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P r B R i

C C a a r r a a c c t t é é r r i i s s a a t t i i o o n n d d u u p p o o t t e e n n t t i i e e l l

n n eu e u ro r og g é é n n i i q q u u e e d d es e s c c el e ll lu ul le es s d d e e la l a c c rê r êt t e e

n n e e u u r r a a l l e e e e t t d d e e s s c c e e l l l l u u l l e e s s m m é é s s e e n n c c h h y y m m a a t t e e u u s s e e s s d d e e la l a mo m oe el l l l e e o o s s s s eu e u s s e e

Em E me er re en nc ce e La L au ud de et t

Th T hè ès se e pr p ré és se en nt té ée e e en n vu v ue e de d e l l’ ’o ob bt te en nt ti io on n du d u gr g ra ad de e de d e

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An A nn né ée e ac a ca ad dé ém mi iq qu ue e 2 20 01 11 1- -2 20 01 12 2

Le cheminement d’une thèse est loin d’être un long fleuve tranquille et nul de saurait le parcourir seul. Ce mémoire n’aurait pu voir le jour sans la contribution ni le soutien de nombreuses personnes.

Ainsi, au terme de ce doctorat, ma plus grande reconnaissance va au Pr.

Bernard Rogister, qui m’a donné l’opportunité de découvrir et de développer l’aventure

« crête neurale ». Plus qu’un sujet palpitant, c’est une véritable expérience de vie que tu m’as offerte. Tes conseils, ta disponibilité, ton écoute, mais aussi tes désormais cultissimes « quoi de neuf ? » ont guidé mes pas tout au long de ce parcours. Je sais que mon caractère obstiné n’a pas toujours été facile à gérer au quotidien, cependant, tu as su me laisser une certaine autonomie tout en n’hésitant pas à recadrer les choses lorsque cela s’est avéré nécessaire. Par ce travail, j’espère, avant tout, avoir pu répondre un minimum à tes attentes.

Un grand merci au Dr. Sabine Wislet-Gendebien pour son suivi et ses conseils tout au long de cette thèse. Nous n’avons pas toujours eu la même vision des choses mais tu as toujours été disponible pour moi et d’un enthousiasme plus que communicatif envers nos recherches.

J’exprime également toute ma gratitude aux nombreuses personnes avec lesquelles nous avons collaboré et sans qui certaines expériences n’auraient pu être menées à bien. Tout d’abord, le Pr. Lukas Sommer, qui m’a accueilli à plusieurs reprises dans son laboratoire, ainsi que les Dr. Christine Wong et Olga Shakhova, pour nous avoir permis de travailler avec leur souris transgéniques, mais aussi pour leur conseils avisés.

Toute ma reconnaissance envers le Pr. Marie-Paule Defresne, le Dr. Chantal Humblet ainsi qu’envers Géraldine Poncin, pour leur disponibilité, leurs explications et leurs conseils concernant la moelle osseuse.

Un grand merci au Pr. Vincent Seutin et au Dr. Philippe Alix pour m’avoir initiée aux obscures facettes de l’électrophysiologie et pour avoir pris le temps de me faire découvrir leur univers.

Je voudrai aussi remercier le Dr. Sandra Ormenese ainsi que Rafaat Stefan pour m’avoir enseigné les techniques de tri cellulaire.

Enfin, non des moindres, que serait cette thèse sans Madame Patricia Ernst ? Merci pour tes enseignements en matière de culture cellulaire, mais aussi pour ta rigueur, ta disponibilité et ta franchise.

Aux Dr. Malgrange, Nguyen, Franzen, Bettendorf et Leprince, j’adresse de vifs remerciements pour leurs conseils scientifiques et techniques.

Je remercie une nouvelle fois le Pr. Marie-Paule Defresne pour avoir accepté de

présider ce jury ainsi que les autres membres du jury pour le temps qu’ils auront

consacré à la lecture de ce mémoire.

Je me dois, par ailleurs, d’adresser une petite pensée à toutes les souris qui ont consenti à sacrifier leur vie « pour le bien de la science ».

Avec mes compagnons de route de l’équipe « neurobiologie du développement », tant les membres passés que présents, c’est une aventure humaine inoubliable qu’il m’a été donné de vivre. D’abord, avec le Dr. Dorothée « Chantal » Pirotte-Barracato, ma taxi-women perso … que de délires vécus mais surtout, encore à vivre (SS, c’est le moment, c’est l’instant !!!) ; le Dr. Jérôme « Pt Ours » Kroonen pour son humour naturellement déconcertant ; le Dr. Stéphanie Hody pour sa bonne humeur quotidienne et son soucis envers ma condition physique ; Linda pour son soutien et sa patience indéfectible en période de crise ; Jess pour sa naïveté inévitablement attachante, que du bonheur dans ta nouvelle vie ; Méli et Alice, nos techniciennes de choc, toujours souriantes et toujours prêtes à aider (Alice, aucune souris ne te résiste).

Quant à la relève, Vi et Nico, votre optimisme et vos encouragements ces derniers mois ont été une vraie bénédiction, que du courage à vous pour la suite ! Et Vi, tu es quelqu’un de génial alors surtout, crois en toi ; Nico, y a rire et rire, mais…

Je voudrais aussi adresser une pensée particulière aux membres de la « Grisar’s team », mon premier laboratoire d’accueil. Au Boss, aux Bernard, à Laurence « Sue Ellen » DN et Arlette, merci de m’avoir initié, et surtout donné goût, à la recherche.

De plus, cette première aventure scientifique m’a surtout permis de développer la plus merveilleuse relation d’amitié qui soit ! Ma Crinou, je voudrai te dire à quel point ton soutien et ta générosité ont été et sont toujours si précieux pour moi. Merci simplement d’être là et de continuer à partager tous les (meilleurs) moments de la vie avec moi.

Au détour du couloir ouest, c’est une autre amitié qui s’est nouée avec toi ma petite Malou. De nos soirées arrosées à nos petites pauses thé-café, ta présence, ta franchise et tes conseils (tant professionnels que personnels) ont rendu ce parcours inoubliable.

Je ne peux toutefois oublier tous les autres membres du Giga-Neuroscience qui participent ou ont participé quotidiennement à l’ambiance exceptionnelle et souvent festive de ces lieux : Sophiechou, Pte Marie, Mo-Rice, Marjo, Tizia, BrockOli, Kareneke, Aurore, Catherine, Andrew, Céline, Pte Pat, Pt Renaud, Lau-Lau, Linda, Laurence D, Béné, Benja, PB, Nico, Arnaud, Alex, Sylvain, Jean, Noémie, Rosy, Prisci, Cédric, Juliette, Charlotte, Thierry, Marie, Azzedine, Dorothée, Dominique, sans oublier nos super secrétaires Lari et Jess.

Tout au long de cette aventure, j’ai pu également compter sur le soutien d’autres

personnes chères à mon cœur. Merci à mes parents, ma mamy et mes frères et sœurs de

me supporter et de m’encourager depuis toujours, mais aussi à mon petit William, le

nouveau rayon de soleil de ma vie.

A mes amis les plus chers, ma Vali (depuis toujours), Lo et Greg, vous êtes toujours là pour moi et je ne vous le rends peut-être pas assez souvent. De tout cœur, merci pour votre amitié et votre soutien.

Mais je n’oublie pas non plus Stepheke, Cassoulette, Chri-Chri, Cédric, Nath, Virgi, Marie, Céline M, Céline F et Maud.

Pour conclure, à mon amoureux qui me rend la vie si belle depuis plus de 20

mois, je ne saurai trouver les mots pour te dire à quel point ta présence à mes côtés est

un pur bonheur. Merci de m’aimer et de m’accepter telle que je suis.

Liste des abréviations 1

I Introduction 5

1. Cellules souches et développement embryonnaire 8

1.1. Développement embryonnaire 9

1.2. Formation de la crête neurale (CN) 11

1.3. Développement mésodermique 13

1.4. Migration et différenciation des CCN 17

1.5. Bases moléculaires du développement de la CN 20 1.5.1. Facteurs impliqués dans la formation des CCN 21 1.5.2. Facteurs impliqués dans le développement mésodermique 22 1.5.3. Facteurs impliqués dans la migration des CCN 23

1.5.4. Multipotence des CCN 27

2. Cellules souches fœtales et adultes 32

2.1. Persistance de CSM au stade périnatal et chez l’adulte 33 2.2. Persistance de CSCN au stade périnatal et chez l’adulte 35

2.3. La moelle osseuse 40

2.3.1. Colonisation de la moelle osseuse 41

2.3.2. CSCN et CSH 42

3. Cellules souches et thérapie cellulaire 43

3.1. Cellules ES et « iPS » 43

3.2. Potentiel thérapeutique des CSM et des CSCN 44

4. Objectifs 46

II Présence de CSCN dans la moelle osseuse adulte

49

1. Une population neurogénique parmi les cellules

stromales 51

2. La technique du fate-mapping 52

3. Identification de CCN dans la moelle osseuse

adulte 53

3.1. Quantification des CCN de la moelle osseuse adulte 53 3.2. Visualisation de CCN au sein de la moelle osseuse adulte 54 3.3. Augmentation de la proportion de CCN avec les passages 55

4. Caractère souche des CCN de la moelle osseuse 56

4.1. Auto-renouvellement des CCN de la moelle osseuse 56 4.2. Multipotentialité des CCN de la moelle osseuse 57

4.2.1. Destins mésenchymateux 59

4.2.2. Destins nerveux 60

5. Conclusions 65

III Potentiel neurogénique des cellules stromales

de la moelle osseuse adulte 71

1. Les cellules nestine-positives de la moelle osseuse

ne sont pas toutes dérivées de la CN 73

2. Comparaison entre les CSCN et les CSM de la

moelle osseuse 74

2.1. Génération de populations clonales 75

2.2. Multipotentialité des CSCN et des CSM 76

2.2.1. Destins mésenchymateux 76

2.2.2. Destins nerveux 78

2.3. Analyse transcriptomique des CSCN et des CSM 81

3. Séparation des CSCN et des CSM 85

3.1. Marqueurs membranaires 86

3.2. Purification des CCN par cytométrie en flux 88

4. Conclusions 90

IV Wnt1 et BMP2 recrutent les cellules

neurogéniques de la moelle osseuse adulte 97

1. Effet des facteurs Wnt1 et BMP2 sur la

proportion de cellules nestine-positives parmi les

cellules stromales 99

2. Effet des facteurs Wnt1 et BMP2 sur le potentiel

neurogénique des cellules stromales 100

3. Recrutement de CCN neurogéniques par les

facteurs Wnt1 et BMP2 101

3.1. Génération de populations clonales 101

3.2. Multipotentialité des cellules recrutées par Wnt1 et BMP2 102

3.2.1. Destins mésenchymateux 102

3.2.2. Destins nerveux 103

4. Effet des facteurs Wnt1 et BMP2 sur la

proportion de CCN parmi les cellules stromales 104

5. Conclusions 105

V Discussion générale ¹¹¹

VI Bibliographie ¹¹⁹

Annexes ¹³⁵

1

Liste des abréviations

AAP Activité Alcaline Phosphatase

Abca ATP-binding cassette, sub-family A

AD Aorte Dorsale

AF Arc pharyngé

AP Activated enhancer-binding Protein

AGM Aorte-Gonado-Mésonéphros

ANOVA ANalysis Of VAriance

BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor bFGF basic Fibroblast Growth Factor

bHLH basic Helix-Loop-Helix

BMP Bone Morphogenic Protein

CCN Cellule (dérivée) de la Crête Neurale CFU-F Colony Forming Unit-Fibroblast

CN Crête Neurale

Coll. Collaborateur

CSN Cellule Souche Nerveuse

CSCN Cellule Souche de la Crête Neurale

CSH Cellule Souche Hématopoïétique

CSM Cellule Souche Mésenchymateuse

CVD Canal voltage-dépendant

Cxcr Chemokine C-X-C motif receptor

DAPI 4’-6-Diamidino-2-phénylindole dihydrochloride

Dlx Distal-less homeobox

E Jour embryonnaire post-conception

EGF Epithelial Growth Factor

Eph Ephrin receptor

ErbB Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog, type B

ES Embryonic stem

ET Endothéline

Etrb Endothelin receptor type B

EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FBS Fetal Bovine Serum

FGF Fibroblast Growth Factor

FITC Fluorescéine Isothiocyanate

FSC Forward Scatter

FoxD Forkhead box D

GC Grains Cérébelleux

GD Gyrus denté

GDNF Glial cell-Derived Neurotrophic Factor

GEO Gene Expression Omnibus

2

GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein

GFP Green Fluorescent Protein

GRD Ganglion de la Racine Dorsale

Hes Hairy and enhancer of split

HLA Human Leucocyte Antigen

Hox Homeobox

ICF Immunocytofluorescence

Id Inhibitor of DNA binding

IGF Insulin-like Growth Factor

iPS induced-Pluripotent Stem cell

Kit Proto-oncogene tyrosine-protein kinase

Klf Kruppel-like factor

L1cam L1 cell adhesion molecule

L-Dopa 3-(3,4-dihydroxyphényl)-L-alanine

LNGFR – p75 ^NTR Low-affinity Nerve Growth Factor Receptor MAP Microtubule-Associated Protein

MAPC Multipotent Adult Progenitor Cell

Mash Aachaete-scute complex homolog

MEC Matrice Extracellulaire

Mitf Microphthalmia-associated transcription factor

Msl Male-specific lethal

Myc Myelocytomatosis oncogene

N Notochorde

Ncam Neural cell adhesion molecule

Neo Néomycine

Ngn Neurogénine

NGF Nerve Growth Factor

Nrcam Neuronal cell adhesion molecule

Nrg Neuréguline

Nrp Neuropiline

NT Neurotrophine

Oct Octamer-binding protein

P Passage

P0 Myelin Protein 0

Pax Paired box

PBS Phosphate Buffered Saline

PE Phycoérythrine

PFA Paraformaldéhyde

PFN Processus Fronto-Nasal

Phox Paired-like homeobox

Plp1 Proteolipid protein

PMP Peripheral Myelin Protein

r rhombomère

3

Rex Ring-exported protein

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction S1pr Sphingosine-1-phosphate receptor

SCF Stem Cell Factor

Sema Sémaphorine

Shh Sonic hedgehog

SMA Smooth Muscle Actin

SNC Système Nerveux Central

SNP Système Nerveux Périphérique

Sox SRY-box containing gene

SSEA Stage-Specific Embryonic Antigen

TEA Tétraethylamonium

TEM Transition Epithélio-Mésenchymateuse

TGF Transforming Growth Factor

Thbd Thrombomoduline

TN Tube Neural

Trk Tropomyosin-receptor-kinase

Trp Tyrosinase-related protein

TTX Tétrodotoxine

Vcam Vascular cell adhesion molecule

Wnt Wingless/INT-related MMTV integration site X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside

Zic Zinc finger protein

ZSV Zone sous-ventriculaire

Partie I :

Introduction

7 Dans de nombreuses pathologies neurologiques, la plupart des traitements échouent encore à restaurer la fonctionnalité des tissus endommagés. Au mieux, les traitements actuels arrêtent le processus physiopathologique en cours et permettent la cicatrisation du tissu lésé, mais la restauration de la fonction neurologique altérée reste souvent très limitée. Dans ce contexte, la perspective de « greffe de cellules immatures » dans le but d’aider à la récupération de la fonction nerveuse alimente de nombreux espoirs. La recherche en matière de thérapie cellulaire a d’ailleurs bénéficié des grandes avancées dans la connaissance de la biologie des cellules souches, notamment des cellules souches somatiques adultes. Prélevées chez le patient lui-même, l’usage de ces cellules éviterait ainsi tout risque de rejet. Ces dernières années, de nombreuses niches hébergeant des cellules souches somatiques ont été mises en évidence au sein de l’organisme. Il reste, cependant, certains points à éclaircir avant toute application thérapeutique : quelles sont les potentialités de différenciation et d’intégration de ces cellules ? Quelle source cellulaire serait la plus adaptée pour telle ou telle pathologie ?

C’est pourquoi les différentes populations souches de la moelle osseuse font l’objet de nombreuses études. Facilité d’accès, capacité d’auto-renouvellement, plasticité phénotypique et possibilité de greffes autologues en font des sources cellulaires idéales. La moelle osseuse contient deux populations de cellules souches : les cellules souches hématopoïétiques et les cellules souches stromales, dont la greffe est déjà employée pour des maladies telles que la leucémie. Concernant les cellules stromales, il a été suggéré récemment que cette population n’était pas homogène et contenait des cellules de différentes origines embryologiques. En effet, une sous- population de cellules du stroma médullaire serait issue de la crête neurale.

Le présent mémoire est consacré à l’étude de cette sous-population, dont

l’existence était encore hypothétique au moment où nous avons débuté nos travaux

expérimentaux. Il nous a paru intéressant de rappeler, dans cette introduction, les

origines embryologiques des cellules stromales et des cellules de la crête neurale. Plus

encore, nous avons voulu souligner ici l’interdépendance qu’entretiennent le mésoderme

8

et la crête neurale tout au long du développement embryonnaire, avant que leurs dérivés ne se retrouvent conjointement dans la moelle osseuse chez l’adulte. Seront également exposées les caractéristiques précises qui font de ces cellules des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des maladies neurologiques.

1. Cellules souches et développement embryonnaire

Elément fondamental du développement et de la « maintenance » de tout tissu, organe et/ou organisme, une cellule souche est définie par sa capacité à se multiplier et à générer, lors de la division cellulaire, une ou deux cellule(s) fille(s) identique(s) maintenue(s) à l’état indifférencié et héritant de toutes les caractéristiques biochimiques, fonctionnelles et morphologiques de la cellule mère (auto-renouvellement). Lors d’une division asymétrique, l’autre cellule fille générée doit être capable de se différencier en plusieurs types cellulaires distincts (multipotentialité), ceci après un nombre fini de cycles cellulaires [1, 2] (Fig. I-1). Tout au long du développement d’un individu, différents types de cellules souches se succèdent, présentant des capacités d’auto- renouvellement et de multipotentialité variables, relatives au stade de développement et au tissu dont elles sont issues.

Figure I-1. Hiérarchie des cellules

souches. Les cellules sont classées en

fonction de leur potentiel de

développement qui se restreint au fur

et à mesure de la progression et de la

spécialisation de la cellule dans la

lignée empruntée. La génération des

cellules matures est assurée par la

différenciation de cellules souches,

toujours capable d’auto-

renouvellement, en progéniteurs

multipotents puis en précurseurs

oligopotents avant de former des

cellules différenciées [3].

9 Dès l’ovocyte fécondé et jusqu’au stade blastula, ce sont les cellules souches embryonnaires ou cellules ES (Embryonic Stem) qui régissent le développement. Les potentiels d’auto-renouvellement et de différenciation des cellules ES sont les plus élevés puisqu’elles sont capables de générer un individu entier. Les cellules ES deviennent somatiques lors de la gastrulation et assurent le développement des différents organes chez le fœtus. Elles persistent généralement chez l’adulte où leur rôle devient homéostasique et régénératif, permettant le remplacement des cellules lésées.

Elles se distinguent des cellules ES par un potentiel de différenciation restreint aux types cellulaires rencontrés dans l’organe dont elles sont issues. Enfin, mentionnons également qu’une population de cellules souches plus particulière apparaît dès la deuxième semaine de vie embryonnaire humaine : les cellules germinales primordiales, qui sont à l’origine des gamètes.

1.1. Le développement embryonnaire

La première cellule souche apparaît lors de la fusion des deux gamètes haploïdes

mâle et femelle formant le zygote. Ce dernier entreprend une série de divisions

segmentaires jusqu’au stade huit cellules, toutes totipotentes, capables de produire les

différents types cellulaires de l’organisme. Bien plus, chacune d’entre elles peut,

isolément, former un nouvel embryon viable. Les divisions se succèdent au sein de la

morula et les cellules vont, dès lors, s’organiser de manière plus précise. Une paroi

épithéliale se forme en périphérie, le trophoblaste, qui s’épaissit au niveau d’un pôle du

blastocyste. C’est à partir de cet épaississement ou masse cellulaire interne que se

développera l’embryon. A ce stade, les cellules de la masse cellulaire interne sont dites

pluripotentes, c'est-à-dire qu’elles peuvent toujours donner naissance aux différents

types cellulaires de l’organisme, mais qu’elles ne peuvent plus, à elles seules, constituer

un nouvel embryon. Ainsi, au fur et à mesure de la croissance de l’embryon, les cellules

perdent en potentialité et gagnent en spécialisation (Fig. I-2).

10

Figure I-2. Evolution du potentiel de différenciation des cellules souches lors du développement.

Jusqu’au stade morula, chacune des cellules, dites totipotentes, est capable à elle seule de générer un

nouvel individu. Les cellules pluripotentes, isolées à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste,

peuvent donner naissance à tout type cellulaire de l’organisme. Après la gastrulation, les cellules,

devenues multipotentes, sont restreintes à des lignées cellulaires de plus en plus précises, en fonction de

leur localisation tissulaire. Ainsi, chez l’adulte, on retrouve des cellules souches multipotentes, dont les

capacités de différenciation sont relatives aux tissus qui les hébergent. Le temps de développement

embryonnaire indiqué correspond à celui observé dans l’espèce humaine. GD, Gyrus denté ; ZSV, zone

sous-ventriculaire.

11 Au début de la deuxième semaine de gestation (chez l’homme), la masse cellulaire interne se divise en deux couches cellulaires : l’épiblaste et l’hypoblaste.

L’épiblaste se creuse pour former la cavité amniotique, alors que l’hypoblaste prolifère et tapisse progressivement le trophoblaste pour former le sac vitellin. Au cours de la troisième semaine, la gastrulation démarre avec l’apparition d’une ligne primitive sur la partie caudale de l’épiblaste et d’un nœud primitif (ou organisateur chez le xénope) à l’extrémité rostrale de cette ligne primitive. Dès lors, une maturation cellulaire se produit et trois feuillets embryonnaires se forment : l’hypoblaste devient l’endoderme, futur tractus gastro-intestinal ; des cellules de la ligne primitive migrent bilatéralement entre l’endoderme et l’épiblaste pour former le mésoderme intraembryonnaire, futures somites, mésenchyme et notochorde ; enfin, l’épiblaste devient l’ectoderme, futur système nerveux, épiderme et organes associés. Les cellules souches qui constituent ces trois feuillets sont dès lors dites somatiques. En outre, elles sont multipotentes. Toujours caractérisées par une capacité d’auto-renouvellement, elles se différencient en plusieurs types cellulaires, mais sont déjà engagées dans un programme tissulaire spécifique (Fig. I-3).

1.2. Formation de la crête neurale (CN)

Les études expérimentales concernant le développement de la crête neurale ont majoritairement été réalisées sur le xénope, le poulet, le poisson-zèbre et la souris.

Malgré de petites différences dans le processus, celui-ci est relativement similaire d’une espèce à l’autre.

Au cours de la quatrième semaine de gestation (chez l’homme), les feuillets se

différencient pour constituer l’ébauche de la plupart des organes. C’est à partir de

l’ectoderme que se forme la plaque neurale. Lors du processus de neurulation, la plaque

neurale s’invagine pour former le tube neural, futur système nerveux central (SNC).

12

13 Suite à la stimulation par des facteurs sécrétés par le nœud primitif, l’ectoderme se divise d’abord en région neurale et non-neurale. La plaque neurale s’invagine ventralement le long de son axe médian. Les plis neuraux, concaves, se rejoignent ensuite dorsalement et fusionnent au niveau du diencéphale, pour former le tube neural qui s’isole de l’ectoderme et s’enfonce dans la paroi dorsale de l’embryon. La fusion du tube neural progresse dans les deux directions (céphalique ou rostrale et caudale) et se termine par la fusion des neuropores antérieur et postérieur. Les cellules de la crête neurale (CCN) émergent à partir des plis neuraux, c’est-à-dire à l’interface entre l’ectoderme, non-neural, et la partie dorsale du tube neural en formation. Elles entament alors un processus de délamination, au cours duquel les cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales pour acquérir un phénotype mésenchymateux. Cette transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) leur confère la capacité de se détacher et de migrer. La délamination des CCN ne se fait pas de manière synchrone le long de l’axe rostro-caudal. Elle débute au niveau de la zone mésencéphalique avant même la fermeture du neuropore crânien et se propage simultanément en une double vague bidirectionnelle, rostralement, vers le prosencéphale, et caudalement (Fig. I-4).

1.3. Développement mésodermique

Concomitamment à l’émergence des CCN, et tout au long de leur migration et de leur différenciation, d’autres structures dérivées du mésenchyme se développent. En plus de donner naissance à de nombreuses structures de l’organisme, certaines structures mésodermiques assurent un support trophique aux CCN.

Figure I-3. Tissus dérivés des trois feuillets embryonnaires primitifs que sont l’ectoderme, le

mésoderme et l’endoderme. Les cellules germinales, formés peu après la gastrulation sont également

indiquées. SNC, Système nerveux central ; SNP, Système nerveux périphérique. Figure adaptée de

l’article « What is a cell », NCIB, 2004, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/genetics_cell.html.

14

Figure I-4. Neurulation chez le poulet. (A) Vue dorsale de la neurulation se déroulant le long de l’axe rostro-caudal. Au niveau de la ligne pointillée (partie la plus rostrale du futur rhombencéphale), la plaque neurale se forme alors que, plus rostralement, la plaque neurale se creuse (flèche) laissant apparaître un sillon et des plis (astérisque). (B, C, E, F) Vue réelle à gauche et vue schématique à droite. (B) Sections transversales de la plaque neurale à hauteur de la ligne pointillée en A. (C) Sections transversales du sillon neural au niveau du diencéphale. (D) Vue dorsale de la fermeture du sillon neural qui commence au niveau du diencéphale et progresse ensuite rostralement et caudalement. La ligne pointillée indique le niveau de la section transversale. (E) Sections transversales du tube neural naissant. (F) Sections transversales du tube neural néoformé. E, endoderme; HM, head mesoderm ou mésoderme céphalique ; M, mésoderme ; N, notochorde; NF, neural fold ou plis neuraux; NG, neural groove ou sillon neural;

NP, neural plate ou plaque neurale; MHP, median hinge point ou point charnière médian; SE, surface

ectoderm ou ectoderme de surface [4, 5].

15 La migration des cellules de la ligne primitive aboutit à la formation d’un tapis de cellules lâches entre l’épiblaste et l’endoderme. Peu après, ces cellules se réorganisent en quatre subdivisions (Fig. I-5) :

- Une population de cellules mésodermiques migrent rostralement à partir du nœud primitif pour former un tube relativement épais appelé processus notochordal, la future notochorde.

- Les cellules du mésoderme para-axial migrent plus rostralement encore, le long

de la notochorde. Elles seront rejointes par les CCN céphaliques pour former le

mésenchyme du segment céphalique. Le mésoderme paraxial contribue, entre

autres, à la formation des muscles striés de la face, de la mâchoire, de la gorge et

des arcs pharyngés. Au niveau de la région thoraco-abdominale, par contre, il

forme des bandes de cellules qui se segmentent en somites, sortes de blocs

mésodermiques condensés. Chez l’homme, c’est 35 à 37 paires de somites qui

bordent ainsi la notochorde (65 chez la souris), de la région occipitale à

l’extrémité caudale de l’embryon. Par la suite, chaque somite se subdivise en

sclérotome et en dermomyotome. Les sclérotomes donnent naissance au

squelette axial, y compris la colonne vertébrale et l’os occipital. Le

dermomyotome, lui, se subdivise à nouveau en dermatome sous l’ectoderme,

pour former le derme, et en myotome sous-jacent pour former la musculature

volontaire de la nuque, des parois de l’organisme et des membres. Ainsi, la

formation et surtout la segmentation des somites constituent deux processus

séquentiels essentiels à l’organisation et à la structuration du futur individu.

16

Figure I-5. Subdivisions du mésoderme chez le poulet. Sections transversales illustrant la segmentation du mésoderme au niveau du tube neural (A) céphalique et (B) thoraco- abdominal : notochorde (vert), mésoderme paraxial (jaune), mésoderme intermédiaire (rouge) et mésoderme latéral, composé du mésoderme somatique (violet) et du mésoderme splanchnique (bleu). (C) Vue dorsale de la région thoraco-abdominale du tube neural où la surface ectodermique a été partiellement enlevée afin de distinguer le tube neural et le mésorderme sous-jacents. Plus caudalement, on peut constater que les somites ne sont pas encore segmentés [5].

- Plus latéralement, le mésoderme intermédiaire (ou nephrotome) est à l’origine du système urinaire et d’une partie du système génital.

- Plus latérale encore et plus tardive, la plaque mésodermique latérale se divise en deux couches : une couche ventrale, le mésoderme splanchnique, qui s’associe à l’endoderme pour former le splanchnopleure ; une couche dorsale, le mésoderme somatique, qui s’associe à l’ectoderme pour former la somatopleure. L’espace entre les deux couches délimite une cavité, le coelome.

Par la suite les coelomes droit et gauche fusionnent alors que des plis du

mésoderme somatique s’étendent, divisant le coelome en plusieurs cavités :

pleurale, péricardique et péritonéale.

17

1.4. Migration et différenciation des CCN

Entretemps, les CCN délaminées entreprennent leur migration. Les voies migratoires empruntées par les CCN sont spécifiques non seulement à chaque région de l’axe rostro-caudal dont elles sont issues, mais également au stade du développement à partir duquel elles entament leur migration. Les CCN sont donc subdivisées en quatre types selon qu’elles dérivent de la région céphalique, vagale ou cervicale, thoraco- abdominale et sacrée.

- Contrairement aux CCN thoraco-abdominales, les CCN céphaliques se

délaminent de manière relativement synchrone. Chez l’oiseau, les cellules issues

du mésencéphale et du diencéphale migrent rostralement dans le processus

fronto-nasal (PFN), et latéralement dans le premier arc pharyngé. Les CCN du

rhombencéphale empruntent également des voies de migration latérales pour

coloniser les autres arcs pharyngés, mais aussi pour former le mésenchyme

cranio-facial. Elles sont, ainsi, à la base de la formation de nombreuses

structures de la tête et du cou au niveau des arcs pharyngés, telles que des

éléments musculaires, cartilagineux et osseux du nez, de la mâchoire, de l’oreille

moyenne et du cou [6-8], ou encore des cellules parafolliculaires de la glande

thyroïde. Elles participent notamment à la formation du derme, des tissus

graisseux et conjonctifs de la face et aux odontoblastes des futures dents. Les

CCN céphaliques sont aussi à l’origine des tissus conjonctifs de l’œil et du nerf

optique, des muscles de l’iris et du corps ciliaire, et de la cornée. Ces cellules

donneront également naissance aux mélanocytes de la face et à une partie des

péricytes et cellules musculaires lisses des vaisseaux sanguins irrigant le

prosencéphale et la face [9]. Enfin, des CCN céphaliques qui empruntent une

voie plus ventrale sont à l’origine des méninges du prosencéphale, mais aussi de

nombreux neurones et cellules gliales des ganglions sensoriels des nerfs crâniens

V, VII, VIII, IX et X (Fig. I-6).

18

Figure I-6. Migration des CCN céphaliques chez le poulet. La vague de migration des CCN est segmentée. Les cellules migrent selon trois courants : trigéminal (du diencéphale et des rhombomères (r) 1 et 2), hyoïde (du r4) et post- otique (des r6 à r8). Les CCN des r3 et r5 migrent rostralement et caudalement pour rejoindre les courants des cellules issues des rhombomères adjacents. AP, arc pharyngé ; CN, crête neurale ; PFN, processus fronto-nasal [10, 11].

- Les CCN vagales ou cervicales contribuent à la mise en place de trois tissus majeurs. Les cellules issues de la crête adjacente aux somites 1 à 3, migrent latéralement le long de l’arc aortique vers le pôle rostral du cœur en développement où elles participent à la formation du septum aortico-pulmonaire.

Elles forment également des cellules musculaires lisses de la crosse aortique et du ganglion cardiaque [12, 13]. D’autres migrent selon une voie ventromédiale pour former les neurones et les cellules gliales du système nerveux entérique qui innervera l’ensemble du tractus digestif, de l’œsophage au rectum. Enfin, des CCN vagales migrent parallèlement à des CCN issues du rhombencéphale caudal, vers le pharynx pour participer à la formation des cellules parafolliculaires de la thyroïde.

- Les CCN thoraco-abdominales quittent le TN en trois vagues qui empruntent

différentes voies (Fig. I-7). Les premières cellules à se détacher du TN suivent

une voie de migration ventrale et traversent la partie antérieure du sclérotome de

19 Figure I-7. Voies de migration des

CCN thoraco-abdominales chez la souris. (A) La première vague de CCN (cellules vertes) se délamine du TN entre E8.5 et E9.0 et migre vers l’aorte dorsale pour former la chaine sympathique. Une faible proportion de CCN migre également entre les moitiés antérieures et postérieures du sclérotome en développement. (B) Les CCN de la vague intermédiaire se délaminent entre E9.0 et E10.5. Les CCN sympatho-adrénergiques traversent le sclérotome et s’accumulent au niveau de l’aorte dorsale. Au contraire, les CCN sensorielles sont maintenues dans le sclérotome antérieur. (C) La dernière vague de CCN se délamine entre E10.5 et E14.5 et migre vers le dermomyotome et le derme. A, antérieur ; AD, aorte dorsale ; DM, dermomyotome ; N, notocorde ; P, postérieur ; S, somite ; TN, tube

neural ; VIS, vaisseaux

intersomitiques [14].

20

chaque somite pour former les ganglions sympathiques au niveau de l’aorte dorsale. La plupart des cellules de la deuxième vague, la vague intermédiaire, migrent ventralement pour donner naissance à des dérivés neurogliaux. Elles formeront le système nerveux périphérique (SNP) de la nuque, du tronc et des membres, composé des neurones périphériques et de la glie associée. Ainsi les neurones sensitifs (dont les corps cellulaires résident dans les ganglions dorsaux spinaux), les motoneurones sympathiques et parasympathiques du système nerveux autonome (dont les corps cellulaires résident respectivement dans les ganglions sympathiques et parasympathiques) et les neurones entériques dérivent des CCN thoraco-abdominales. Toutefois, certaines cellules de la vague intermédiaire rejoignent celles de la première vague pour former le tronc sympathique le long de l’aorte dorsale ou pour donner naissance aux cellules chromaffines de la glande médullo-surrénale. Enfin, les cellules de la dernière vague de migration empruntent une voie dorsolatérale, entre le dermomyotome et l’épiderme, pour former les mélanocytes du tronc et des membres [14].

- Les CCN sacrées prennent également part à l’élaboration du système nerveux entérique dans la partie la plus caudale de l’intestin. Ces cellules se différencient aussi en mélanocytes.

1.5. Bases moléculaires du développement

Les principaux aspects de l’ontogenèse des CCN et de leur « support

mésodermique » décrits précédemment se déroulent sous le contrôle de facteurs

trophiques et de morphogènes. Si l’importance de ceux-ci a généralement été démontrée

en constatant les conséquences de leur inhibition, le rôle exact de bon nombre d’entre

eux reste encore mal connu.

21 1.5.1. Facteurs impliqués dans la formation des CCN

Le processus de neurulation démarre avec une ségrégation de l’ectoderme en domaine neural (neuroectoderme), bords de la plaque neurale (plis neuraux - futures CCN) et domaine non-neural (épiderme) s’opère suite à la formation d’un gradient de concentration en Bone Morphogenic Protein (BMPs), elles-mêmes produites par l’ectoderme [15, 16]. Une forte concentration en BMPs entraîne une spécification épidermique ; un niveau intermédiaire permet la spécialisation de l’ectoderme en future CCN ; enfin, le destin neuroectodermique serait un destin « par défaut » du fait d’une quasi absence d’instruction de cellules ectodermiques par les BMPs. Chez le xénope, la mise en place du gradient est assurée par des « facteurs dorsalisants », telles que la Chordine, Noggin, Nodal, Cerberus, la Follistatine ou la Frizzled-related protein (FzdB), sécrétés par l’organisateur. Ces facteurs sont capables de se lier aux BMPs et d’inhiber l’interaction avec leurs récepteurs [17]. Chez le poulet et la souris, l’origine du gradient de concentration en BMPs n’a pas clairement été identifiée et, par ailleurs, il semblerait qu’il ne soit pas indispensable à l’induction de la crête neurale (CN) [18].

Par la suite, la sécrétion de la protéine Sonic hedgehog (Shh) par la notochorde

permet la « ventralisation » du tube neural [19]. L’induction des CCN à proprement

parler se fait dans un second temps, au niveau des bords de la plaque neurale. D’une

part, un niveau élevé de signaux BMPs est maintenu dorsalement et des signaux de la

voie Wingless/INT-related MMTV integration site (Wnt), Wnt1 et Wnt6, exprimés par

l’ectoderme, agissent sur les CCN [20, 21]. D’autre part, le mésoderme paraxial sécrète

du Fibroblast Growth Factors (FGF) de manière plus importante au niveau caudal alors

qu’au niveau rostral, il sécrète principalement de l’acide rétinoïque. Ce double gradient

inversé le long de l’axe rostro-caudal induit la spécification des CCN prioritairement

dans la région rostrale, ce qui contribue à la coordination du développement des SNC et

SNP [22-24]. Suite à la stimulation par ces facteurs, on commence à détecter

l’expression de marqueurs spécifiques par les CCN, tels que les facteurs de transcription

Slug, Snail, activating enhancer-binding protein 2 (AP-2), forkhead box D3 (FoxD3),

22

paired box gene 3 (Pax3), twist, SRY-box containing gene 9 (Sox9) ou encore zinc finger protein 5 (Zic5) [25].

1.5.2. Facteurs impliqués dans le développement somitique

La formation des somites à partir du mésoderme paraxial se déroule selon un rythme séquentiel et cyclique le long de l’axe rostro-caudal. Les membres de la famille Notch sont exprimés progressivement le long de cet axe dans le mésoderme présomitique, et synchronisent la formation de chaque paire de somites [26]. Les voies Wnt, FGF et de l’acide rétinoïque sont également impliquées dans ce phénomène. La distribution de ces facteurs suit un gradient de concentration, l’activité de Wnt3a et de FGF8 étant élevée dans la région caudale et non segmentée du mésoderme paraxial alors que celle de l’acide rétinoïque domine au niveau des somites de la région céphalique [27].

Dans la partie ventro-médiale des somites, des cellules subissent également une TEM, ce qui leur permet de se détacher et de former le sclérotome mésenchymateux.

L’expression de Shh et de Noggin par la notochorde est nécessaire à l’induction et la

maintenance du sclérotome [28]. Parallèlement, la partie dorsale du TN et l’ectoderme

de surface sécrètent plusieurs facteurs de la famille Wnt (Wnt1-3a et Wnt4-6,

respectivement) requis pour l’induction du dermomyotome et l’adoption d’un destin

myogénique par les cellules. Enfin, une sécrétion de BMP4 est assurée par la plaque

mésodermique latérale alors que la partie dorsale du TN sécrète la Noggin, un inhibiteur

de BMP4. L’inhibition de la signalisation BMP par Noggin aboutit à la mise en place

d’un gradient de concentration nécessaire à la spécification des cellules du

dermomyotome en cellules du derme [29, 30].

23 1.5.3. Facteurs impliqués dans la migration des CCN

Pendant ce temps, les CCN pré-migrantes subissent une TEM, ceci afin de pouvoir se détacher de l’ectoderme et migrer. A nouveau, l’activité de BMP4 est impliquée dans ce processus. Les interactions BMP4/Noggin dans la partie dorsale du tube neural génèrent une activité variable de BMP4 le long de l’axe rostro-caudal, l’expression de Noggin par les somites étant décroissante le long de cet axe [29, 31].

Indirectement, les somites en développement contrôlent la chronologie de la délamination des CCN en modulant l’expression de Noggin. Lorsque BMP4 est pleinement actif, les cellules peuvent se détacher. Ce processus explique ainsi la migration graduelle et non synchrone des CCN le long de l’axe rostro-caudal [32].

La TEM constitue surtout une modification phénotypique majeure des cellules passant de l’état épithélial à l’état mésenchymateux. BMP4 module alors l’expression de divers facteurs de transcription qui, à leur tour, influencent le cycle cellulaire et la morphologie des cellules. Ainsi, chez le poulet, les CCN thoraco-abdominales se délaminent uniquement lorsqu’elles sont en phase S du cycle cellulaire et qu’une migration nucléaire interkinétique a eu lieu [33] (Fig. I-8). Qui plus est, les divisions cellulaires s’effectuent parallèlement à la surface, dans la partie dorsale du TN, alors qu’elles sont perpendiculaires à la surface dans les autres régions du TN [34]. En fait, BMP4 stimule l’expression de Wnt1, qui par la voie canonique, induit la transcription de la cycline D1, nécessaire à la transition G1/S du cycle cellulaire [35].

Figure I-8. Délamination des CCN en fonction de la phase du cycle cellulaire et de la

migration nucléaire interkinétique. Durant la TEM,

le noyau et le corps cellulaire sont délocalisés vers le pôle basal de l’épithélium lorsque la cellule entre en phase S du cycle.

Les cellules se détachent ensuite

du tube neural et entame leur

migration [33].

24

Un autre élément phare de la TEM réside dans la modification de l’expression d’une catégorie de glycoprotéines que sont les cadhérines. Rappelons que celles-ci assurent l’adhésion cellulaire par la formation de jonctions adhérentes et de desmosomes au sein du neuroépithélium. La TEM implique donc soit la rupture de ces jonctions, soit la modification de leur expression (Fig. I-9). Les CCN commencent à exprimer les cadhérines 7 et 11 alors que l’expression de la cadhérine-6B est inhibée par le facteur de transcription Snail-2 [36-38]. BMP4 permet également le clivage de la N- cadhérine et la formation d’un fragment soluble qui, une fois transloqué dans le noyau, stimule la transcription de la cycline D1 et donc la transition G1/S du cycle cellulaire [39]. Il a également été démontré que les facteurs de transcription Slug et Snail réprimaient l’expression de la E-cadhérine, étape nécessaire à la TEM [40].

Figure I-9. Mécanismes nécessaires à la transition d’une cellule épithéliale (à gauche) vers une cellule mésenchymateuse (à droite). Le processus implique la perte des caractères épithéliaux, tels que la dissolution des jonctions serrées, des jonctions adhérentes et des desmosomes, et la perte de la polarité apico-basale, pour adopter un phénotype mésenchymateux, qui inclut notamment une réorganisation de l’actine. A, actine ; JA, jonction adhérente ; CK, cytokératine ; D, desmosome ; MEC, matrice extracellulaire ; G, appareil de Golgi ; I, intégrine ; MT, microtubule ; N, noyau ; V, vinculine. Figure adaptée de Erreur ! Référence de lien hypertexte non valide.

Une fois la capacité de migration acquise, les CCN émergent de la partie dorsale

du tube neural et migrent au travers de l’embryon en suivant des voies relativement

stéréotypées qui, toutefois, leurs confèrent un microenvironnement temporellement et

localement variable. Le choix d’une voie de migration est dépendant d’une combinaison

de stimulations par différents facteurs diffusibles et d’interactions des CCN avec la

25 matrice extracellulaire (MEC). Par exemple, on observe de nombreux changements de l’expression et de l’organisation des protéines et protéoglycans de la MEC au cours du cheminement conduisant les CCN vers leur localisation tissulaire. Ces facteurs peuvent être plus ou moins permissifs à l’adhérence et à la migration des CCN. La fibronectine, les laminines, les protéoglycans-M/versicans, les collagènes I, III, IV et VI et la thrombospondine-1engagent et orientent les CCN dans le processus migratoire. Par contre, les tenascines, le perlecan, les fibulines, les collagènes II, V, VIII, IX, XI, XII, XIV et XVII, l’ostéopontine et les hyaluronans semblent induire une faible adhésion mais ne pas réellement affecter le comportement migratoire des CCN. Enfin, l’aggrecan semble capable d’inhiber la migration des CCN, tout du moins in vitro [41]. Des variations dans le type et dans le niveau d’expression des composants de la MEC peuvent donc influencer le choix des voies de migration [42]. Et pour répondre à la variabilité des différents stimuli environnementaux, les CCN s’adaptent par l’expression de certaines protéines de matrices, telles que la fibronectine et la ténascine-C, mais également par l’expression de leurs récepteurs, les intégrines [43, 44]. Des régulations post-transcriptionnelles différentielles des intégrines ont été constatées entre les CCN céphaliques et thoraco-abdominales, ce qui leur confère des propriétés motiles variables, pouvant potentiellement orienter leur choix de voies de migration [45].

Pour ce qui est des CCN céphaliques, les signaux de « guidance » orientent les

courants migratoires des CCN de manière plus complexe encore, notamment en faisant

intervenir les gènes de la famille homeobox (Hox), qui contribuent à l’établissement de

l’axe rostro-caudal [46]. Leur expression est exclue du domaine antérieur de la crête

céphalique qui donnera naissance au squelette facial alors que les cellules du domaine

postérieur au rhombomère 3 (r3) expriment ces gènes Hox, ce qui permettra la

formation de la partie postérieure de l’os hyoïde [47] (Fig. I-10B). Les gènes de la

famille distal-less homeobox (Dlx) confèrent aux CCN leur polarité au sein des arcs

branchiaux, le long de l’axe dorso-ventral [46]. Le FGF8 participe également à la mise

en place des polarités rostro-caudale et dorso-ventrale en plus d’assurer la symétrie

gauche-droite du squelette crânio-facial [48]. Quant au facteur Shh, il contribue à la

26

formation de la polarité squelettique selon l’axe medio-latéral [49]. Des signaux répulsifs assurent également la migration correcte des CCN : le récepteur aux neurégulines, l’Erythroblastic leukemia viral oncogène homologue 4 (ErbB4), est exprimé par les r3 et r5 et maintient la zone adjacente au r3 « libre » de CCN [50] ; les interactions entre les Ephrins et leurs récepteurs Eph ou encore entre les Sémaphorines de classe 3 (Sema3) et leur récepteurs neuropiline (Nrp) contribuent à la ségrégation des arcs pharyngés [51-53] (Fig. I-10A). Enfin, l’endothéline-1 (ET-1) sécrétée par l’ectoderme de surface ainsi que par le mésoderme et l’endoderme des arcs pharyngés participe à la formation des processus mandibulaire et maxillaire via l’activation des gènes Dlx [54, 55].

Figure I-10. Migration segmentaire des CCN céphaliques chez le poulet. (A) Les flèches jaunes représentent les voies de migration des CCN diencéphaliques (di-), mésencéphaliques (mes-) antérieures et postérieures, et rhombencéphaliques vers le processus fronto-nasal (PFN) et les arcs pharyngés (AP) 1 à 4. Certains facteurs impliqués dans la mise en place et la maintenance des voies de migration segmentées sont mentionnés, tels que : ErbB4, Sema 3, Neuropiline (Nrp), Ephrin et leur récepteurs Eph [46]. (B) La partie antérieure de la CN céphalique (Hox-négative) est à l’origine du squelette facial alors que la CN Hox-positive donne naissance à la partie postérieure de l’os hyoïde [10].

De nombreux facteurs trophiques sont également impliqués dans la

différenciation des cellules mésodermiques et la formation des différents tissus qui en

dérivent. Leur description complète sortant de l’objectif de ce présent mémoire, ils ne

seront pas discutés dans cet exposé.

27 1.5.4. Multipotence des CCN

La différenciation des CCN est intimement liée à leur migration dans la mesure où les deux processus sont relativement concomitants. Il est d’ailleurs difficile de considérer les rôles des différents facteurs impliqués dans ces processus comme strictement « migratoires » ou de « différenciation ». Dès lors, se pose la question de l’origine de la diversification des CCN. Existe-t-il un ou plusieurs progéniteurs communs ? Les CCN sont-elles « programmées » vers leur destin cellulaire lors de leur apparition ou celui-ci est-il acquis au cours de leur migration ?

Une hypothèse longtemps privilégiée est celle de l’existence de cellules souches de la crête neurale (CSCN) au niveau du neuroépithélium présentant des capacités de différenciation progressivement restreintes au cours de la migration. Selon cette hypothèse en effet, les signaux perçus par les cellules durant leur migration détermineraient leur devenir (Fig. I-11A). Cette hypothèse est étayée tant par des études in vitro, démontrant la diversité des lignages cellulaires obtenus par cultures clonales de CCN, que par des études in vivo faisant appel au marquage ciblé d’un seul progéniteur [56, 57]. Une autre hypothèse en vigueur suppose que le destin des CCN est prédéterminé avant même le début de la migration (Fig. I-11B). Comme expliqué précédemment (cf. Part. I.1.1.4.), à ce stade, l’environnement des CCN le long de l’axe rostro-caudal impose déjà une ségrégation de ces dernières, entrainant une migration asynchrone des CCN. On peut d’ailleurs constater les différences de potentialité des CCN émergeant précocement du TN par rapport à celles qui s’en séparent plus tardivement [58, 59]. Cela entraîne immanquablement l’emprunt de voies de migration distinctes et donc le cheminement des CCN au travers d’environnements différents [60].

On peut supposer que si des progéniteurs communs existent avant la migration,

alors ceux-ci sont regroupés sur un même niveau axial. Toutefois, des observations font

état de l’existence de deux cellules issues d’un même niveau axial, empruntant la même

voie de migration (ou cultivées dans les même conditions), mais qui aboutissent

néanmoins à la formation de deux cellules différenciées distinctes [61]. Dans ces

28

conditions, les paramètres spatio-temporels relatifs à la maturation de chaque cellule seraient donc cruciaux pour leur devenir. D’autre part, on ne peut nier le rôle de certains facteurs de croissance et acteurs de voies de signalisation bien spécifiques qui ont été identifiés comme impliqués dans l’adoption d’un destin cellulaire particulier par les CCN.

Figure I-11. Deux hypothèses se confrontent pour expliquer l’origine de la diversité des cellules différenciées à partir des CSCN. (A) « La restriction progressive de destin » est un modèle qui prédit une succession hiérarchique du potentiel de différenciation des CCN de pluripotent (1) à multipotent (2), bipotent (3) et enfin unipotent (4). Les précurseurs sont toujours capables d’auto-renouvellement.

Cependant, c’est la présence des facteurs environnementaux qui assure la différenciation des CCN. (B) « La préspécification » est un modèle selon lequel les précurseurs de CCN présentent un destin déjà scellé avant la délamination, ce qui expliquerait les différents types cellulaires obtenus selon les vagues de migration des CCN. C, cellule chromaffine ; F, myofibroblaste ; jpc, jour post conception ; G, glie ; M, mélanocyte ; N, neurone [14].

- Les neurones autonomes

Les neurones autonomes sont composés des neurones sympathiques, engendrés

au niveau du tronc, mais également des neurones parasympathiques et

entériques, issus généralement de la région vagale ou cervicale.

29 Ici encore, les BMP semblent jouer un rôle prépondérant en favorisant, l’acquisition du caractère autonome au détriment du caractère sensoriel [62].

L’expression de BMP4 et BMP7 par l’aorte dorsale guide la migration des CCN et favorise leur diférenciation en neurones sympathiques tant in vitro qu’in vivo [63, 64]. De plus, l’activation des gènes codants pour les facteurs de transcription achaete-scute complex homolog 1 (Mash1) et paired-like homeobox (Phox2a et Phox2b) induit généralement un destin neuronal, tant vers les lignées sympathique que parasympathique ou entérique. Cette activation requiert le plus souvent la présence de BMP [65, 66]. La survie et la différenciation des neurones des ganglions sympathiques dépendent également de neurotrophines (NT) et de facteurs tel que l’insulin-like growth factor (IGF) [67].

Dans le cas de la gangliogénèse entérique, des facteurs supplémentaires sont nécessaires pour assurer la colonisation correcte et la différenciation complète des CCN : par exemple, l’expression du glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) par le mésenchyme intestinal et celle de son récepteur tyrosine kinase Ret par les CCN [68]. Ou encore, l’ET-3 (également produite par le mésenchyme intestinal) qui, par l’activation de son récepteur Endothelin receptor type B (Etrb), inhibe l’adoption du destin neuronal par les CCN. Dans ce cas, c’est le mésenchyme intestinal qui contrôle le destin des CCN [69].

- Les neurones sensoriels

L’origine de la ségrégation des neurones sensoriels et des neurones autonomes

reste assez controversée. En effet, il a aussi bien été démontré l’existence d’un

progéniteur commun pour des neurones des ganglions rachidiens et

sympathiques que l’existence de deux progéniteurs distincts à l’origine des deux

types de neurones [56, 70]. Notons cependant qu’il semble que les neurones

sensoriels se différencient plus rapidement notamment suite à l’expression des

facteurs de transcription de type basic Helix-Loop-Helix (bHLH) comme les

30

neurogénines (Ngn) 1 et 2 [71, 72]. Les Ngn répriment l’acquisition des caractères autonomes, tout comme Mash1 réprime celle des caractères sensoriels. Par ailleurs, Wnt1 et l’activation de la β-caténine orientent la différenciation des CCN vers la formation de neurones sensoriels aux dépens de la formation d’autres types cellulaires, tant in vivo qu’in vitro [73, 74]. La survie et la différenciation des neurones périphériques requièrent également la présence de NT sécrétées par le TN et le dermomyotome. Au niveau des ganglions de la racine dorsale (GRD), le Nerve Growth Factor (NGF) permet la spécification des nocicepteurs par l’activation du récepteur de haute affinité, le Tropomyosin receptor kinase A (TrkA). Le rôle du Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), bien que certain, est moins bien compris. Via les récepteurs TrkB, il pourrait cependant favoriser la spécification de certains mécanorécepteurs.

Enfin, la NT-3, par l’activation des récepteurs TrkC, est nécessaire à la génération de neurones impliqués dans la proprioception [67].

- Les cellules gliales

La restriction des CCN vers une lignée gliale au cours du développement semble survenir plus tardivement que pour les neurones. Il a été démontré le rôle de la voie Notch/Delta dans la ségrégation de ces deux types cellulaires. L’extinction de l’expression de Notch1 est requise pour la différenciation des CCN en neurones. L’expression concomitante du ligand Delta par ces dernières assure alors l’activation de Notch1 dans les cellules voisines, favorisant leur différenciation gliale [75, 76].

Cependant, la différenciation des CCN en cellules gliales (et plus

particulièrement en cellules de Schwann) nécessite un contact étroit avec les

axones, les neurégulines (Nrg) produites par ces derniers activant les récepteurs

ErbB exprimés par les CCN [77]. L’expression du récepteur ErbB3, par

exemple, est sous le contrôle du facteur de transcription Sox10, reconnu pour

son implication dans l’adoption d’un destin glial par les CCN [78, 79]. In vitro,

31 il a, par ailleurs, été montré que Nrg1 soluble stimule la formation de cellules gliales satellites alors que le Nrg1-transmembranaire, via le récepteur ErbB3, induit une différenciation en cellules de Schwann [80, 81].

- Les mélanocytes

Les précurseurs mélanocytaires émergent très rapidement après la délamination des CCN pour suivre une voie de migration dorso-ventrale et ce, sous l’action de la voie Wnt (Fig. I-12). Les facteurs Wnt induisent non seulement la spécification de la lignée mélanocytaire, mais assurent également leur expansion, notamment via l’activation du facteur de transcription Mitf [82-85].

Au niveau de la peau, les facteurs de croissance tels que l’ET-3 et le Stem Cell Factor (SCF) permettent respectivement l’activation des récepteurs tyrosine kinase Etrb2 et proto-oncogene tyrosine-protein kinase (Kit). Ils assurent ainsi la survie, la migration et la différenciation des mélanoblastes [86-88]. D’autres facteurs de transcription semblent impliqués dans le contrôle de la formation des mélanocytes, tels que Sox10 et Pax3 via l’activation de Mitf [89, 90], alors que FoxD3, par son inhibition, restreint la différenciation des CCN aux voies neurales [91].

Figure I-12. Section schématique

transversale du TN montrant la

migration caractéristique des

mélanoblastes par rapport aux

ganglions sensoriels et

sympathiques. L’expression du SCF

par le dermomyotome et le derme

attire les précurseurs mélanocytaires

KIT-positifs. AD, aorte dorsale ; DM,

dermomyotome ; N, notochorde, TN,

tube neural [14]

32

- Les dérivés mésenchymateux

Contrairement aux CCN thoraco-abdominales, les CCN céphaliques ont la capacité de générer des dérivés mésenchymateux tels que du tissu osseux, cartilagineux, adipeux, conjonctif et musclaire lisse au niveau de la face et de la nuque. Hormis le rôle des FGF dans l’adoption par les CCN d’un destin mésenchymateux et le rôle de Shh dans le développement cartilagineux, les facteurs réellement impliqués dans la ségrégation des CCN céphaliques restent méconnus [49, 92].

Il est surprenant de constater que si la multipotence des CCN se restreint bel et bien au cours de la migration, elles n’en gardent pas moins une certaine plasticité. En effet, il a été récemment démontré la persistance de cellules souches dérivées de la CN dans des tissus embryonnaires de stades tardifs du développement, mais également de stades postnatal et adulte (cf. Part. I.2.2.).

2. Cellules souches fœtales et adultes

Comme décrit précédemment, deux des principaux tissus embryonnaires que sont le mésoderme et la crête neurale génèrent de nombreux tissus dans l’organisme au cours du développement. Il est néanmoins possible de retrouver des cellules souches dérivées de ces deux tissus embryonnaire chez l’adulte : les cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les cellules souches dérivées de la crête neurale (CSCN).

De par leur potentiel de différenciation relativement étendu et la facilité d’accès de

certaines niches où sont logées ces cellules, elles suscitent, l’une comme l’autre,

beaucoup d’espoir quant à leur utilisation comme outil thérapeutique dans les approches

de thérapie cellulaire.

33

2.1. Persistance de CSM au stade périnatal et chez l’adulte

Les CSM ont été initialement définies selon deux caractéristiques établies in vitro : la capacité de maintenir un potentiel prolifératif et de donner naissance aux différents dérivés mésenchymateux tels que des adipocytes, des ostéocytes et des chondrocytes [93, 94]. Par la suite, il a été démontré la capacité des CSM (qu’elles soient isolées de tissus animaux ou humains, fœtaux ou adultes) à se différencier en bien d’autres types cellulaires (Tableau I-1).

Les CSM sont également dotées des propriétés immunosuppressives et anti- inflammatoires, d’où le vif intérêt qu’elles suscitent dans le cadre de leur utilisation potentielle en thérapie cellulaire [95]. Toutefois, il persiste à l’heure actuelle un problème majeur, à savoir la difficulté de déterminer des marqueurs cellulaires spécifiques des CSM. Outre leur intérêt dans la caractérisation des CSM, ces marqueurs seraient potentiellement utiles pour permettre une sélection de ces cellules. De nombreux marqueurs ont été identifiés comme spécifiques des CSM, tels que CD73, CD90, CD105, CD44, CD166, CD29, les Stage-Specific Embryonic Antigen (SSEA) 1 et 4, Stro-1 ou Low-affinity Nerve Growth Factor Receptor (LNGFR - p75 ^NTR ) [96, 97].

Cependant, tout comme les CSM ne présentent pas le même potentiel de

différenciation selon les tissus dont elles sont issues (Tableau I-1), l’expression (ou la

non expression) de certains marqueurs ne s’avère pas identique d’une source tissulaire à

l’autre. Qui plus est, les conditions de culture peuvent être à l’origine de l’expression

(ou de la disparition de l’expression) de certains marqueurs. Par exemple, les CSM

dérivées de tissus adipeux expriment à l’origine CD34, expression qui disparait une fois

l’expansion des cellules réalisées in vitro [98]. Bon nombre de ces marqueurs ne s’avère

donc pas vraiment spécifique. Le problème majeur inhérent à l’étude des CSM est, en

fait, le manque de consensus dans les procédures d’extraction et de culture des cellules

qui rend toute analyse critique et toute comparaison des nombreuses études réalisées