Multipotentialité des CSCN et des CSM

Le potentiel de différenciation mésenchymateux et nerveux de deux types de clones a ensuite été testé et comparé.

2.2.1. Destins mésenchymateux

Les cellules des deux types de clones ont été cultivées dans les milieux décrits précédemment (cf. Part. II.4.2.), contenant des facteurs spécifiques permettant l’induction de leur différenciation en adipocytes, chondrocytes, ostéocytes, mélanocytes et cellules musculaires lisses. Après 21 jours de culture dans le milieu de différenciation adipocytaire, seuls les clones mésenchymateux développent des vacuoles lipidiques, mises en évidence par une réaction à l’Oil Red O (Fig. III-3A). Cependant, lorsque les clones de la CN sont pré-incubés en milieu supplémenté des facteurs Wnt1 et BMP2

77 Figure III-3. Profils de différenciation des clones dérivés de la CN et des clones mésenchymateux.

Les deux types de clones ont été cultivés dans des milieux stimulant l’adoption de destins cellulaires particuliers : adipocytes, chondrocytes, muscles lisses, mélanocytes et ostéocytes. On constate ainsi que les clones dérivés de la CN se différencient (B) en chondrocytes et (D) en mélanocytes alors que les clones mésenchymateux se différencient (A) en adipocytes, (B) en chondrocytes, (C) en cellules musculaires lisses et (E) en ostéocytes. (F) La culture préalable des clones dérivés de la CN en présence des facteurs Wnt1 et BMP2 permet la différenciation adipocytaire des cellules lorsqu’elles sont cultivée en milieu adipogénique. Les noyaux sont contre-colorés au Dapi. Echelle = 30 µm (A, C, D, F) ; Echelle

= 50 µm (B).

(cf. Part. IV), les cellules acquièrent la capacité de se différencier en adipocytes (Fig.

III-3F). Tant dans le cas des clones dérivés de la CN que dans le cas des clones mésenchymateux, des culots sphériques sont obtenus après 1 mois de culture dans le milieu chondrogénique. Une coloration au bleu de toluidine sur les sections de ces culots révèle la formation de matrice cartilagineuse (Fig. III-3B). Après 6 jours d’incubation dans un milieu contenant du TGF-β1, l’expression de la SMA, marqueur caractéristique de la différenciation en cellules musculaires lisses, n’a été observée que sur des clones mésenchymateux (Fig. III-3C). Quant à l’expression de la Trp2 après une

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incubation de 10 jours en milieu mélanogénique, elle n’est détectable que dans les clones de CN (Fig. III-3D). Enfin, après 21 jours d’incubation dans le milieu ostéogénique, on constate que les clones mésenchymateux sont dotés d’une AAP alors que les clones de la CN en sont dépourvus (Fig. III-3E).

2.2.2. Destin nerveux

La capacité des clones à se différencier en cellules nerveuses a été étudiée en cultivant les cellules dans les mêmes conditions de culture que celles décrites précédemment (Part. I.4.2.), à savoir en présence de sérum, de NT, ou par contact direct avec des GC-GFP. On constate ainsi que les clones de la CN se différencient en cellules gliales (expression de la GFAP) ou neuronale (expression de la β-III-tubuline marquée par l’anticorps Tuj1) quel que soit le milieu de différenciation (Fig. 4A et Fig. III-5A). Par contre, les clones mésenchymateux n’adoptent un destin nerveux que lorsqu’ils sont co-cultivés avec des GC (Fig. III-4B et Fig. III-5B).

Figure III-4. Différenciation nerveuse des clones dérivés de la CN et des clones mésenchymateux.

(A) Les clones dérivés de la CN se différencient en cellules GFAP-positives et en cellules Tuj1-positives lorsqu’elles sont cultivées dans du milieu contenant du sérum ou des NT. (B) Les clones mésenchymateux ne génèrent pas de cellules GFAP-positives ni de cellules Tuj1-positives lorsque du sérum ou des NT sont ajoutées au milieu de culture (expression très faible de GFAP en condition NT).

Les noyaux sont contre-colorés au Dapi. Echelle = 30 µm.

79 D’autre part, les deux types de clones ont également été co-cultivés avec des GC-GFP préalablement fixés à la paraformaldéhyde (PFA). On constate que les deux types cellulaires sont capables d’adopter un destin nerveux (Fig. III-5C et D), ce qui témoigne d’une réelle faculté de différenciation des cellules et non pas d’un mécanisme de fusion cellulaire comme évoqué dans d’autres paradigmes expérimentaux [199].

Toutefois, ici aussi, la co-culture avec les GC s’avère être la seule condition qui permet une différenciation des clones en neurones plus matures. En effet, l’expression de Map2 n’est pas observable lorsque les clones de la CN sont placés en présence de sérum ou de NT, mais bien lorsqu’ils sont co-cultivés avec des GC. Dans cette condition, tant les clones de la CN que les clones mésenchymateux sont capables de générer des cellules Map2-positives après 12 jours (Fig. III-5E et F). La proportion des cellules exprimant Map2 est cependant bien plus faible que celle des cellules Tuj1-positives observée.

Enfin, une analyse électrophysiologique des clones placés en co-culture avec des GC-GFP a été réalisée afin de démontrer si les neurones formés étaient fonctionnels.

Dans ces conditions, 43 cellules dérivées de la CN et 49 cellules mésenchymateuses ont été enregistrées sur un temps de culture allant de 5 à 20 jours. L’enregistrement de type patch-clamp des cellules en configuration whole-cell (cellule entière) n’a révélé aucune différence concernant le potentiel de membrane des cellules, que ce soit en fonction du type de cellules ou du temps de culture. Ainsi, le potentiel de repos moyen pour les cellules dérivées de la CN était de Vrepos= -37mV ± 5mV et de Vrepos= -35 ± 4mV pour les cellules mésenchymateuses. La présence de canaux voltage-dépendant fonctionnels a été mise en évidence par l’application d’un voltage d’intensité croissante à partir de -50mV (mode voltage-clamp). Sur les deux types de cellules, des courants sortants, inhibés par la TEA, ont été observés, ce qui démontre la présence de canaux potassiques voltage-dépendant. Par contre, des canaux sodiques voltage-dépendants, inhibés par la TTX, n’ont pas été détectés sur les enregistrements des cellules dérivées de la CN, mais bien sur des enregistrements de cellules mésenchymateuses (environ 2% ; fig. III-5G). De plus, l’injection de courant positif (mode current-clamp) dans ces cellules induit le déclenchement de potentiels d’action (Fig. III-5H).

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