus des travaux présentés dans le chapitre III)………156 Tableau IX-1 Comparaison des coefficients de variation (%) de l‘abondance de divers groupes picoplanctoniques lacustres caractérisés par une approche à long ou court terme (issus des travaux présentés dans les chapitres I et III)………..…157

G rand Lac P

etit Lac

G rand Lac P

etit Lac

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1

INTRODUCTION ET ETAT DE L’ART

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Introduction et Etat de l’art /Introduction général

3 INTRODUCTION GENERALE

L‘étude et la compréhension du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, au regard notamment des flux d‘énergie et de matière qui les caractérisent, ont conduit les scientifiques à théoriser et modéliser le fonctionnement de ces systèmes. Ainsi, les premiers modèles trophiques expliquèrent la productivité des réseaux aquatiques par la formalisation du concept de chaîne trophique linéaire basée sur l‘assimilation photosynthétique par le phytoplancton et les transferts d‘énergie et de matière aux maillons trophiques supérieurs (zooplancton et poissons). Depuis, les avancées scientifiques, notamment dans le domaine de l‘écologie microbienne, ont permis d‘affiner cette notion de chaîne trophique via le concept de boucle microbienne donnant toute leur importance aux compartiments microbiens (bactéries, picophytoplancton et protistes hétérotrophes) dans la productivité des systèmes (Pomeroy et al., 2007). A travers ce concept prenant ainsi en considération les plus petits éléments du plancton s‘entrouvre une complexité d‘interactions trophiques nécessitant la prise en considération d‘un plus grand nombre de groupes fonctionnels¹. La compréhension de ces interactions passe inévitablement par la caractérisation des communautés planctoniques les constituants, parmi lesquelles le picoplancton eucaryote forme l‘un des compartiments clés.

Les eucaryotes unicellulaires de petite taille (diamètre cellulaire 0,2 à 5 μm) sont moins abondants que leurs homologues procaryotes (de l‘ordre de 10²-10⁴ à 10⁵-10⁷ cellules.ml^-1 respectivement). Toutefois ils jouent un rôle majeur dans les cycles biogéochimiques, notamment dans le cycle du carbone (Li, 1994, Liu et al., 2009), les réseaux trophiques aquatiques et la productivité globale de l‘écosystème (Caron et al., 1999b). Malgré leur importance écologique, ces eucaryotes unicellulaires picoplanctoniques (organismes pigmentés et non pigmentés < 2 ou 5 μm selon les études) sont restés mal décrits de par leur petite taille et l'absence de caractéristiques morphologiques distinctes. Toutefois l‘utilisation, au cours de la dernière décennie, de techniques d‘écologie moléculaire a permis d‘identifier ces microorganismes dans les eaux marines (e.g.

López-García et al., 2001) et, à un moindre degré, dans les eaux douces (e.g. Lefranc et al., 2005).

Ces études, basées sur l‘analyse des gènes d‘ARN ribosomaux 18S par clonage-séquençage, ont révélé une grande diversité et l'existence de nouveaux groupes d‘organismes tout en s‘affranchissant des approches culturales. Des travaux réalisés sur les protistes picoplanctoniques

1 Groupes d‘organismes homogènes sur le plan de leur rôle fonctionnel car partageant le même type de ressources et les mêmes prédateurs.

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4

issus de différents milieux environnementaux ont notamment montré des structurations similaires de la diversité de ces ―petits eucaryotes‖ (Massana et Pedros Alio, 2008, Worden et Not, 2008) caractérisées par la prédominance des groupes non photosynthétiques, comprenant non seulement des bactérivores (Massana et al., 2006), mais aussi, de minuscules parasites ( Lefèvre et al., 2007, Guillou et al., 2008, Lepère et al., 2008). Ces études apportent ainsi un nouvel éclairage sur la communauté des flagellés hétérotrophes (HF) longtemps considérée comme une entité fonctionelle homogène (bactérivores) en écologie aquatique.

Plus récemment, et à l‘inverse des études basées sur le séquençage de l'ARNr 18S, des travaux menés en microscopie à épifluorescence après marquages spécifiques de groupes d‘intérêts ont révélé dans les océans une prédominance de cellules photosynthétiques ou mixotrophes au détriment des cellules hétérotrophes (environ 80% vs 20% respectivement) (Massana et al., 2006). Les rares données disponibles permettant de comparer des résultats quantitatifs par les approches microscopiques à celles obtenues par séquençage (après amplification du gène codant pour l‘ARNr 18S) mettent indéniablement en évidence un manque de congruence entre les informations acquises par ces deux approches. Toutefois, à l’heure actuelle, il existe un manque de données quantitatives prenant en compte les divers groupes taxonomiques récemment révélés par les approches moléculaires. De telles quantifications dans les écosystèmes lacustres n’ont que très peu été entreprises, aussi l’un des principaux objectifs de ce travail a été de pallier à ce manque de connaissances.

L‘importance relative de divers groupes eucaryotes, jusqu‘alors peu connus dans les systèmes lacustres, a été étudiée, dans le cadre de ce travail de thèse, à travers la caractérisation de leur dynamique spatiale et temporelle (à différentes échelles de temps) tant en terme d‘abondance que de diversité phylogénétique.

I. LE PICOPLANCTON EUCARYOTE : DEFINITION ET CARACTERISTIQUES Devant, entre autre, les diversités de taille, de fonction ou de répartition spatiale du plancton, la définition de ce dernier a été maintes fois remaniée au cours du siècle dernier, et différentes terminologies ont été employées pour caractériser cette flore et cette faune aquatiques.

L‘une d‘entre-elles a été adoptée depuis 1978, basée sur une organisation de la classification des organismes marins selon leur taille (Sieburth et al., 1978). Ainsi, les microorganismes ont été catégorisés en trois entités, le picoplancton, le nanoplancton, et le microplancton regroupant respectivement les organismes d‘un diamètre cellulaire compris entre 0,2-2 microns, 2-20 microns

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Introduction et Etat de l’art / Structure de la communauté picoeucaryote lacustre

5 et 20-200 microns (Figure I-1).

Figure I-1 Distribution des différents compartiments trophiques du plancton selon leur classe de taille. Par comparaison, les classes de taille du necton et l‘emplacement du picoplancton eucaryote sont indiquées. D‘après Sieburth et al. (1978).

Ces fractions de taille associent des groupes trophiques variés, mais, initialement, selon cette classification le terme de picoplancton était représenté par les bactéries pélagiques, alors que l‘ensemble des producteurs et consommateurs primaires de ces écosystèmes (phytoplancton et protozooplancton respectivement) constituaient les fractions nano et microplanctoniques. Ce cloisonnement par la taille des communautés trophiques planctoniques, permettant initialement de comprendre et de conceptualiser les réseaux aquatiques, va toutefois se révéler fragile. Ces limites sont évidemment artificielles et il existe un continuum de taille entres ces différentes catégories. Déjà, quelques années auparavant, les travaux de Wauthy et al. (1967) suivis de Throndsen (1976) et de Jeffrey (1976) supposent la contribution importante de très petits organismes photosynthétiques à la production primaire des zones océaniques. Mais ce n‘est qu‘en 1979, grâce aux travaux de Waterbury et al. (1979) et de Johnson et Sieburth (1979) que l‘importance de la cyanobactérie coccoïde Synechococcus a pu être révélée par les techniques de microscopie à épifluorescence et de microscopie électronique dans l‘écosystème pélagique. La présence d‘organismes photosynthétiques dans la fraction de petite taille est confirmée quelques années plus tard avec l‘utilisation, en écologie aquatique, à la fin des années 80 de la cytométrie en Picoplancton

eucaryote

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flux permettant de détecter un second genre picocyanobactérien, le genre Prochlorococcus d‘une taille comprise entre 0,5 et 0,7 µm (e.g. Chisholm et al., 1988). Quant à l‘existence d‘eucaryotes photosynthétiques marins de taille picoplanctonique, elle est bien connue depuis plus d‘une soixantaine d‘années (Butcher, 1952), même si leur importance écologique n‘a été mise en évidence que vers les années 1980 (Johnson et Sieburth, 1982, Murphy et Haugen, 1985).

Depuis la découverte dans l‘étang de Thau d‘Ostreococcus tauri (plus petite cellule eucaryote photosynthétique connue) par Courties et al. (1994), nous savons alors que la taille de ces protistes picoplanctoniques peut varier de 0,8 microns dans ce dernier cas à plus de 2-3 microns (Figure I-1). De par leur petite taille, les picoeucaryotes sont difficilement différentiables en microscopie classique, méthode habituellement utilisée pour étudier la diversité microbienne eucaryote. Depuis le début des années 90, en raison de la plasticité morphologique de certains organismes (Simon et al., 1994), le terme ―picoeucaryotes‖ est souvent utilisé plus librement pour inclure tous les protistes dont la taille avoisine les 3 microns, la limite supérieure de 2 μm étant peu réaliste dans certains cas (Iriarte et Purdie, 1994, Magazzu et Decembrini, 1995, Charpy et Blanchot, 1998, Bec et al., 2011). Afin d‘englober l‘ensemble des protistes difficilement identifiables à partir de leurs seules caractéristiques morphologiques (en microscopie), plusieurs auteurs ont depuis proposé d‘augmenter cette limite supérieure de taille à 5 µm. Ainsi, depuis une dizaine d‘années, diverses études marines (Díez et al., 2001a, Díez et al., 2001b, López-García et al., 2001) et plus récemment lacustres (Lefranc et al., 2005, Richards et al., 2005, Lefèvre et al., 2007, Lepère et al., 2007) ont considéré la diversité génétique et le rôle fonctionnel non plus seulement du picoplancton stricto sensu, mais plus généralement du petit nanoplancton de la fraction inférieure à 5 µm, l‘ensemble étant regroupé sous le terme anglais de ―small eukaryotes‖.

Des deux composantes picoplanctoniques, le “procaryoplancton”

(picocyanobactéries autotrophes, bactéries et archées hétérotrophes) (Heywood et al., 2006) est celle dont les études de taxonomie, de physiologie et d’écologie ont depuis longtemps été approfondies (e.g. Partensky et al., 1999, Aller et Kemp, 2008, Newton et al., 2011). A l’inverse, le ‟pico-eucaryoplancton” n’a été considéré que plus récemment au gré des découvertes de nouvelles espèces et grâce à l’apport des techniques de biologie moléculaire en écologie microbienne aquatique. Comprenant, selon les études, l’ensemble des eucaryotes unicellulaires d’une taille comprise entre 0,2-2 µm, 0,2-3 µm ou encore 0,2-5 µm (i.e. ‟small eukaryotes”), la communauté eucaryote picoplanctonique constitue un assemblage d’organismes encore mal connu à ce jour (composition

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taxonomique, abondance spécifique…) et ce notamment en raison de l’absence de caractères morphologiques distincts (en microscopie classique).

Dans ce manuscrit la communauté eucaryote de taille comprise entre 0,2 et 5 µm sera désignée sous le terme picoplancton.

II. ABONDANCE ET IMPORTANCE ECOLOGIQUE DU PICOPLANCTON

EUCARYOTE

La généralisation de l‘utilisation de la microscopie à épifluorescence ainsi que la cytométrie en flux depuis une vingtaine d‘années a permis d‘estimer l‘abondance et la productivité eucaryote picoplanctonique sur un large éventail d‘habitats (Tableau I-1). Ces études basées sur la taille et la pigmentation de ces microorganismes détectables par fluorescence ont permis de discriminer ces picoeucaryotes du reste de la communauté picoplanctonique. Ainsi, la plupart des études menées sur ces communautés, dont quelques unes sont résumées dans le tableau I-1, ont considéré les picoeucaryotes uniquement via leur composante photosynthétique autotrophe sans distinction taxonomique (à l‘exception dans ce tableau de Not et al. (2004)). De ces travaux découlent une variabilité d‘abondance relative de ces microorganismes eucaryotes selon les niveaux trophiques, le système étudié qu‘il soit marin, lagunaire ou lacustre et la répartition spatio-temporelle de cette communauté. Ainsi, les densités de ces picoeucaryotes atteignent typiquement 10² à 10⁴cellules.ml^-1 dans la zone euphotique lacustres et océaniques (Caron et al., 1999b), présentant respectivement des densités minimales et maximales en systèmes oligotrophe et eutrophe (Tableau I-1). Ainsi, Bec et al. (2011) ont révélé une structuration en classe de taille du picoplancton eucaryote selon l‘état trophique du milieu. La composante picoplanctonique de grande taille (2-3 µm) a tendance à dominer dans les systèmes eutrophes, notamment par la présence d‘algues vertes des genres Nannochloris et Chlorella-like principalement. A contrario, les picoeucaryotes appartenant aux classes de taille < 1 µm et de 1-2 µm représentent respectivement 16 et 25% de la densité picoeucaryote totale mais voient leur représentativité augmenter dans les systèmes aquatiques appauvris.

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Tableau I-1 Exemples d‘abondances de picoeucaryotes dans divers écosystèmes aquatiques (d‘eau douce, lagunaire ou marin) triées selon l‘état trophique du système étudié. Les études sont différentiées selon l‘outil de dénombrement utilisé, elles sont marquées d‘un astérisque (*) pour l‘utilisation de la cytométrie en flux et sont soulignées d‘une croix (†) lors de l‘utilisation de la microscopie à épifluorescence

Références Gamme d‘abondance des picoeucaroytes

(cellules.ml^-1)

Fractions étudiées Systèmes étudiés

 Eaux eutrophes

(Sorokin et al., 1996)† <10⁶ - 75.10⁶ 0,4-3 µm Lagunaire (Gobler et al., 2002)† 2,2.10⁵ - 6,4.10⁵ Aureococcus anophagefferens Marin (Hepperle et Krienitz, 2001)† 0 - 3,2.10⁵ non précisé Eau douce

 Eaux mésotrophes

(Personnic et al., 2009)* 10² - 4,8.10⁴ non précisé Eau douce (Courties et al., 1994)* 10⁴- 2.10⁵ Oestreococcus tauri Lagunaire

(Vaquer et al., 1996)* 5.10³ - 40.10³ <2 µm Lagunaire

(Worden et al., 2004)* 10⁴ - 3.10⁴ <2 µm Marin

(Not et al., 2004)† 10³ - 10⁴ 0,2-3 µm Marin

 Eaux oligotrophes (Fahnenstiel et al., 1991)* †

(Duhamel et al., 2006)*

10³- 16,9.10³ 2.10³- 14.10³

<3 µm 0,2-2 µm

Eau douce Eau douce

(Vanucci et Bruni, 1998)† 18,3 - 4.10³ 0,2-3 µm Marin

(Jacquet et al., 1998)* 2,5.10³ <3 µm Marin

(Gregori et al., 2001)* 3.10⁴ <2 µm Marin

Cependant et afin de considérer l‘ensemble du picoplancton eucaryote (pigmentés et non pigmentés), plusieurs travaux se sont intéressés à quantifier ce compartiment, par microscopie à épifluorescence couplée à l‘utilisation de sondes oligonucléotidiques généralistes ciblant l‘ensemble de la communauté eucaryote, en milieu marin initialement (Not et al., 2002, Biegala et al., 2003, Not et al., 2005), puis plus récemment en système lacustre (Lepère et al., 2008). Ainsi par TSA-FISH (Tyramide Signal Amplification- Fluorescent in situ hybridization) et l‘emploi d‘un mélange de sondes oligonucleotidiques ciblant l‘ensemble des eucaryotes (EUK1209R-CHLO01- NCHLO01), Not et al. (2002) ont pu attribuer des densités picoeucaryotes maximales de 1,7.10⁴ cellules.ml^-1 dans les eaux atlantiques, tandis que Not et al. (2005) constatent des variations d‘abondances picoeucaryotes de 2,6.10³ à 1,02.10⁴ cellules.ml^-1 dans les eaux arctiques dont 75%

serait constitué par sa seule composante photosynthétique. Les densités picoeucaryotes sont

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également du même ordre de grandeur en système d‘eau douce avec des abondances avoisinant les 2.10⁴cellules.ml^-1 présentent dans la zone euphotique du lac mésotrophe du Bourget (Lepère et al., 2008).

Depuis une vingtaine d’années, quelques connaissances parcellaires ont été acquises sur l’importance quantitative du picoplancton eucaryote dans les eaux marines et lacustres. Cependant ces études ont souvent considéré l’assemblage picoeucaryote comme un seul ensemble ou uniquement à travers sa composante pigmentée, masquant ainsi une diversité taxonomique et fonctionnelle importante.

III. STRUCTURE DE LA COMMUNAUTE PICOPLANCTONIQUE EUCARYOTE LACUSTRE

En écologie aquatique, la compréhension du fonctionnement des écosystèmes requiert en amont une caractérisation des différents éléments constitutifs des réseaux trophiques planctoniques. La composition des communautés microbiennes, et notamment de la communauté picoplanctonique eucaryote, se heurte en premier lieu à la définition donnée à la notion d‘espèce microbienne. En effet, si l‘on s‘attache au concept d‘espèce biologique selon lequel ―l‘espèce est un groupe de population naturelle effectivement ou potentiellement interfécondes, qui sont génétiquement isolées d‘autres groupes similaires‖ (Mayr, 1942), ce dernier s‘avère difficilement applicable aux microorganismes pour lesquels le mode de reproduction est généralement clonal. Ainsi, dans un premier temps, pour caractériser la communauté eucaryote unicellulaire, les écologues se sont basés sur des critères de ressemblances et de différences au niveau morphologique et pigmentaire, définissant ainsi le concept d‘espèce morphologique ou morphotype. Jusqu‘à présent, sur ces critères et par des approches culturales et des techniques d‘études telles que la microscopie électronique, les analyses pigmentaires ou encore la cytométrie en flux, plusieurs espèces picoplanctoniques algales ont pu être caractérisées.

Cependant, bien qu‘une grande diversité morphologique et des architectures cellulaires variées aient permis de procéder aux premières classifications phylogénétiques de la communauté eucaryote picoplanctonique (Figure I-1), une convergence vers une forme coccoïde de quasiment toute les lignées algales dans cette fraction de taille est également observée (Potter et al., 1997).

Ces similarités morphologiques masquant potentiellement une diversité biologique notable rendent ce concept difficilement applicable pour ces microorganismes de petite taille. Il est ainsi

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difficile sur la seule base de critères morphologiques de définir une espèce eucaryote picoplanctonique et d‘estimer ainsi leur diversité. D‘autant plus que l‘approche culturale a ses propres limites, de nombreuses espèces étant en effet pour l‘instant encore réfractaires à leur mise en culture, la caractérisation de la diversité picoeucaryote par ses techniques se révèle ainsi biaisée.

Au cours de ces deux dernières décennies, l‘application des techniques de biologie moléculaire en écologie microbienne aquatique a permis de sonder plus profondément la diversité de ces microorganismes en utilisant des techniques s‘émancipant de leur culture. Ceci a permis de caractériser la communauté picoeucaryote par sa composante génétique (suivant le concept

―d‘espèce génétique‖ défini par Caron et al. (2009b) pour caractériser la diversité eucaryote microbienne).

III.1. Apport des techniques moléculaires en écologie microbienne aquatique

L‘application de ces techniques à l‘étude de la diversité passe par le choix d‘un marqueur moléculaire adéquat. Les ARN ribosomaux (ARNr) se sont imposés comme des marqueurs phylogénétiques appropriés de par leur distribution universelle au sein du vivant et leur constance dans leur fonction au cours de l'évolution, mais également de par la présence de régions de séquences fortement conservées entremêlées avec des régions plus variables (Gutell et al., 1994) rendant l‘analyse comparative possible. Les analyses phylogénétiques des gènes codant pour la sous unité de l‘ARNr ont permis de réorganiser l‘arbre du vivant en trois grands domaines, les Bactéries, les Archaea et les Eucaryotes (Woese et al., 1990), modifiant ainsi notre vision sur l‘origine et l‘évolution des organismes vivants.

Jusque là, les systématiciens s‘accordaient pour un domaine eucaryote divisé en quatre grandes lignées, les animaux, les champignons, les plantes et les protistes (Whittaker, 1969). Ce n‘est qu‘en 1986 que débute réellement la phylogénie moléculaire des protistes à travers le séquençage complet de 15 ARNr 18S par Sogin et al. (1986). Depuis le développement de ces techniques de biologie moléculaire en écologie aquatique (et notamment marine) a permis d‘enrichir les connaissances de la diversité des cellules picoplanctoniques, et de définir de nouveaux groupes taxonomiques (au sein des alvéolés par López-García et al. (2001) ou des straménopiles par Massana et al. (2002)).

Différentes techniques de biologie moléculaire dites d‘empreinte génétique sont

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également utilisées à l‘heure actuelle afin de caractériser la richesse spécifique² et la diversité³ de ces microorganismes. Ces techniques reposent initialement sur une amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) de l‘ADN ribosomal 18S (ADNr 18S) issus d‘ADN génomique environnemental et du criblage de ces amplicons par des enzymes de restriction ou divers agents dénaturants. Elles permettent d‘une part d‘étudier la diversité des picoeucaryotes et d‘autre part, de comparer rapidement les assemblages microbiens naturels (Head et al., 1998, Dorigo et al., 2005). Quelques unes d‘entre elles sont employées couramment en écologie lacustre. Ainsi, certains auteurs ont recouru à la T-RFLP ou technique de polymorphisme des longueurs des fragments de restriction terminaux (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) (Lepère et al., 2006, Lepère et al., 2007), une méthode reproductible qui permet une analyse semi- quantitative de la diversité et une comparaison d‘un grand nombre d‘échantillons tout en générant des empreintes moléculaires de qualité (fragment de taille précise). Les techniques d‘électrophorèse sur gel en gradient dénaturant sont également des outils moléculaires efficaces pour caractériser la diversité spécifique de la communauté picoplanctonique. Ainsi, Tarbe et al.

(2011) et Zhao et al. (2011) ont opté pour l‘emploi de la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) afin de décrire les populations picoeucaryotes lacustres. Toutefois, ces méthodes d‘empreintes moléculaires sont souvent associées à des approches par séquençage de librairies de clones (Lepère et al., 2006, Tarbe et al., 2011, Zhao, et al., 2011).

Le séquençage selon la méthode de Sanger (Sanger et al., 1977), après clonage de l‘ADN ribosomal permet, contrairement aux techniques d‘empreintes génétiques, d‘obtenir une information taxonomique immédiate enrichissant ainsi les phylogénies moléculaires. Après clonage des produits amplifiés par PCR, le séquençage s‘effectue soit directement sur des clones choisis aléatoirement (e.g. Moon-van der Staay et al., 2001), soit après sélection de ceux présentant, après criblage par T-RFLP, des profils de restriction distincts (e.g. Lefranc et al., 2005). Par ces approches de caractérisation moléculaire de la communauté eucaryote par clonage-séquençage de l‘ADNr 18S s‘entrevoit le concept d‘espèce ―génétique‖ à travers la notion d‘Unité Taxonomique Opérationelle (ou OTUs pour ‟Opérational Taxonomic Units‖) permettant ainsi de s‘affranchir des difficultés de définition d'une espèce microbienne. Certains auteurs se sont attachés à définir

2 Richesse totale (S) correspondant au nombre total d'espèces d‘un peuplement donné considérées dans un écosystème donné (Ramade, 2009).

3 Diversité spécifique tenant compte de l‘importance relative des espèces d‘un peuplement présentes dans un milieu donné dont l‘étude quantitative peut être réalisée selon diverses approches fondées sur l‘usage d‘indices de diversité (Ramade, 2009).

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un OTU comme tout profil RFLP distinct, d‘autres ont plutôt considéré sous cette dénomination taxonomique tout groupe de séquence d‘ADNr 18S dans lequel les séquences se ressemblent à hauteur de 99% (Richards et al., 2005). Cependant, compte-tenu des biais inhérents au clonage (Forns et al., 1997) et à la méthode traditionnelle de séquençage selon Sanger (Bent et Forney, 2008) pouvant (selon l‘effort de séquencage) sous estimer la diversité présente, de nouvelles approches de séquençage dites de nouvelle génération ou NGS (Next-Generation Sequencing) se sont développées ces dernières années. L‘utilisation des techniques de séquençage massif du type pyroséquençage (Ronaghi, 2001) est basée sur un séquençage de synthèse (par opposition au séquençage par ‗‗termination‘‘ (méthode Sanger)) réalisé directement sur l‘ADN génomique issu de l‘environnement sans étape préalable de clonage. Elle permet, en un temps très court, la génération d‘un grand nombre de séquences (jusqu‘à 1,6 million) et ainsi une estimation ―moins- biaisée‖ de la diversité présente de par une meilleure considération des organismes rares non détectés traditionnellement. A l‘heure actuelle, ce séquençage haut débit permet d‘obtenir des lectures d‘une taille moyenne de 400 pb. A l‘instar des premiers travaux menés en milieu aquatique portant sur la communauté procaryote bactérienne par Sogin et al. (2006) et Huber et al.

(2007), l‘emploi des techniques émergentes de séquençage haut débit s‘est démocratisé afin de recenser exhaustivement la diversité microbienne eucaryote lacustre et d‘apporter un début de réponse concernant la distribution de ces microorganismes (Bråte et al., 2010, Nolte et al., 2010, Medinger et al., 2010, Monchy et al., 2011). Ces premiers travaux réalisés en milieux d‘eau douce se sont exclusivement attachés à caractériser la communauté microbienne eucaryote totale, sans fractionnement préalable (fraction 0,2-160 µm exclusivement). A notre connaissance, l‘étude de la communauté picoeucaryote stricto sensu (0,2-3/5 µm) par ces approches de séquençage de nouvelle génération n‘a, à l‘heure actuelle, été réalisée qu‘en systèmes marins (Cheung et al., 2010, Quaiser et al., 2011). De telles études menées en systèmes lacustres, de par la quantité d‘informations générées par ces NGS, permettraient une description plus fine de la structure de la communauté microbienne eucaryote dans ces eaux et de ses changements au cours du temps (Nolte et al., 2010) ou à l‘échelle spatiale (Monchy et al., 2011).

Depuis une décennie, l’étude de la diversité picoeucaryote a fait l’objet d’un intérêt grandissant en écologie marine par ces approches moléculaires, s’intéressant à une grande variété d’habitats, des zones oligotrophes atlantiques (Moon-van der Staay et al., 2001) aux fosses abyssales (López-García et al., 2001) en passant par les écosystèmes côtiers (Massana et al., 2004). L’émergence de ces outils moléculaires a ainsi permis d’apporter des premiers éléments de réponse aux questions relatives à la biogéographie,

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aux patrons de distribution et dynamiques de ces microrganismes. De même, depuis 2005, et sous l’égide de cette problématique centrale en écologie microbienne, les études décrivant la diversité des picoeucaryotes se sont naturellement étendues aux écosystèmes lacustres.

III.2. Richesse spécifique et organisation du pico-eucaryoplancton lacustre Les études appréhendant la diversité des eucaryotes en milieu lacustre se sont tout d‘abord intéressées à caractériser cette dernière dans les couches d‘eaux supérieures, éclairées et riches en oxygène, lieux privilégiés de la production primaire de biomasse et de l‘acquisition des nutriments inorganiques (Sigee, 2005). Au moyen de techniques d‘empreintes génétiques citées ci- dessus, ces travaux révèlent une richesse spécifique variable selon le système étudié, et ce, quelle que soit l‘approche moléculaire employée (Figure I-2). En effet, au regard de plusieurs écosystèmes lacustres se différant par leur statut trophique, les richesses spécifiques picoeucaryotes obtenues fluctuent de 42 à 171 T-RFs déterminés par T-RFLP (Lepère et al., 2007, Lepère et al., 2008) (Figure I-2A), et de 12 à 24 bandes caractérisées par DGGE (Zhao et al., 2011) (Figure I-2B). Bien que ces deux approches s‘avèrent difficilement comparables compte tenu des limitations propres à chacune (pour revue, Dorigo et al., 2005), leur utilisation a permis une première estimation des fluctuations de richesse spécifique de la communauté picoeucaryote.

De même, les caractérisations de la diversité par l‘approche de clonage-séquençage ont révélé des variations de richesse spécifique tout aussi manifestes selon le statut trophique de l‘écosystème étudié, allant de 12 OTUs dans un écosystème eutrophe (lac d‘Aydat) à 129 OTUs dans un milieu mésotrophe (lac du Bourget) (Lefranc et al., 2005, Lepère et al., 2008) (Figure I-2A). Les richesses spécifiques ainsi mesurées par ces approches moléculaires restent toutefois des estimations, et sont fortement tributaires de l‘effort de séquençage. L‘indice non paramétrique S_Chao1 (Chao, 1989) a notamment été considéré comme un estimateur approprié pour l‘étude de la diversité in situ par séquençage d‘un marqueur phylogénétique (Hughes et al., 2001).

Ainsi, les richesses spécifiques les plus faibles semblent caractériser les milieux oligotrophes et eutrophes (S_Chao1de 15,6 à 27) alors que les lacs de statut trophique intermédiaire (oligomésotrophe-mésotrophe) se révèlent extrêmement riches en picoeucaryotes (S_Chao1 de 72,5 à 179,7) (Figure I-2A). En conditions expérimentales, la diversité algale suit une progression en cloche le long d‘un gradient d‘eutrophisation résultant d‘un compromis notamment entre la compétition, la prédation et l'accessibilité de ressources nutritives, ainsi que beaucoup d'autres

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Figure I-2 Variation de la richesse spécifique des picoeucaryotes lacustres de la zone épilimnique de différents écosystèmes lacustres différent par leur statut trophique. A) Richesse spécifique estimée par T-RFLP (enzyme de restriction MspI) ou par séqeunçage, d‘après Lepère (2007). La richesse spécifique totale est déterminée par l‘indice non paramétrique SChao1 (mentionné en gras au dessus des histogrammes). B) Richesse spécifique de plusieurs systèmes lacustres estimée par DGGE par Zhao et al. (2011).

B) A)

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processus écologiques (Tilman, 1982, Leibold, 1999, Dodson et al., 2000). Une organisation de la diversité picoeucaryote de même nature pourrait s‘appliquer en système lacustre (Lefranc et al,.

2005). En effet, selon ses auteurs, le développement du picoplancton eucaryote pourrait être limité par les ressources nutritives dans les environnements oligotrophes et par la prédation et la compétition dans les environnements eutrophisés. Toutefois, même si une tendance à une progression en cloche de la diversité eucaryote picoplanctonique semble se dégager, il serait risqué de limiter au seul statut trophique la raison des variations de richesse spécifique observées.

En effet, une étude portant sur un système oligotrophe (lac George) (Richards et al., 2005), révèle une richesse spécifique épilimnique relativement similaire à celle observée sur le lac mésotrophe du Bourget par Lepère et al. (2008) (125 vs 129 OTUs).

A l‘instar des variations à l‘échelle géographique (ou inter-lacs), des différences à l‘échelle temporelle de la richesse spécifique des picoeucaryotes sont à signaler. Des changements de diversité des groupes eucaryotes picoplanctoniques ont ainsi été révélés au cours d‘une dynamique saisonnière réalisée sur le lac Pavin par la technique de T-RFLP, caractérisés par une richesse spécifique fluctuant entre 30 et 161 T-RFs à 5 m et de 99 à 157 T-RFs à 30 m de profondeur (Lepère et al., 2006). Ces variations temporelles de la diversité peuvent atteindre parfois des amplitudes près de trois fois plus importante entre deux dates : 96 vs 33 OTUs, respectivement au printemps et en été sur le lac du Bourget (Lepère et al., 2008). Ces variations sont également observables à l‘échelle spatiale, non seulement dans la zone épilimnique ou métalimnique, mais également dans des zones hypolimniques réputées plus stables au regard des conditions physico-chimiques (Lepère et al., 2006, Lefèvre et al., 2007, Tarbe et al., 2011). Des variations de diversité peuvent également être observées par les méthodes de séquençage massif (e.g. pyroséquençage) dont la profondeur d‘analyse permet une estimation plus précise de la richesse spécifique présente. Ainsi, des différences de communautés eucaryotes (et plus particulièrement fongiques) à l‘échelle spatiale (zone littorale vs centrale) au sein des lacs d‘Aydat et du Pavin ont été observées tant en terme de composition que d‘importance relative des taxons caractérisés (Monchy et al., 2011). Egalement, Nolte et al. (2010) ont révélé, par pyroséquençage, une prédominance au cours du temps de quelques taxa, contrastée par un haut taux de renouvellement des espèces rares. Ces résultats menés à une échelle mensuelle consolident ainsi la nécessité d‘un échantillonnage temporel pour une estimation adéquate de la diversité et de la richesse spécifique de ces microorganismes.

A l‘image des communautés de macroorganismes (Gibson et al., 1999), les populations microbiennes peuvent être organisées selon leurs importance quantitative, répartition et ubiquité

A)

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dans les systèmes aquatiques. Le concept d'espèces ―core‖ (omniprésentes dans le milieu) et

―satellites‖ (rares et confinées à quelques sites) appliqué à ces microorganismes s‘est développé ces dernières années pour donner une base théorique à la classification de la communauté microbienne en espèces dominantes, subalternes et transitoires (Pedrós-Alió, 2006). Cette notion de ―rare biosphère‖ a été révélée chez les bactéries marines (Sogin et al., 2006) et lacustres (Humbert et al., 2009) montrant ainsi une structuration de cette communauté en quelques espèces dominantes peu nombreuses contrastant avec une grande richesse d‘espèces rares. Bien que les méthodes de séquençage massif se révèlent être de plus en plus nécessaires pour estimer au mieux la richesse d‘un assemblage microbien donné (Nolte et al., 2010), les méthodes moléculaires classiques peuvent s‘avérer une première approche efficace. Ainsi, Lepère et al. (2006) ont révélé par la méthode semi-quantitative de T-RFLP que seuls 8 T-RFs (8,5% des T-RFs totaux) dominaient la communauté picoeucaryote du lac oligomésotrophe du Pavin. En effet, ces derniers représentent 67% de l‘aire totale, tandis que l‘essentiel de la diversité eucaryote était constitué par des T-RFs mineurs (91,5% des T-RFs totaux). Des résultats relativement similaires (9 T-RFs représentant 62% de l‘aire totale) ont été obtenus par ces mêmes auteurs dans une étude en mésocosmes en conditions d‘hyper-eutrophisation (Lepère et al., 2007).

La richesse spécifique picoeucaryote déterminée en milieux lacustres ces dernières années, qu’elle soit estimée (nombres de T-RFs, OTUs ou bandes DGGE) ou théorique (S_Chao1), révèle des variations suivant le système et les échelles d’étude (temporelle ou spatiale). Toutefois, la communauté eucaryote picoplanctonique apparaît plus riche pour des écosystèmes d’eau douce de statuts trophiques intermédiaires (oligomésotrophe et mésotrophe). Par les approches de séquençage et d’empreintes génétiques des gènes codant pour l’ARNr 18S, une structuration de la communauté microbienne eucaryote en quelques taxa dominants (“core taxa”) et en une majorité d’espèces rares semble se dégager. Ces travaux ont permis un premier tableau de la composition taxonomique de la communauté picoeucaryote dans ces écosystèmes d’eau douce.

III.3. Composition taxonomique du picoplancton eucaryote lacustre III.3.1 Quelques évolutions de la classification des Eucaryotes

La phylogénie actuelle des eucaryotes réunit les éléments de phylogénie moléculaire acquis