L’ensemble de ces résultats suggèrent donc que Wnt1 et BMP2 recrutent, au sein de la population stromale, des cellules au potentiel neurogénique, vraisemblablement dérivées de la CN. Afin de déterminer si les effets de ces facteurs sont exclusivement dirigés sur les CCN, Wnt1 et BMP2 ont été ajoutés au milieu de culture des cellules stromales extraites de souris Wnt1-Cre/R26R-LacZ, les CCN étant toujours tracées par une réaction X-gal. Nous avons constaté que l’évolution croissante du nombre de CCN au cours des passages précédemment décrite (cf. Part. II.3.2.) se retrouve significativement augmentée en présence de ces facteurs. En effet, les proportions
105 moyennes de CCN sont augmentées de 39%, 33% et 20% par rapport à la condition contrôle, aux P2, P3 et P4 respectivement. (p = 0.037 ; n = 4 ; test de Zembe pour échantillons appariés ; Fig. IV-6). Les facteurs favorisent donc bien la croissance des CCN dans une culture de cellules stromales, effet qui s’ajoute néanmoins à celui des passages de cellules, mais qui semble s’estomper après les premiers passages qui suivent la mise en culture.
Figure IV-6. Effet des facteurs Wnt1 et BMP2 sur la proportion de CCN dans la culture stromale. Après aspiration médullaire sur des souris adultes Wnt1-Cre/R26R-LacZ, les cellules sont cultivées dans un milieu contenant les facteurs Wnt1 et BMP2. Les CCN sont mises en évidence à l’aide d’une réaction X-gal et les cellules sont contre-colorées au rouge neutre. On observe une augmentation significative de la proportion de CCN lors de l’addition des facteurs Wnt1 et BMP2 et ce tout au long des passages P2, P3 et P4. Echelle = 30 µm.
5. Conclusions
Le recrutement des cellules les plus immatures et la préservation de cette propriété dans une culture est un objectif important si l’on veut utiliser ces cellules à des fins thérapeutiques étant donné que l’orientation de leur destin reste, à ce stade, encore influençable. Il s’avère que les facteurs Wnt1 et BMP2 présentent la capacité de maintenir les CSCN à l’état indifférencié, du moins chez l’embryon [204]. C’est la raison pour laquelle, dans la troisième partie de notre travail, nous avons évalué les effets de ces facteurs sur les cultures stromales. Les cellules qui ont été cultivées en
106
présence de Wnt1 et BMP2 présentent dès les premiers passages, une proportion de cellules nestine-positives nettement augmentée. Cependant, cette augmentation s’atténue avec le nombre de passages pour ne plus être perceptible au quatrième passage. Par ailleurs, en répétant cette expérience sur des cultures de cellules stromales établies à partir d’animaux doublement transgéniques Wnt1-Cre/R26R-LacZ, nous montrons également que ces facteurs augmentent la proportion des CCN au cours des premiers passages. Enfin, la stimulation de Wnt1 et BMP2 sur des cellules disséminées à dilution clonale génère des clones dérivés de la CN. L’ensemble de ces résultats nous permet de conclure que Wnt1 et BMP2 permettent un recrutement et une amplification des CCN lors des premiers passages de la culture stromale. Il serait intéressant de réaliser des expériences complémentaires afin de déterminer si ces facteurs agissent sur les CCN de manière à stimuler leur prolifération ou leur survie. De même, il serait intéressant de savoir si les effets des facteurs Wnt1 et BMP2 sur les CCN sont directs ou indirects, c’est-à-dire si ces facteurs agissent sur les CCN de la culture ou sur les cellules mésenchymateuses, non dérivées de la CN, de la culture.
D’après les travaux de Sommer et coll., l’effet des facteurs Wnt1 et BMP2 (seuls ou combinés) seraient plus instructifs que sélectifs, du moins sur les CCN embryonnaires. Si Wnt1 promeut la prolifération des cellules, BMP2 les engage vers une différenciation. Cependant, les deux facteurs combinés s’inhibent l’un l’autre, maintenant les cellules dans un état indifférencié, mais également faiblement prolifératif [203]. Au regard des niveaux d’expression des récepteurs aux facteurs Wnt1 et BMP2 (Fzd1/3 et BMPR1a respectivement) évalués par l’analyse transcriptomique des populations clonales, l’expression de Fzd1 dans les CCN serait presque 5 fois supérieure à celle dans les cellules mésenchymateuses. Les CCN, plus sensibles aux signaux Wnt1 que les cellules mésenchymateuses, seraient donc plus proliférantes. Une étude de l’expression protéique des récepteurs à ces facteurs sur les populations cellulaires stromales permettraient éventuellement de conforter cette hypothèse.
D’autre part, un traitement des cellules stromales par ces facteurs dès la mise en culture induit également des effets sur les capacités de différenciation des cellules. En
107 effet, rappelons que les CCN présentes dans le stroma médullaire adulte ne se différencient pas en adipocytes ni en cellules musculaires lisses lorsqu’elles sont sélectionnées par leur capacité à former des sphères (cf. Part. II.4.2.1.) ou lorsqu’elles sont sélectionnées par culture clonale (cf. Part. III.2.2.1.), contrairement aux clones de CN obtenus après stimulation par les facteurs Wnt1 et BMP2 (Tableau IV-1).
Tableau IV-1 : Propriétés des cellules stromales dérivées de la CN sélectionnées par différentes méthodes de culture.
β-III-tubuline Oui Oui Oui
Co-culture avec GC –
Map2 Oui Oui ?
Canaux potassiques Oui Oui ?
Canaux sodiques Oui Non ?
Potentiel d’action Non Non ?
Plus encore, la culture de GC induit la différenciation neuronale d’un nombre de cellules stromales largement supérieur lorsque ces dernières ont été préalablement
108
traitées avec Wnt1 et BMP2. De même, les clones générés sous la stimulation par ces facteurs présentent un potentiel de différentiation neuronal bien plus élevé. Il nous est, cependant, impossible de dire si ces modifications de destins cellulaires, tant mésenchymateux que neuronal, observé lors de la stimulation à l’aide des facteurs Wnt1 et BMP2, résultent d’une instruction cellulaire spécifique ou de la sélection d’une sous-population stromale dérivée de la CN douée de propriétés particulières. Dans ce contexte, il serait intéressant de vérifier si les neurones formés dans ces conditions sont matures (expression de Map2) et fonctionnels (analyse électrophysologique).
Il reste cependant intéressant de constater ici que l’ajout des facteurs Wnt1 et BMP2 dans le milieu de culture permet d’augmenter plus rapidement la quantité de CCN, mais plus largement la quantité de cellules neurogéniques, pourtant très faible au départ, et donc de diminuer le temps de culture nécessaire pour l’obtention d’un nombre suffisant de cellules avec lesquelles travailler.
Partie V :
Discussion
113 Au cours des dernières années, la localisation de cellules souches dérivées de la crête neurale (CSCN) dans de nombreux tissus adultes a alimenté de nouveaux espoirs en matière de thérapie cellulaire pour des pathologies neurologiques. Notre laboratoire, parmi d’autres groupes de recherche, a participé à la mise en évidence de ces CSCN dans la moelle osseuse adulte [134, 205, 206]. Plus encore, nous avons quantifié leur proportion, caractérisé leur potentiel d’auto-renouvellement et surtout leur potentiel de différenciation nerveux, démontrant pour la première fois la capacité des CSCN adultes à former des neurones fonctionnels. Ces résultats ont, dès lors, soulevé de nombreuses questions concernant les travaux antérieurs réalisés sur les cellules stromales de la moelle osseuse et, plus particulièrement, sur le potentiel neurogénique de certaines d’entre elles [185, 207, 208]. Le débat s’est notamment orienté sur la nature réellement mésenchymateuse de ces cellules stromales neurogéniques, laissant supposer que celles-ci seraient en réalité toutes dérivées de la CN [126, 209]. C’est pourquoi, nous avons poursuivi nos travaux par une étude comparative entre les CSCN aux CSM (c'est-à-dire les cellules stromales non dérivées de la CN). Nous avons tout d’abord constaté que la capacité clonogénique des CSM comme des CSCN était sensiblement la même. Nos résultats ont également démontré que les CSCN n’étaient pas les seules cellules neurogéniques de la moelle osseuse. En effet, placées en milieu de différenciation nerveuse, les CSM génèrent des neurones fonctionnels et matures. Dès lors, si la mise au point de notre protocole de différenciation nerveuse permet la formation de neurones fonctionnels par les CCN, on pourra alors se poser la question de savoir si les neurones issus de ces deux populations présenteraient des propriétés identiques. Quelle serait la sensibilité des neurones à l’application de neurotransmetteurs dans les deux cas ? Quels seraient les neurotransmetteurs synthétisés par les neurones issus des deux types cellulaires ? Les réponses à ces questions pourraient être importantes si on considère le type de pathologie neurologique susceptible de faire l’objet d’une thérapie cellulaire.
Malgré une capacité de différenciation qui diffère quelque peu, une analyse transcriptomique nous a démontré que les deux types cellulaires étaient pourtant les plus proches l’un de l’autre. Le stroma médullaire se trouve donc constitué de CSM et de
114
CSCN présentant, certes, quelques caractéristiques distinctes, mais des potentialités similaires. La moelle osseuse n’est pas le seul tissu hébergeant des CSCN et des CSM aux propriétés similaires. Des cellules immatures prélevées au niveau de la peau présentent les mêmes capacités d’auto-renouvellement et de différenciation nerveuse que les CSCN voisines, mais seraient pourtant dérivées du mésoderme [210, 211]. Qu’il s’agisse de la moelle osseuse ou de la peau, il reste, d’une part, à démontrer si ces propriétés sont intrinsèques aux cellules in vivo ou si elles sont acquises par la mise en culture et, d’autre part, à comprendre comment des cellules aux origines embryonnaires différentes peuvent arriver à présenter des propriétés relativement proches. La réponse à cette dernière question se trouve peut être dans les modifications épigéniques subies par les cellules. Comme nous avons pu le voir dans l’introduction du présent mémoire, le développement de la crête neurale et du mésoderme sont étroitement liés, mais les signaux auxquels les cellules issues de ces deux tissus sont exposées sont bien distincts, du moins jusqu’à la délamination des CSCN. Toutefois, par la suite, l’environnement peut être considéré comme semblable pour une faible proportion de cellules : si on considère que les CSM sont dérivées du mésoderme et colonisent la moelle osseuse concomitamment aux CSH, leur migration serait donc également concomitante à celle des CSCN (cf. Part. I.2.3.2.). En d’autres termes, ces cellules, bien qu’ayant une origine embryonnaire différente, subiraient l’influence des mêmes signaux environnementaux depuis le stade E10.5 jusqu’au stade adulte (chez la souris). Cette hypothèse expliquerait les similitudes observées dans les potentialités des deux types cellulaires.
Comme nous l’avons mentionné, l’hypothèse en question présuppose que les CSM dérivent du mésoderme. Si le fait est communément admis dans la littérature, il n’a pour autant jamais été démontré [125]. Au contraire, plusieurs études récentes attestent plutôt d’une toute autre origine embryonnaire. En effet, hormis les CSCN, la moelle osseuse abrite également des cellules dérivées du neuroépithélium, dont l’individualisation serait encore plus précoce [205]. Par ailleurs, les fibroblastes et les myoblastes de nombreux tissus, jusque là considérés comme dérivés des CSM de la moelle osseuse, ont en réalité une origine hématopoïétique [212]. Dès lors, lorsque nous
115 avons comparé les CSCN et les CSM de la moelle osseuse, s’agissait-il de CSM neuroépithéliales, hématopoïétiques, mésodermiques, ou encore issues d’une autre origine embryonnaire ? Ce que l’ensemble de ces travaux confirme, c’est que les cellules stromales de la moelle osseuse constituent une population très hétérogène, dont la qualification « cellules mésenchymateuses » ne semble plus très appropriée étant donné l’origine embryonnaire qu’elle sous-entend. D’autres études devront venir étoffer ces résultats afin de pouvoir redéfinir les différents types de cellules stromales peuplant la moelle osseuse.
Replaçons maintenant l’intérêt de nos recherches dans la perspective de l’utilisation de l’une ou l’autre de ces populations dans des protocoles thérapeutiques pour des maladies neurologiques. La question reste de savoir laquelle constituerait la source cellulaire la plus adéquate. Il avait été démontré au préalable dans notre laboratoire que l’expression de la nestine par les cellules était un prérequis indispensable à l’adoption d’un destin neuronal par les cellules [185]. Or, des deux types cellulaires caractérisés ici seules les CSCN expriment la nestine de manière constitutive, ce caractère n’étant attribuable qu’à une minorité de cellules parmi les CSM. Au regard des résultats obtenus et de l’analyse précédemment faite sur les diverses origines des CSM, il semble que les CSCN constitueraient une source cellulaire plus homogène. D’autres études doivent être poursuivies sur le potentiel de différenciation neuronal des CSCN afin de déterminer si oui ou non ces cellules sont capables de générer des neurones matures et fonctionnels. En ce qui concerne les CSM, cette démonstration n’a été établie que sur des populations clonales. Il conviendra donc de mettre au point une méthode de purification des différents types cellulaires et de confirmer cette potentialité sur des cellules de culture précoce. Cependant, si on laisse de côté les origines embryonnaires des cellules stromales, la source cellulaire thérapeutique idéale est peut être en réalité l’ensemble de la population neurogénique de la moelle osseuse, tant composée des CSM que des CCN, puisqu’il semble que l’une comme l’autre forment des neurones fonctionnels et (pour les CSM) matures.
116
De manière plus générale, un des principaux obstacles à l’utilisation des cellules neurogéniques de la moelle osseuse adulte dans des protocoles thérapeutiques est leur nombre très limité in vivo, du moins chez le rongeur. Ce problème n’est toutefois pas inhérent à la moelle osseuse. Si des cellules souches neurogéniques ont également été identifiées dans d’autres tissus, leur proportion n’est pas élevée non plus, d’autant qu’elle décroit avec l’âge [209]. La culture in vitro reste donc une étape indispensable pour l’expansion des cellules. L’utilisation concomitante des facteurs Wnt1 et BMP2 permettrait, toutefois, de recruter les cellules en un temps de culture minimum et de favoriser leur différenciation neuronale.
Enfin, si nous sortons du cadre précis dans lequel ce travail a été entrepris, nous pensons qu’une des questions principales que pose notre travail est le rôle de ces CCN dans la moelle osseuse adulte. Ces cellules ont-elles un rôle dans la régulation de l’hématopoïèse ? Ont-elles un rôle dans la maintenance des tissus mésodermiques ? Et par ailleurs, ces cellules auraient-elles un rôle dans l’éthiopathogénie de maladies hématopoïétiques ? Nous pensons que s’ouvre ici un nouveau champ de réflexion et d’hypothèses qu’il conviendra d’aborder avec un regard neuf et surtout un décloisonnement des spécialités. En effet, la réponse à ces questions imposera une étroite collaboration de neurobiologistes et d’hématobiologistes.
Partie VI :
Bibliographie
121 1. Morrison, S.J., N.M. Shah, and D.J. Anderson, Regulatory mechanisms in stem
cell biology. Cell, 1997. 88(3): p. 287-98.
2. Hall, P.A. and F.M. Watt, Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity. Development, 1989. 106(4): p. 619-33.
3. Reya, T., et al., Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 2001.
414(6859): p. 105-11.
4. Gammill, L.S. and M. Bronner-Fraser, Neural crest specification: migrating into genomics. Nat Rev Neurosci, 2003. 4(10): p. 795-805.
5. Schoenwolf, G.C. and W.J. Larsen, Larsen's human embryology. 4th ed. 2009, Philadelphia: /Elsevier/Churchill Livingstone. xix, 687 p.
6. Couly, G.F., P.M. Coltey, and N.M. Le Douarin, The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Development, 1993. 117(2):
p. 409-29.
7. Kontges, G. and A. Lumsden, Rhombencephalic neural crest segmentation is preserved throughout craniofacial ontogeny. Development, 1996. 122(10): p.
3229-42.
8. Noden, D.M., The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Dev Biol, 1983. 96(1): p. 144-65.
9. Etchevers, H.C., et al., The cephalic neural crest provides pericytes and smooth muscle cells to all blood vessels of the face and forebrain. Development, 2001.
128(7): p. 1059-68.
10. Le Douarin, N.M., The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mech Dev, 2004. 121(9): p. 1089-102.
11. Theveneau, E. and R. Mayor, Collective cell migration of the cephalic neural crest: the art of integrating information. Genesis, 2011. 49(4): p. 164-76.
12. Kirby, M.L., T.F. Gale, and D.E. Stewart, Neural crest cells contribute to normal aorticopulmonary septation. Science, 1983. 220(4601): p. 1059-61.
13. Kirby, M.L. and D.E. Stewart, Neural crest origin of cardiac ganglion cells in the chick embryo: identification and extirpation. Dev Biol, 1983. 97(2): p. 433-43.
14. Ruhrberg, C. and Q. Schwarz, In the beginning: Generating neural crest cell diversity. Cell Adh Migr, 2010. 4(4): p. 622-30.
15. Marchant, L., et al., The inductive properties of mesoderm suggest that the neural crest cells are specified by a BMP gradient. Dev Biol, 1998. 198(2): p.
319-29.
16. Barth, K.A., et al., Bmp activity establishes a gradient of positional information throughout the entire neural plate. Development, 1999. 126(22): p. 4977-87.
17. Aybar, M.J. and R. Mayor, Early induction of neural crest cells: lessons learned from frog, fish and chick. Curr Opin Genet Dev, 2002. 12(4): p. 452-8.
122
18. Basch, M.L., M.I. Garcia-Castro, and M. Bronner-Fraser, Molecular mechanisms of neural crest induction. Birth Defects Res C Embryo Today, 2004. 72(2): p.
109-23.
19. Marti, E. and P. Bovolenta, Sonic hedgehog in CNS development: one signal, multiple outputs. Trends Neurosci, 2002. 25(2): p. 89-96.
20. Garcia-Castro, M.I., C. Marcelle, and M. Bronner-Fraser, Ectodermal Wnt function as a neural crest inducer. Science, 2002. 297(5582): p. 848-51.
21. Echelard, Y., G. Vassileva, and A.P. McMahon, Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development, 1994.
120(8): p. 2213-24.
22. Villanueva, S., et al., Posteriorization by FGF, Wnt, and retinoic acid is required for neural crest induction. Dev Biol, 2002. 241(2): p. 289-301.
23. Liem, K.F., Jr., et al., Dorsal differentiation of neural plate cells induced by BMP-mediated signals from epidermal ectoderm. Cell, 1995. 82(6): p. 969-79.
24. Martinez-Morales, P.L., et al., FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. J Cell Biol, 2011. 194(3):
p. 489-503.
25. Kalcheim, C. and T. Burstyn-Cohen, Early stages of neural crest ontogeny:
formation and regulation of cell delamination. Int J Dev Biol, 2005. 49(2-3): p.
105-16.
26. Kim, W., et al., The period of the somite segmentation clock is sensitive to Notch activity. Mol Biol Cell, 2011. 22(18): p. 3541-9.
27. Aulehla, A. and O. Pourquie, Signaling gradients during paraxial mesoderm development. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010. 2(2): p. a000869.
28. Dockter, J.L., Sclerotome induction and differentiation. Curr Top Dev Biol, 2000. 48: p. 77-127.
29. Sela-Donenfeld, D. and C. Kalcheim, Localized BMP4-noggin interactions generate the dynamic patterning of noggin expression in somites. Dev Biol, 2002. 246(2): p. 311-28.
30. Yusuf, F. and B. Brand-Saberi, The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl), 2006. 211 Suppl 1: p. 21-30.
31. Sela-Donenfeld, D. and C. Kalcheim, Regulation of the onset of neural crest migration by coordinated activity of BMP4 and Noggin in the dorsal neural tube. Development, 1999. 126(21): p. 4749-62.
32. Sela-Donenfeld, D. and C. Kalcheim, Inhibition of noggin expression in the dorsal neural tube by somitogenesis: a mechanism for coordinating the timing of neural crest emigration. Development, 2000. 127(22): p. 4845-54.
33. Burstyn-Cohen, T. and C. Kalcheim, Association between the cell cycle and neural crest delamination through specific regulation of G1/S transition. Dev Cell, 2002. 3(3): p. 383-95.
34. Schoenwolf, G.C., Cell movements driving neurulation in avian embryos.
Development, 1991. Suppl 2: p. 157-68.
123 35. Burstyn-Cohen, T., et al., Canonical Wnt activity regulates trunk neural crest
delamination linking BMP/noggin signaling with G1/S transition. Development, 2004. 131(21): p. 5327-39.
36. Nakagawa, S. and M. Takeichi, Neural crest emigration from the neural tube depends on regulated cadherin expression. Development, 1998. 125(15): p.
2963-71.
37. Vallin, J., et al., Xenopus cadherin-11 is expressed in different populations of migrating neural crest cells. Mech Dev, 1998. 75(1-2): p. 171-4.
38. Taneyhill, L.A., E.G. Coles, and M. Bronner-Fraser, Snail2 directly represses cadherin6B during epithelial-to-mesenchymal transitions of the neural crest.
Development, 2007. 134(8): p. 1481-90.
39. Shoval, I., A. Ludwig, and C. Kalcheim, Antagonistic roles of full-length N-cadherin and its soluble BMP cleavage product in neural crest delamination.
Development, 2007. 134(3): p. 491-501.
40. Langer, E.M., et al., Ajuba LIM proteins are snail/slug corepressors required for neural crest development in Xenopus. Dev Cell, 2008. 14(3): p. 424-36.
41. Perris, R. and D. Perissinotto, Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mech Dev, 2000. 95(1-2): p. 3-21.
42. Duband, J.L., et al., Neural crest cell locomotion induced by antibodies to beta 1 integrins. A tool for studying the roles of substratum molecular avidity and density in migration. J Cell Sci, 1991. 98 ( Pt 4): p. 517-32.
43. Desban, N. and J.L. Duband, Avian neural crest cell migration on laminin:
interaction of the alpha1beta1 integrin with distinct laminin-1 domains mediates different adhesive responses. J Cell Sci, 1997. 110 ( Pt 21): p. 2729-44.
44. Strachan, L.R. and M.L. Condic, Neural crest motility on fibronectin is regulated by integrin activation. Exp Cell Res, 2008. 314(3): p. 441-52.
45. Strachan, L.R. and M.L. Condic, Neural crest motility and integrin regulation are distinct in cranial and trunk populations. Dev Biol, 2003. 259(2): p. 288-302.
46. Minoux, M. and F.M. Rijli, Molecular mechanisms of cranial neural crest cell
46. Minoux, M. and F.M. Rijli, Molecular mechanisms of cranial neural crest cell