Analyse transcriptomique des CSCN et des CSM

La caractérisation de ces deux types cellulaires a été complétée par une analyse par microarray des transcrits exprimés. Afin d’observer des différences d’expression de gène propres à chaque type cellulaire, les cinq clones dérivés de la CN ont été mélangés pour comparer leur transcriptome à celui du mélange des six clones mésenchymateux.

Avant de réaliser une analyse comparative entre ces deux types de clones, nous avons évalué la faisabilité d’une telle comparaison. En effet, pour cibler les gènes d’intérêts il est nécessaire de s’assurer, dans un premier temps, de la proximité génétique des échantillons à comparer. Dans ce contexte, nous avons comparé les cinq clones dérivés de la CN et les six clones mésenchymateux à un panel d’échantillons sensés être plus ou moins proche de nos clones. Ces autres échantillons ont été sélectionnés à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Les types cellulaires choisis pour réaliser cette analyse sont les cardiomyocytes fœtaux (GSE7196), les adipocytes (graisse brune et blanche - GSE8044), les cellules ES et les neurones dérivés de cellules ES (GSE8024), les Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC) de moelle osseuse (GSE6291), les CSCN céphaliques (GSE11149). Après normalisation des données ainsi constituées

Figure III-5. Caractérisation de la différenciation neuronale des clones dérivés de la CN et des clones mésenchymateux. Les deux types de cellules ont été cultivés en présence de GC-GFP (vert) pendant 5 à 20 jours. (A-B) Dans ces conditions, des cellules de clones dérivés de la CN comme mésenchymateux expriment la β-III-tubuline (Tuj1, rouge) après 5 jours de co-culture. (C-D). Lorsque les clones sont placés en présence GC préalablement fixés à la PFA, l’expression de la β-III-tubuline (Tuj1, rouge) est toujours observée après 5 jours de co-culture. (E-F) Après 12 jours de co-culture avec des GC, les cellules de clones dérivés de la CN comme des clones mésenchymateux expriment Map2 (rouge). (G) Enregistrement en mode voltage-clamp d’une cellule. La cellule est soumise à des potentiels croissants de -50mV à +20mV. On constate l’apparition de courants entrants inhibés par la tétrodotoxine (TTX) et de courants sortants inhibés par le tétraéthylamonium (TEA). (H) Enregistrement en mode current-clamp de la même cellule mésenchymateuse. La cellule est continuellement soumise à un courant hyperpolarisant (-20pA). L’application d’un courant dépolarisant sur la cellule provoque l’apparition d’un train de potentiels d’action. Les noyaux sont contre-colorés au Dapi. Echelle = 30 µm.

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et en y incluant nos échantillons, les distributions des intensités de chaque échantillon ont été comparées. Les médianes et quartiles étant similaires, nous avons pu réaliser une étude non supervisée pour regrouper naturellement ces échantillons sur base de leur expression génique. Un dendrogramme ou regroupement hiérarchique des sous populations clonales est alors généré. Après construction du dendrogramme, on constate que, malgré le nombre de gènes différemment exprimés entre les deux populations, les clones mésenchymateux constituent le type cellulaire le plus proche des clones dérivés de la CN. Viennent ensuite les CSCN céphaliques et les neurones dérivés de cellules ES, puis les MAPC et enfin, les cellules ES. Les deux types de clones ne présentent cependant pas vraiment de similarités avec les cellules cardiaques fœtales ou les adipocytes, tant issus de la graisse blanche que brune (Fig. III-6).

Les clones dérivés de la CN et les clones mésenchymateux étant très proches, une étude comparative de ces deux types cellulaires a été effectuée. Sur 20000 transcrits de gènes différentiellement exprimés, 3169 étaient significativement sur- ou sous-exprimés par l’un ou l’autre groupe de clones. Dans un premier temps, l’expression de 172 gènes relatifs à un destin cellulaire particulier ont été comparés et classés : 35 de type nerveux, 18 de type mésenchymateux, 42 de type hématopoïétique et 13 de type endothélial. Nous avons constaté, ainsi que les cellules des clones dérivés de la CN sur-expriment des gènes caractéristiques d’un phénotype nerveux alors que les cellules des clones mésenchymateux sur-expriment des gènes relatifs aux phénotypes endothélial et

Figure III-6. Regroupement hiérarchique des échantillons basé sur la distance euclidienne et sur une arborescence de type average testée par permutations cycliques. Les données de 29 transcriptomes issus des clones de la CN (CSCN), des clones mésenchymateux (CSM) et des types cellulaires pris pour référence (cœur fœtal, graisse blanche et brune, cellules ES, MAPC, CSCN céphalique et neurones dérivés de cellules ES) ont été analysées pour établir leur regroupement naturel.

Le dendrogramme est construit à l’aide d’une mesure de dissimilarités entre les types cellulaires (distances euclidiennes) et d’une méthode de construction de l’arborescence average. Pour chaque regroupement, la robustesse de l’affiliation est testée par des permutations aléatoires simples de gènes (bp, bootstrap probability – vert) ou de groupe de gènes (au, approximately unbiased – rouge) afin de vérifier si la structure de la classification est conservée. Le procédé étant répété 10000 fois, il indique à quel point les valeurs corrèlent la classification.

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mésenchymateux. Par ailleurs, le potentiel souche des deux types cellulaires est confirmé par l’expression de 64 gènes classiquement exprimés par des cellules immatures (Fig. III-7).

Figure III-7. Comparaison de l’expression de gènes relatifs à un destin cellulaire défini par les cellules des deux groupes de clones.

Les transcrits exprimés par les cellules des clones dérivés de la CN et des clones mésenchymateux ont été analysés par microarray et classés selon leur implication dans l’adoption d’un destin cellulaire particulier tel que : immature (souche), nerveux, hématopoïétique, mésenchymateux et endothélial. En jaune est représentée la proportion de gènes dont l’expression est similaire dans les deux types de cellules ; en rouge, la proportion de gènes surexprimés par les clones dérivés de la CN par rapport aux clones mésenchymateux tandis qu’en bleu, la proportion de gènes surexprimés par les clones mésenchymateux par rapport aux clones dérivés de la CN.

Toujours dans le but de mieux cerner le profil des cellules issues des deux groupes de clones, nous avons mesuré par Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) semi-quantitative l’expression de plusieurs gènes et confirmé certains résultats obtenus au cours de l’analyse transcriptomique par microarray. Ces gènes sont relatifs aux cellules ES (Oct4, Ring-exported protein - Rex1 et Nanog), aux CSN (Nestin, Notch1, Male-specific lethal 1 homolog- Msl1, Pax3, Pax6, Sox1, Sox2 et Hairy and Enhancer of Split - Hes1) ou aux CSCN (chemokine C-X-C motif receptor - Cxcr4, p75^NTR, Sox10, Twist1, Mash1, Inhibitor of DNA binding 2 - Id2, Wnt1, Snail1, FoxD3 et Ngn1). Les gènes Oct4, Rex1, Nanog, Pax3, Pax6, Sox1, Msl1, Twist1 et Wnt1 ne sont exprimés ni par les clones dérivés de la CN ni par les clones mésenchymateux.

85 Les gènes Nestin, Notch1, p75^NTR, Sox10, Mash1, Id2, FoxD3 sont surexprimés dans les clones dérivés de la CN alors que les gènes Cxcr4 et Snail1 sont surexprimés pas les clones mésenchymateux. Quant aux gènes Id2, Hes1 et Sox2, ils sont exprimés de la même manière par les deux types cellulaires (Fig. III-8).

Figure III-8. Comparaison de l’expression de gènes relatifs à des types cellulaires particuliers par les cellules des deux groupes de clones. Les transcrits de gènes connus pour être exprimés par les cellules ES, les CSN ou les CSCN ont été analysés par RT-PCR semi-quantitative.