Etude de la séquence d'insertion IS1294b et de son implication dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries

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Etude de la séquence d’insertion IS1294b et de son

implication dans la dissémination des gènes de résistance

aux antibiotiques chez les entérobactéries

Haytham Yassine

To cite this version:

Haytham Yassine. Etude de la séquence d’insertion IS1294b et de son implication dans la dissémina-tion des gènes de résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries. Immunologie. Université de Bordeaux, 2015. Français. �NNT : 2015BORD0405�. �tel-01430312�

Université de Bordeaux

Ecole doctorale des Sciences de la vie et de la santé

Laboratoire de Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité UMR CNRS 5234

Thèse

Pour l’obtention du grade de

Docteur de l’Université de Bordeaux

Mention : Biologie-Santé

Option : Microbiologie-Immunologie

Présentée et soutenue publiquement par

Haytham Yassine

Le 14 décembre 2015

Etude de la séquence d’insertion IS1294b et de son

implication dans la dissémination des gènes de résistance

aux antibiotiques chez les entérobactéries

Thèse dirigée par Dr.

Corinne Arpin

Jury :

Professeur Bertrand Garbay Président

Professeur Marie-Cécile Ploy Rapporteur

Docteur Bao Ton-Hoang Rapporteur

Docteur Fabien Darfeuille Invité

A mon père,

A ma mère,

Remerciements

Je remercie vivement Corinne Arpin qui m'a accueilli dans son laboratoire et a assuré la direction de ma thèse. Je tiens à lui témoigner toute ma reconnaissance pour sa disponibilité, ses encouragements, sa patience, sa compréhension, et son soutien à tous les instants difficiles de ce travail. Merci Corinne pour la confiance que tu as eue en moi tout au long de ces trois années de thèse mais également durant les stages du Master 1 et Master 2.

Je tiens à remercier tout particulièrement Docteur Dominique Bégu pour la contribution la plus efficace qu'il a apportée dans la production de la majorité des mutants de l'IS1294b. Merci M. Bégu pour tous les services, les discussions scientifiques (ou non) et les conseils techniques.

Je remercie également Jacqueline Plissonneau pour son aide précieuse dans les expériences de purification de la transposase.

Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Bertrand Garbay pour avoir accepté la présidence du jury de ma thèse.

J'exprime toute ma gratitude au Professeur Marie-Cécile Ploy et au Docteur Bao Ton-Hoang pour avoir accepté d'examiner et de juger cette thèse.

Je remercie Docteur Fabien Darfeuille de me faire l'honneur d'accepter d’être membre invité dans le jury.

J'adresse mes remerciements à Michel Ventura, Marie-Line Andreola, Vincent Parissi, Mohamed Benleulmi, Mathieu Metifiot, Cyril Masante et Christina Calmel pour leurs conseils et leurs idées techniques et scientifiques partagés au cours des réunions du Laboratoire. Enfin des remerciements particuliers à mon père, ma mère, mes frères et ma sœur qui m'ont soutenu au cours de mes études à Bordeaux. Merci mon père pour tout ce que tu as fait pour moi depuis toujours.

SOMMAIRE

INDEX DES FIGURES

INDEX DES TABLEAUX

PREMIERE PARTIE : INTRODUCTION GENERALE

DEUXIEME PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I : La résistance aux Bêta-lactamines – Cas des céphalosporinases 5

1) Classification des β-lactamases 5

2) Les céphalosporinases plasmidiques 8

Chapitre II : Mobilité de la résistance aux antibiotiques 10

1) Les plasmides 10

1.1) Réplication des plasmides 10

1.2) Classification des plasmides selon leur incompatibilité 11

1.2.1) Les plasmides IncA/C 13

1.2.2) Les plasmides IncI1 14

1.3) Classification des plasmides selon leur mode de propagation 15

2) Les intégrons 16

3) Les éléments transposables bactériens 18

3.1) Les séquences d'insertion (ISs) 18

3.1.1) Généralités sur les ISs 18

3.1.2) Cas particulier des ISEcp1, ISCRs et des éléments de la famille IS91 23

3.1.2.1) Eléments ISEcp1 23

3.1.2.2) Eléments ISCRs 24

3.1.2.3) Famille des IS91 26

3.2) Les transposons composites 27

3.3) Les transposons non-composites 28

3.4) Les transposons conjugatifs 29

Chapitre III : Familles des transposases et catalyse de la transposition 31

1) Les transposases à motif catalytique DDE 31

1.1) Variété des éléments utilisant une transposase à motif catalytique DDE 31

1.2) Mécanisme de catalyse 32

1.3) Modalités de transposition 35

1.3.1) La transposition conservative ou "couper-coller" 36

1.3.2) La transposition réplicative : Formation de cointégrat 38

1.3.3) La transposition "copier-coller" : Formation d'un intermédiaire circulaire 38

1.4) Stratégie de sélection du site cible 40

1.4.1) Sélection du site d'insertion via une interaction entre la transposase et l'ADN cible 40

1.4.2) Sélection du site cible via une interaction entre la transposase et d'autres protéines 41

1.5) Régulation de la transposition 43

2) Les transposases à motif catalytique DEDD 45

3) Les transposases à sérine 45

3.1) Les transposases à sérine: apparentées aux recombinases à sérine spécifiques de site 45

3.2) La transposition des éléments utilisant des transposases à sérine 47

3.2.1) le transposon conjugatif Tn5397 47

3.2.2) Le transposon mobilisable Tn4451 49

3.2.3) La séquence d'insertion IS607 50

4) Les transposases à tyrosine 52

4.1) Les transposases à tyrosine: lien avec les recombinases à tyrosine spécifiques de site 52

4.2) Transposons conjugatifs utilisant des transposases à tyrosine 53

4.2.1) Cas de Tn916 53

4.2.2) Cas de CTnDOT 55

5) Les transposases HUH 57

5.2) Les protéines Rep et la réplication RC 58

5.2.1) Cas des plasmides 58

5.2.2) Cas des phages simple brin 59

5.3) Les relaxases et le transfert conjugatif faisant appel à la réplication RC 60

5.4) Les transposases Y1 codées par la famille IS200/IS605 61

5.5) Les transposases Y2 codées par la famille des IS91 64

5.5.1) Caractéristiques des éléments de la famille des IS91 64

5.5.2) Les modèles de transposition RC 65

TROISIEME PARTIE : RESULTATS – DISCUSSION

Chapitre IV : Identification de l'IS1294b et étude de son rôle dans la mobilisation du gène blaCMY-2 71

1) Caractérisation de la souche Kp2735 hébergeant le gène blaCMY-2 71

2) Analyse de l'environnement génétique du gène blaCMY-2 72

3) Hypothèse de la formation du plasmide p2735 via le mécanisme "one-ended transposition" médié par IS1294b 73

4) Analyse de la fréquence de transposition de l'IS1294b insérée dans le plasmide pBK2735SE 75

4.1) Mise au point du test de transposition basé sur l’utilisation du marqueur de sélection positif, sacB 75

4.2) Vérification de l'insertion de l'IS1294b dans le gène sacB 76

4.3) Variations des conditions du test de transposition 78

5) Analyse de la mobilisation du gène blaCMY-2 par le mécanisme de "one-ended transposition" 79

Chapitre V : Modifications des extrémités de l'IS1294b : étude de l'effet in vivo 83

1) Effet de modifications dans l'extrémité oriIS 83

1.1) Etude du tétranucléotide adjacent à l'extrémité oriIS 83

1.1.1) Influence des tétranucléotides 5'GTCC, 5'GTTC, et 5'CTTG adjacents à l’oriIS sur l’efficacité de transposition in vivo 84

1.1.2) Mutations ponctuelles des tétranucléotides adjacents à l'extrémité

oriIS 85

1.2) Effet de mutations de l'extrémité oriIS 87

1.2.1) Alignement de séquences des extrémités oriIS des IS1294 et IS91-like 88

1.2.2) Modifications dans la séquence oriIS 89

1.2.2.1) Délétions au niveau des 87 bases situées après le site de coupure 89

1.2.2.2) Mutations ponctuelles dans l’oriIS : Mutations ponctuelles des bases 73 à 75; Mutations ponctuelles des bases 1 à 25; Autre mutation ponctuelle. 89

2) Effet de modifications dans l’extrémité terIS 91

2.1) Modifications du tétranucléotide du terIS 92

2.2) Modifications dans la séquence terIS 92

2.2.1) Mutation de la base au niveau du site de coupure 92

2.2.2) Délétion du tétranucléotide et de la séquence IRCL 92

2.2.3) Autres délétions effectuées au niveau de l'extrémité terIS 93

Chapitre VI : Modifications du test de transposition in vivo (plasmide donneur et ISs modifiées) et étude de l’activité cis et trans de la transposase 95

1) Efficacité de transposition de l’IS1294b selon le plasmide donneur 95

1.1) Plasmide donneur avec une origine pMB1* 95

1.2) Plasmide donneur avec une origine p15A 95

2) Etude de l’activité de la transposase de l’IS1294b en cis ou trans 97

3) Efficacité de la transposition avec des ISs contenant un marqueur de sélection 3.1) Insertion de marqueurs kanR et rifR dans l'oriIS 99

3.2) Insertion de marqueurs kanR et rifR dans le terIS 99

Chapitre VII : Mutations ponctuelles ciblant le gène de la transposase de l'IS1294b 101

1) Alignement des séquences protéiques 101

1.1) Motif catalytique : motifs Y2 et HUH 101

2) Mutations ponctuelles dans la séquence protéique de la TnpA_IS1294b : effet in vivo 102 Chapitre VIII : Purification de la TnpA_IS1294b et analyse de son activité in vitro 105 1) Insertion d’une étiquette Histidine en N-terminale de la transposase 105 2) Surexpression mais insolubilité de la transposase sauvage TnpA_IS1294 105 3) Amélioration de la solubilité avec la thiorédoxine (TRX) 106 4) Purification sur une colonne d'affinité au Cobalt suivie d'un gel-filtration 108 5) Résultat de la spectrométrie de masse 109

QUATRIEME PARTIE : CONCLUSIONS – PERSPECTIVES

1) IS1294b : vecteur puissant pour la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques 110 2) Développement de tests de transposition alternatifs et étude de l’expression de

la transposase 113 3) Rôles des extrémités oriIS et terIS de l'IS1294b ? 116

4) L'activité catalytique de la TnpA_IS1294b est dépendante de trois

motifs majeurs 119 5) Optimisation de la purification de la transposase 121 6) IS1294b : une cible pour combattre la dissémination de la résistance aux

antibiotiques ? 121

MATERIELS ET METHODES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

INDEX DES FIGURES

Figure 3 Distribution de principales séquences types des plasmides IncI1 (histogramme A) et IncF (histogramme B) et leur association aux principaux gènes de bêta-lactamases

Figure 4 Structure "backbone" des plasmides IncA/C

Figure 5 (A) Constitution génétique des plasmides conjugatifs et mobilisables. (B) Représentation des interactions essentielles durant le processus de conjugaison Figure 6 Structure d'un intégron de résistance aux antibiotiques

Figure 7 Structure et modalité de transposition de l'ISEcp1 Figure 8 Structure et fonctionnalité de l'ISCR1

Figure 9 Structure schématique d'un intégron complexe de classe 1

Figure 10 Représentation schématique d'une séquence d'insertion, d'un transposon composite et un transposon de type Tn3

Figure 11 Représentation schématique du transposon conjugatif Tn916

Figure 12 Comparaison de la structure du domaine catalytique RNAse H de différentes protéines de la superfamille des polynucléotidyl-transférases

Figure 13 Conservation du motif DDE de différentes transposases, intégrases et rétrotransposases

Figure 14 Réactions de clivage et transfert de brin catalysées par les transposases à DDE Figure 15 Modèle de catalyse à deux ions

Figure 16 Les deux modes principaux de transposition

Figure 17 Mécanismes de transposition performés par les transposases à motif DDE

Figure 18 Voie de transposition TnsABC+D utilisée par Tn7 pour l'intégration dans le chromosome

Figure 19 Voie de transposition TnsABC+E utilisée par Tn7 pour l'intégration au niveau du plasmide conjugatif

Figure 20 Recombinaison site-spécifique catalysée par les recombinases à sérine Figure 21 Organisation structurale du transposon Tn5397

Figure 22 Représentation schématique du test d'excision d'un minitransposon (miniTn5397) construit à partir de Tn5397

Figure 23 Mécanisme de transposition de transposition de Tn4451 Figure 24 Mécanisme de mobilisation de Tn4451

Figure 25 Modèle du mécanisme de transposition catalysé par les transposases à sérine Figure 26 Recombinaison site-spécifique catalysée par les recombinases à tyrosine Figure 27 Modèle d'excision et d'intégration du transposon Tn916

Figure 28 Représentation schématique du transposon conjugatif CTnDOT

Figure 29 Modèle du mécanisme de transposition catalysé par les transposases à tyrosine Figure 30 Organisation des domaines catalytiques de quelques protéines de la famille HUH

Figure 31 Modèle de la réplication en cercle roulant

Figure 32 Organisation des éléments de la famille IS200/IS605 Figure 33 Cycle de transposition de l'IS608

Figure 34 Représentation schématique des modèles de transposition RC Figure 35 Antibiogramme standard en milieu gélosé de K. pneumoniae Kp2735

Figure 36 Analyse par PFGE-S1 nucléase du contenu plasmidique de la souche Kp2735 et son transconjugant

Figure 37 Hypothèse de la formation du plasmide p2735

Figure 38 Représentation schématique de l’insertion de l’IS1294b dans le gène sacB et exemple de résultats obtenus après amplification par PCR

Figure 39 Représentation schématique du test de transposition in vivo Figure 40 Représentation schématique de l'IS1294b

Figure 41 Séquence nucléotidique de l'oriIS

Figure 42 Alignements de séquences des 90 premières bases de l’oriIS des IS1294 Figure 43 Alignement de séquences des 21 premières bases de l’oriIS des IS91-like

Figure 44 Fréquences de transposition des mutants ponctuels introduits dans la séquence

oriIS (bases 1 à 25)

Figure 45 Représentation de la séquence nucléotidique du terIS

Figure 46 Représentation schématique des différentes constructions réalisées Figure 47 Séquence protéique de la TnpA_IS1294b

Figure 48 Alignement des séquences des motifs Y2 (en rouge) et HUH (en vert) de la TnpA_IS1294 avec celles des autres transposases Y2, des protéines Rep et des relaxases

Figure 49 Alignement de la séquence riche en cystéines, à l'extrémité N-terminale, des transposases TnpA_IS1294, TnpA_IS91 et TnpA_IS801

Figure 50 Gel SDS-PAGE et coloration au bleu de coumassie

Figure 51 Représentation schématique de la protéine recombinante 9H8N-TRX-8H-TnpA Figure 52 Gels SDS-PAGE à 11% comparant de deux purifications différentes réalisées sur

des billes de Ni-NTA agarose

Figure 53 Purification de la protéine recombinante 9H8N-TRX-8H-TnpA sur une colonne de Cobalt

Figure 54 Gel SDS-PAGE 11% correspondant à la fraction après purification sur gel filtration Figure 55 Différents contextes du gène blaCMY-2 sur des plasmides appartenant à de groupes

d’incompatibilité ou complexes clonaux différents (pour IncI1) Figure 56 Vue rapprochée des sites actifs de TrwC (à gauche) et TraI (à droite) Figure 57 Modèle de catalyse proposé pour les relaxases TrwC et TraI

INDEX DES TABLEAUX

Tableau 1 Caractéristiques des familles des séquences d’insertion

Tableau 2 Fréquence de transpostion en fonction du temps de génération et de la température

Tableau 3 Analyse des cinq clones issus des expériences de "one-ended transposition" Tableau 4 Etude de l'effet de mutations ponctuelles introduites au niveau du tétranucléotide

de l'oriIS, sur l’efficacité de transposition

Tableau 5 Fréquences de transposition obtenues avec des transposases mutées Tableau 6 Caractéristiques des souches bactériennes utilisées au cours de cette étude Tableau 7 Caractéristiques des plasmides utilisés au cours de cette étude

1

Première partie : Introduction générale

La résistance aux antibiotiques : un lien entre l’environnement et la clinique

Cependant, l’efficacité remarquable des antibiotiques s’est accompagnée de leur utilisation massive et répétée en santé humaine et animale. Ce phénomène a généré une pression sur les bactéries, qui ont développé des systèmes de défense contre ces antibiotiques. La résistance aux antibiotiques est secondaire à des mutations dans des gènes résidents de structure ou de régulation. Le transfert horizontal d’information génétique étrangère par transformation, conjugaison et transduction permet également l’acquisition de la résistance. De nombreux éléments génétiques mobiles tels que les plasmides et les éléments transposables, favorisent la dissémination de gènes de résistance entre bactéries. L’apparition de bactéries résistantes à plusieurs antibiotiques (bactéries multi-résistantes ou BMR) en particulier les souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline (SARM), les entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et les entérocoques résistants à la vancomycine (ERV), pose des problèmes en thérapeutique. L'origine des gènes associés à la résistance a longtemps été un mystère. Il existe un nombre croissant de preuves qui démontre que les microbes retrouvés dans l’environnement sont très résistants aux médicaments, et aux xénobiotiques en général. Les gènes qui composent ces microbes ont le potentiel d’être transférés à des agents pathogènes. Plusieurs études ont montré que les bactéries résistantes aux antibiotiques peuvent être isolées à partir d'une variété d'animaux, y compris des mammifères tels que les sangliers et les rongeurs, oiseaux, poissons, et les insectes (Wright 2010).

En outre, les pratiques agricoles ont un impact majeur sur la distribution des éléments de résistance dans l'environnement. De nombreux rapports ont lié l'utilisation d'antibiotiques ou les pratiques d'élevage à l'isolement des bactéries résistantes dans la production de porcs, la volaille et la viande bovine (McEwen and Fedorka-Cray 2002). En effet, les antimicrobiens sont administrés aux animaux pour une variété de raisons, y compris le

2 traitement des maladies, la prévention, le contrôle et la stimulation de la croissance (Marshall and Levy 2011). Les bêta-lactamines sont l’une des familles d’antibiotiques les plus utilisées en médecine vétérinaire. Les céphalosporines de 3ème génération les plus récemment introduites sont la cefquinome et le ceftiofur dont la principale indication est le traitement curatif des infections respiratoires à Streptococcus spp, Pasteurella spp,

Actinobacillus spp et Bacteroides spp (LANG, ROSE et al. 2002; de Jong, Thomas et al. 2014);

cependant, peu de temps après leur introduction, des mécanismes de résistance sont apparus chez Escherichia coli, Klebsiella spp. et chez des bactéries zoonotiques telles que les

Salmonelles (Cavaco, Abatih et al. 2008; Timofte, Maciuca et al. 2014).

À l’instar des céphalosporines, les fluoroquinolones comptent parmi les antibiotiques les plus importants pour traiter des infections sévères et invasives chez les animaux. Dans certains pays du monde, cette famille d’antibiotiques a été approuvée pour la volaille ; mais des années plus tard, des souches de Campylobacter résistantes à la sarafloxacine et à l’enrofloxacine ont émergé (Humphrey, Jorgensen et al. 2005). Une résistance croisée à la ciprofloxacine (utilisée chez les humains) a aussi été observée (SAVASAN, CIFTCI et al. 2002; MONIRI and DASTEHGOLI 2005).

Un autre exemple de l’émergence de l’antibiorésistance chez les animaux est la résistance à l’apramycine qui appartient à la famille des aminosides (Yates, Pearce et al. 2004).

En effet, la sélection des pathogènes résistants chez les animaux, due à l’utilisation intense des antibiotiques, a aussi des conséquences néfastes sur la santé humaine. Les humains peuvent être infectés suite à un contact direct avec l’animal ou après ingestion des aliments contaminés (viande ou de l’eau par exemple) (Marshall and Levy 2011). Beaucoup d’antimicrobiens administrés aux animaux producteurs d’aliments sont soit identiques, soit apparentés à des médicaments utilisés en médecine humaine, incluant les pénicillines, les tétracyclines, les céphalosporines et les fluoroquinolones (McEwen and Fedorka-Cray 2002). Ceci est problématique parce qu’un gène de résistance à un antibiotique particulier peut aussi entrainer la résistance à une classe entière d’antibiotiques (McDermott, Walker et al. 2003), en plus certains gènes peuvent causer une résistance croisée à des composés structurellement différents (Chen, He et al. 2009).

Les gènes de résistance d’importance clinique peuvent être disséminés via les éléments génétiques mobiles à des espèces bactériennes diversifiées et non apparentées, y comprises celles qui causent des maladies humaines. Cette dissémination implique deux types

3 différents des éléments mobiles : ceux qui sont capables de transférer les gènes entre les molécules d’ADN comme par exemple les séquences d’insertion (IS), les cassettes des gènes, les intégrons et les transposons ; et ceux qui permettent le transfert entre les cellules comme par exemple les plasmides conjugatifs et mobilisables.

La nature des différents éléments mobiles d’une bactérie peut conduire à des assemblages rappelant les poupées russes qui s’imbriquent les unes dans les autres (Amabile-Cuevas and Chicurel 1992). Les éléments mobiles peuvent s’imbriquer de la même manière créant ainsi, des éléments d’une plus grande complexité : un plasmide peut contenir un transposon qui contient à son tour un intégron. L’intégron peut alors enrichir l’élément mobile avec de nouvelles cassettes de gènes, le transposon permet de laisser une copie des gènes qu’il porte sur le chromosome bactérien, avant d’être disséminé à d’autres bactéries grâce au transfert conjugatif du plasmide qui porte le tout. Des associations de ce genre entre éléments mobiles sont certainement à l’origine de la formation d’éléments mobiles plus complexes véhiculant et disséminant des multi résistances aux antibiotiques (Walsh 2006).

Figure 1 : Effet poupée russe des éléments génétiques mobiles. Les éléments génétiques mobiles s'imbriquent les unes dans les autres pour former des structures complexes rassemblant plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques.

4 Dans ce contexte, mon travail de thèse correspond à élucider l’implication d’une séquence d’insertion atypique nommée IS1294b dans la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries. Cette séquence d’insertion, souvent associée aux gènes de virulence, a été identifiée en amont du gène de la céphalosporinase blaCMY-2

présent sur le plasmide conjugatif d’une souche d’origine clinique de Klebsiella pneumoniae (Kp2735) résistante à haut niveau à la ceftazidime. Cependant, peu de choses sont connues sur l’IS1294b, en particulier son mécanisme de transposition est toujours mal compris, en particulier parce que la transposase (protéine permettant la mobilisation d’une séquence d’insertion) codée par cette séquence n’a jamais été purifiée. Ainsi, au laboratoire, nous avons essayé d’adopter une approche basée sur l’étude de la mécanistique de l’IS1294b, à la fois in vivo et in vitro, afin de bien comprendre son comportement fonctionnel. L’ensemble des résultats obtenus au cours de ma thèse sera présenté dans la troisième partie de ce manuscrit.

5

Deuxième partie : Etude bibliographique

- Chapitre I -

La résistance aux Bêta-lactamines – Cas des céphalosporinases

1) Classification des β-lactamases

Les β-lactamines, pour leur large spectre antibactérien, leur activité bactéricide temps-dépendant et leur faible toxicité, constituent la famille d'antibiotiques la plus vaste et la plus prescrite. Elles comprennent les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, le monobactame et les carbapénèmes, et ont toutes en commun le cycle β-lactame. Elles ciblent les transpeptidases (nommées aussi PLPs = Protéines Liant la Pénicilline) qui sont des enzymes impliquées dans la synthèse du peptidoglycane, hétéropolymère essentiel de la paroi bactérienne. En effet, par analogie structurale avec le motif D-Ala-D-Ala, substrat naturel des PLPs, le cycle β-lactame se lie de manière covalente et irréversible au site actif de l’enzyme provoquant son inactivation. Il en résulte un peptidoglycane faiblement réticulé, ce qui rend les bactéries très sensibles à la lyse cellulaire induite par l'activité dérégulée des autolysines qui sont capables de dégrader le peptidoglycane en clivant les liaisons osidiques et peptidiques (Kitano and Tomasz 1979).

La résistance naturelle ou acquise aux β-lactamines est caractérisée par au moins quatre mécanismes qui peuvent par ailleurs être combinés :

- Modification d’affinité de la cible (PLPs)

- Diminution de la perméabilité de la membrane externe ; - Expression d’une pompe d’efflux actif ;

- L’inactivation enzymatique par les β-lactamases, qui est le mécanisme le plus courant, et sera abordé en particulier par la suite.

Les β-lactamases sont des enzymes bactériennes capables d’hydrolyser le cycle β-lactame, ce qui provoque l’inactivation de l’antibiotique avant qu’il n’atteigne sa cible (PLPs). Une fois exprimées, les β-lactamases sont sécrétées dans l’espace périplasmique chez les bactéries à Gram négatif, ou sont excrétées chez les bactéries à Gram positif. Elles peuvent être

6 chromosomiques, présentes chez toutes les souches d'une même espèce (résistance naturelle) ou acquises chez une souche particulière par suite de transferts génétiques à partir d’éléments génétiques mobiles (acquisition de plasmides ou de transposons). Récemment, un nombre de plus en plus croissant des gènes des β-lactamases (bla) est découvert sur les intégrons qui sont susceptibles de capturer et d’exprimer des cassettes des gènes de résistance (Weldhagen 2004), et sont souvent associés à des plasmides ou des transposons permettant leur mobilisation.

Aujourd'hui, plus de 890 β-lactamases uniques ont été identifiées dans des isolats bactériens d'origine naturelle (Bush and Jacoby 2010) (http://www.lahey.org/studies). Ainsi, deux systèmes de classification pour les β-lactamases sont actuellement en usage. La première classification est moléculaire, basée sur les séquences d'acides aminés et divise les β-lactamases en 4 classes A, B, C et D : les classes A, C et D appelées aussi sérines enzymes parce qu’elles utilisent le résidu sérine pour l'hydrolyse des β-lactamines, alors que la classe B comprend les métallo-enzymes qui nécessitent des ions divalents de zinc pour l'hydrolyse du substrat (Bush and Jacoby 2010).

La seconde classification, dite fonctionnelle, est basée (i) sur les propriétés fonctionnelles des enzymes, (ii) sur le spectre de substrats préférentiels des enzymes et (iii) sur leur comportement par rapport aux inhibiteurs (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam). Les principaux groupes de cette classification sont en corrélation avec la classification moléculaire à base plus large (Bush and Jacoby 2010).

 Le groupe 1 comprend les céphalosporinases chromosomiques appartenant à la classe moléculaire C (AmpC). Elles sont actives sur les céphamycines comme la céfoxitine, et confèrent une résistance à l'inhibition par l'acide clavulanique. Chez certaines bactéries, l'expression des AmpC est faible mais elle est inductible par certaines β-lactamines comme l'amoxicilline, l'ampicilline, l'imipénème et l'acide clavulanique.

 Le groupe 2 comprend les sérines β-lactamases appartenant aux classes moléculaires A et D. Elles représentent le groupe le plus large en raison de l'identification croissante des BLSE au cours des 20 dernières années. Plusieurs sous-groupes ont été identifiés, parmi lesquels :

1. le sous-groupe 2a des pénicillinases qui hydrolysent préférentiellement de nombreux dérivés de la pénicilline, avec une faible hydrolyse des céphalosporines, monobactames ou carbapénèmes.

7 2. Les β-lactamases du sous-groupe 2b hydrolysent facilement les pénicillines et les

céphalosporines de première génération, elles sont fortement inhibées par l'acide clavulanique et le tazobactam, et incluent les enzymes plasmidiques TEM-1, TEM-2 et SHV-1. Le sous-groupe 2be comprend les BLSE qui conservent l'activité contre les pénicillines et les céphalosporines du groupe 2b, et en plus elles hydrolysent les céphalosporines de 3ème génération (céfotaxime, ceftriaxone, ceftazidime), le céfépime et l'aztréonam. Les BLSE de type CTX-M hydrolysent plus efficacement le céfotaxime que la ceftazidime, d'où la nomination CTX-M; et elles sont inhibées plus par le tazobactam que par l’acide clavulanique. Les autres BLSE confèrent un haut niveau de résistance à la ceftazidime et parfois à l'aztréonam plutôt qu'au céfotaxime, et sont moins répandues que le groupe CTX-M.

3. Le sous-groupe 2c hydrolyse préférentiellement la carbénicilline et la ticarcilline. 4. Le sous-groupe 2d comprend les oxacillinases ou OXA enzymes (hydrolysant

l'oxacilline et la cloxacilline) et les carbapénémases de classe D (OXA enzymes avec activité hydrolytique vis-à-vis des carbapénèmes, exemple OXA-48).

5. Le sous-groupe 2f inclut les carbapénémases de classe A, partiellement inhibées par l'acide clavulanique. Plus inquiétantes, sont apparues les carbapénémases codées sur des plasmides, en particulier les enzymes KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) qui sont de plus en plus associées à des infections par des

bactéries à Gram négatif multirésistantes, isolées dans les hôpitaux.

 Le groupe 3 regroupe les métallo-β-lactamases (MBLs) de la classe B, nécessitant des ions zinc dans leur site catalytique. Ces enzymes confèrent la résistance à la quasi-totalité des β-lactamines (pénicillines, céphalosporines, et principalement les carbapénèmes) excepté les monobactames et sont inhibées par les chélateurs des ions métalliques (EDTA), mais pas par l'acide clavulanique. Les MBLs sont essentiellement des enzymes de type IMP (IMiPemenase) ou VIM (Verona IMipemenase) codées sous forme de cassettes des gènes au sein des intégrons qui s'associent à des transposons et peuvent s'insérer sur le chromosome bactérien ou dans des plasmides. Récemment, une nouvelle zinc-métallo-β-lactamase a été découverte, elle a été nommée NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase 1) parce qu'elle a été identifiée pour la 1ère fois dans une souche de K. pneumoniae et dans une souche d’E. coli isolées chez un patient suédois

8 rapatrié après un séjour dans un hôpital de New Delhi. Le gène blaNDM-1 a été identifié

sur plusieurs types plasmidiques notamment IncA/C, IncF, IncL/M, et peut être transféré entre les bactéries à Gram négatif par conjugaison. Contrairement aux gènes blaIMP et

blaVIM, le blaNDM-1 n'a pas été trouvé sur les intégrons; néanmoins, il s'est propagé

largement et rapidement (Palzkill 2013).

2) Les céphalosporinases plasmidiques

Les céphalosporinases (Cases) comptent parmi les β-lactamases les plus abondantes en raison du nombre d'organismes qui produisent ces enzymes. Les gènes de ces céphalosporinases, désignées comme des enzymes AmpC spécifiques d'espèce, se retrouvent souvent sur les chromosomes des entérobactéries. Elles sont produites à bas niveau (expression basale), mais elles peuvent être induites à des concentrations élevées en présence des agents inducteurs tels que l'amoxicilline ou l'acide clavulanique. L'hyperproduction conduit à un phénotype de résistance plus étendu ou large que celui d'une BLSE, car outre la résistance aux C3G, émerge celle vis-à-vis des céphamycines (céfoxitine, céfotétan) et celle aux agents inhibiteurs comme l'acide clavulanique. Les premières céphalosporinases plasmidiques ont été découvertes en 1988 aux Etats-Unis et à la Corée du Sud, dans des souches cliniques de K. pneumoniae (Philippon, Arlet et al. 2002); ensuite elles ont émergé dans divers continents chez diverses espèces d'entérobactéries parmi lesquelles E. coli et K. pneumoniae sont les plus représentées ainsi que Salmonella

enterica ou Proteus mirabilis (Philippon, Arlet et al. 2002). CMY-2 est la céphalosporinase

plasmidique la plus répandue dans le monde entier, elle est codée par le gène blaCMY-2 et

présente une grande similarité avec l'AmpC chromosomique de Citrobacter freundii. Ce dernier a donc été considéré comme son progéniteur (Wu, Dornbusch et al. 1999). La résistance plasmidique médiée par CMY-2 a été rapportée particulièrement dans des souches de Salmonella spp. et d'E. coli isolées à partir des aliments produits par les animaux (Guo, Zhang et al. 2014). Par conséquent, l'émergence des plasmides, portant le gène bla

CM-2, au sein des populations vétérinaires d'élevage, a posé des inquiétudes croissantes pour la

santé humaine. Aux Etats-Unis, certaines études ont montré que des infections humaines avec des Salmonella possédant le gène blaCMY-2 étaient associées à la consommation des

produits laitiers crus ou des viandes mal cuites (Fey, Safranek et al. 2000; Gupta, Fontana et al. 2003): des isolats bactériens provenant à la fois des humains et du bétail avaient des

9 antibiogrammes et des pulsotypes (profils de restriction obtenus en PFGE, Pulsed-Field Gel electrophoresis) indiscernables (Gupta, Fontana et al. 2003). Les plasmides associés au gène

blaCMY-2 sont souvent conjugatifs, appartenant à des types variés y compris IncA/C, IncI1,

IncI2 et IncFII (Bortolaia, Hansen et al. 2014). Cependant, les plasmides IncA/C et IncI1 sont les porteurs les plus communs du blaCMY-2, dont l'environnement génétique présente des

structures de type transposon ISEcp1/ΔISEcp1-blaCMY-2-blc-sugE (Mata, Miro et al. 2012). Il a

été décrit que la séquence d'insertion ISEcp1 était responsable de la mobilisation du gène

blaCMY-2 à partir du chromosome de C. freundii (Kang, Besser et al. 2006; Verdet, Gautier et

al. 2009).

10

- Chapitre II -

Mobilité de la résistance aux antibiotiques

Chez les bactéries, les gènes de résistance aux antibiotiques sont portés par le chromosome et le plasmide, structures génétiques capables de se répliquer et de se transmettre aux cellules filles. Ces supports génétiques sont souvent associés à des éléments génétiques mobiles capables de mobiliser les gènes de résistance soit au niveau intracellulaire (les transposons, les séquences d'insertion ou les cassettes des intégrons) ou intercellulaire (les plasmides conjugatifs et mobilisables ou les éléments intégratifs conjugatifs ICE).

1) Les plasmides

Ce sont des ADN circulaires extra-chromosomiques capables d'autoréplication (réplicon) et parfois de transfert. Ils possèdent une origine de réplication (ori) qui les divise en classes d'incompatibilité (groupe Inc) : en principe 2 plasmides appartenant au même groupe d'incompatibilité ne peuvent pas coexister dans la même bactérie (si aucune pression de sélection n’est maintenue) et s'excluent mutuellement. Les plasmides ne sont pas essentiels à la survie de la bactérie mais codent pour des fonctions permettant une meilleure adaptation de la bactérie hôte à l'environnement (résistance aux antibiotiques, toxines, adhésines, chaînes métaboliques supplémentaires,…). Les plasmides se caractérisent par leur nombre de copies, leur mobilisation, leur origine de transfert (oriT) et leur spécificité d'hôte. Ils présentent également des systèmes de maintien ou de stabilisation qui leur permettent de se maintenir dans une population bactérienne. Parmi ces systèmes de stabilisation, on distingue les systèmes de partition, les systèmes toxine-antitoxine (STA) et les systèmes de résolution des multimères (Austin, Ziese et al. 1981; Bouet, Nordstrom et al. 2007; Van Melderen and Saavedra De Bast 2009; Guynet and de la Cruz 2011).

1.1) Réplication des plasmides

La réplication de l'ADN plasmidique fait largement appel à l'équipement enzymatique de la bactérie hôte. Il y a trois mécanismes généraux pour la réplication des plasmides circulaires, à savoir, le type thêta, le déplacement de brin, et le cercle roulant (RC, pour rolling circle). En général, les plasmides contiennent une ou plusieurs origines (ori) de

11 réplication et un ou plusieurs éléments régulateurs, situés dans un fragment d'ADN ne dépassant pas 4 kb. Souvent, l'initiation de la réplication nécessite la synthèse d'une protéine appelée Rep codée par le plasmide, et qui agit d'une manière spécifique sur l'origine ori, avec ou sans intervention de la protéine DnaA qui permet l'initiation de la réplication de l'ADN chromosomique. Le nombre de copies d'un plasmide varie de 1 à quelques dizaines par bactérie, souvent en relation avec leur taille. Le contrôle de la réplication se fait essentiellement par deux types de mécanismes. L'un utilise une série des séquences répétées, appelées itérons, localisées dans l'ori et sont capables d'interagir avec la protéine de réplication. Le 2ème mécanisme implique la synthèse de petits ARN anti-sens qui s'hybrident d'une façon complémentaire aux transcrits responsables du processus de l'initiation (del Solar, Giraldo et al. 1998; Actis, Tolmasky et al. 1999).

1.2) Classification des plasmides selon leur incompatibilité

Le phénomène d'incompatibilité des plasmides est lié à la régulation du nombre des copies des plasmides et à leur ségrégation. Un groupe de compatibilité est défini comme un ensemble de plasmides dont les membres sont incapables de coexister dans la même cellule bactérienne. La raison de cette incompatibilité est qu'on ne peut les différencier les uns des autres à des étapes essentielles au maintien du plasmide, comme la réplication de l'ADN. Pour contrôler cette incompatibilité, les plasmides utilisent un système de régulation négatif qui mesure la concentration des origines de réplication. Depuis l'an 2005, La classification des plasmides selon leur incompatibilité est basée sur une méthode de typage moléculaire utilisant l’amplification par PCR (Carattoli, Bertini et al. 2005; Villa, Garcia-Fernandez et al. 2010), nommée PCR based replicon typing (PBRT). Actuellement, 27 groupes d'incompatibilité ont été identifiés chez les entérobactéries (Carattoli 2009). Chaque groupe d'incompatibilité se caractérise par une sélectivité pour un spectre d'hôte donné. Il existe des plasmides à large spectre d'hôte (IncA/C, IncP, IncQ) pouvant s'exprimer de façon stable dans de nombreuses espèces bactériennes (Gram+ et Gram-), alors que d'autres plasmides sont à spectre étroit (IncF, IncI1). A ce jour, des milliers des plasmides de résistance, isolés des souches d'entérobactéries cliniquement significatives, ont été typés et assignés à des groupes Inc (Carattoli 2009; Carattoli 2011). Certains groupes d’incompatibilité (IncI1, IncHI2, IncF et IncN) peuvent être soumis à un sous-typage par la méthode pMLST (plasmid Multilocus- Sequence Typing, http://pubmlst.org/) et assignés à des séquences types ou ST.

12 La majorité des plasmides IncF sont associés au gène blaCTX-M-15, tandis que le gène blaCTX-M-1

se trouve majoritairement sur les plasmides IncI1 (Girlich, Poirel et al. 2007; Carattoli 2009; Carattoli 2011). Par la suite, je ne détaillerai que les aspects épidémiologiques des plasmides IncA/C et IncI1 qui sont en relation étroite avec une partie du travail de ma thèse.

1.

No

d'is

o

la

ts

No

d'is

o

la

ts

A

B

Figure 3 : Distribution de principales séquences types des plasmides IncI1 (histogramme A) et IncF (histogramme B) et leur association aux principaux gènes de bêta-lactamases (Carattoli 2011).

13 2.1) Les plasmides IncA/C

Les plasmides appartenant au groupe d'incompatibilité IncA/C ont été décrits dans la littérature il y a 40 ans. Ce sont de gros plasmides, à faible nombre de copies, se répliquant par le mode thêta. Ils ont été identifiés à partir d'isolats provenant de l'homme mais aussi d'origine animale (bœuf, dinde, poulet, porc) (Winokur, Vonstein et al. 2001) et sont considérés comme les principaux vecteurs de la dissémination du gène blaCMY-2 aux

Etats-Unis, Canada et en Europe (Winokur, Vonstein et al. 2001; Daniels, Call et al. 2007; Call, Singer et al. 2010; Mataseje, Baudry et al. 2010). Ces plasmides ayant un spectre d'hôtes extrêmement large, ont été retrouvés dans toutes les espèces d'entérobactéries (Cloeckaert, Baucheron et al. 2001; Welch, Fricke et al. 2007; Pan, Ye et al. 2008; Lindsey, Fedorka-Cray et al. 2009) mais aussi dans Photobacterium damselae et Aeromonas salmonicida (Kim and Aoki 1996; McIntosh, Cunningham et al. 2008). Au cours des dernières années, un intérêt croissant a été porté pour l'étude des plasmides IncA/C en raison de leur capacité à conférer un phénotype de multirésistance aux agents antimicrobiens (MDR), couplé avec un pouvoir de dissémination via le transfert par conjugaison (Arpin, Thabet et al. 2012). Parmi les gènes identifiés au sein des régions accessoires des plasmides IncA/C sont ceux codant pour la résistance à la tétracycline (tetA), le chloramphénicol/florfénicol (FloR), la streptomycine/spectinomycine (aadA2), les sulfamides (sul1 et sul2), et les β- lactamases à spectre étendu (blaCMY-2). En outre, l'émergence récente d'épidémie des souches contenant

le gène de la métallo- β -lactamase blaNDM-1, et qui sont résistantes à tous les antibiotiques

chez les humains, a été associée au plasmide IncA/C (Kumarasamy, Toleman et al. 2010). Le séquençage comparatif des plasmides IncA/C associés au gène blaCMY-2 a révélé qu'ils

possèdent au moins 3 régions "hotspots" pour l'intégration des éléments génétiques mobiles et les gènes accessoires associés : la région contenant les intégrons de classe 1, la région contenant les séquences d'insertion IS26, et la région comportant les éléments ISEcp1 avec une ou plusieurs copies du gène blaCMY-2 insérées au sein des régions des gènes tra1 et tra2 permettant le transfert conjugatif (Fernandez-Alarcon, Singer et al. 2011). En outre, il a

été décrit que la présence de différents éléments ISCR sur les plasmides IncA/C, avait un rôle clé dans l'évolution de ces plasmides via l'acquisition efficace des gènes de résistance aux antibiotiques (Toleman and Walsh 2010). Ces éléments ISCR sont maintenant reconnus comme de puissants systèmes de capture et de mouvement de gènes de résistance, en raison de leur capacité à se déplacer par le processus de la réplication du cercle-roulant,

14 permettant ainsi le transfert des séquences supplémentaires localisées en amont de leurs gènes de transposase.

1.2.2) Les plasmides IncI1

Les plasmides IncI1 ont un spectre étroit d'hôtes parce qu'ils sont strictement limités aux entérobactéries, ils ont longtemps été associés à Salmonella enterica (Rangnekar, Banker et al. 1983). Ce type de plasmides a servi de prototype pour l'étude des mécanismes de transfert et de stabilité chez les plasmides à spectre étroit d'hôtes (Rees, Bradley et al. 1987; Kim and Komano 1997). Ils se distinguent des autres plasmides conjugatifs par la présence des deux types de pilus: un pilus mince et flexible appartenant au système de sécrétion de type IV, et il est requis uniquement pour la conjugaison en milieu liquide (Kim and Komano 1997; Cloeckaert, Praud et al. 2010); et un 2ème pilus épais et rigide essentiel pour le transfert du plasmide à la fois en milieu liquide et sur les surfaces solides (Cloeckaert, Praud et al. 2010). Les plasmides IncI1 ont été associés à un certain nombre de modules

Figure 4 : Structure "backbone" des plasmides IncA/C (Johnson and Lang 2012). Les hotspots d'intégration sont représentés avec des flèches noires, et les modules d'insertion des plasmides IncA/C séquencés sont résumés à côté des flèches. La région colorée en bleu est similaire à un élément intégratif conjugatif (ICE). Les régions colorées en rouge et en vert présentent des similarités avec des régions de transfert putatives.

15 génétiques de résistance impliquant les modules de résistance aux sulfamides sul1 et sul2, et ceux de résistance à spectre étendu aux céphalosporines (bla(CTX), bla(SHV), bla(CMY), et

bla(TEM)) (Tato, Coque et al. 2007; Diestra, Juan et al. 2009; Bortolaia, Guardabassi et al.

2010; Cloeckaert, Praud et al. 2010). Des études ont montré l'émergence des plasmides IncI1 hébergeant le gène blaCTX-M-1 au sein des souches de Salmonella enterica d'origine animale et

humaine, isolées en France dans la période de 2003 à 2008 (Cloeckaert, Praud et al. 2010). Le gène blaSHV-12 a été identifié sur des plasmides IncI1 retrouvés dans des souches cliniques

d'E. coli et de K. pneumoniae en Espagne (Diestra, Juan et al. 2009). Une large dissémination des plasmides IncI1-blaCMY-2 a eu lieu parmi des souches cliniques d'E. coli en Australie

(Sidjabat, Seah et al. 2014).

1.3) Classification des plasmides selon leur mode de propagation

Les plasmides sont classés selon leur transférabilité par conjugaison, ils peuvent être conjugatifs ou non conjugatifs. Les plasmides conjugatifs sont autotransférables, de grande taille (>30 kb) et à faible nombre de copies; ils possèdent toute la machinerie nécessaire pour l'auto-transfert. En effet, la conjugaison est un mécanisme efficace et sophistiqué de transfert d'ADN chez les bactéries et constitue donc une composante importante de l'évolution bactérienne. Elle implique le clivage de l'ADN à transférer au niveau d'un site appelé oriT (ou origine de transfert), à l'aide d'une protéine dite la relaxase. Cette réaction conduit à la formation d'une liaison covalente entre la relaxase et le site oriT. Le complexe nucléoprotéique résultant est ensuite transporté dans la bactérie réceptrice par le système de sécrétion de type de IV (T4SS). Ainsi le brin d'ADN est activement pompé dans la cellule réceptrice par la protéine de couplage de type IV (T4CP) (Llosa, Gomis-Ruth et al. 2002; Smillie, Garcillan-Barcia et al. 2010). D'autre part, certains plasmides contiennent un ensemble minimal de gènes (ou de séquences) qui leur permet d'être transmis par conjugaison, juste en cas de présence d'un plasmide conjugatif auxiliaire. Ces plasmides sont dits mobilisables. Ils contiennent généralement une oriT, un gène de relaxase et une ou plusieurs protéines accessoires pour le clivage. Cependant, contrairement aux plasmides conjugatifs, les plasmides mobilisables ne codent pas pour leur propre MPF (Mating pair formation), qui est une forme du système de sécrétion type IV, permettant l'assemblage et le fonctionnement du pilus sexuel liant les cellules donneuses et receveuses. Il existe

16 également des plasmides non mobilisables qui se propagent par transformation naturelle ou par transduction (Smillie, Garcillan-Barcia et al. 2010).

2) Les intégrons

Les intégrons sont des éléments génétiques bactériens capables de capturer et d'exprimer des gènes de résistance aux antibiotiques sous forme de cassettes (Stalder, Barraud et al. 2012). Tous les intégrons possèdent trois éléments fonctionnels fondamentaux. Le premier élément est l'intégrase codée par le gène intI. C'est une tyrosine recombinase spécifique de site, elle catalyse l'ntégration ou l'excision des cassettes de gènes (Messier and Roy 2001). Le deuxième élément est le site de recombinaison attI reconnu par l'intégrase, et il est le site récepteur des cassettes (Partridge, Recchia et al. 2000). Une fois qu'une cassette de gène est recombinée, elle est exprimée par le promoteur Pc qui est le troisième élément de la plateforme fonctionnelle de l'intégron (Collis and Hall 1995). Les cassettes sont des éléments mobiles non autonomes et non réplicatifs, elles sont constituées d'un cadre ouvert de

Figure 5 : (A) Constitution génétique des plasmides conjugatifs et mobilisables. Les plasmides conjugatifs comportent quatre composants nécessaires à la conjugaison: une origine de transfert (oriT) (violet), une relaxase (R) (rouge), une protéine de couplage type IV (T4CP) (vert), et un système de sécrétion de type IV (T4SS) (bleu). Les plasmides mobilisables contiennent seulement un module MOB avec ou sans le T4CP. (B) Représentation des interactions essentielles durant le processus de conjugaison. La conjugaison est initiée suite à un clivage d'un site spécifique au niveau de l'oriT, par la relaxase. Le brin d'ADN lié à la relaxase est déplacé via le processus de réplication. La relaxase interagit avec le T4CP et les composants de T4SS, ce qui initie le transfert dans la cellule réceptrice. L'ADN est ensuite pompé dans le récepteur via l'activité ATPase du T4CP (Smillie, Garcillan-Barcia et al. 2010).

17 lecture et d'un site de recombinaison spécifique attC (Collis and Hall 1995), et peuvent exister sous deux formes: une forme transitoire libre circulaire ou une forme linéaire intégrée au sein d'un intégron (Collis and Hall 1992). Les cassettes sous forme circulaire, sont insérées par une recombinaison site-spécifique entre attI et attC. Il existe deux types d'intégrons:

- Les intégrons de multirésistance associés aux séquences d'insertion, aux transposons et aux plasmides conjugatifs. Ils sont impliqués essentiellement dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques (Mazel 2006).

- Les super-intégrons localisés sur le chromosome et contenant un nombre important des cassettes de gènes dont la majorité n'a aucune fonction connue (Mazel 2006). Cependant des études ont montré que des gènes des super-intégrons codent pour des fonctions d'adaptation des bactéries aux conditions de l'environnement (Boucher, Nesbo et al. 2006).

Il est à noter que les intégrons de multirésistance ont été divisés en quatre classes, avec une majorité d’intégrons de classe 1. Ils ont essentiellement été retrouvés chez les bactéries à Gram négatif, en particulier toutes les espèces des entérobactéries dont la majorité a été isolée d’environnements d’origine clinique. Au moins 130 cassettes différentes (moins de 98% d'identité nucléotidique) portant des gènes de résistance aux antibiotiques ont été identifiées dans les intégrons de multirésistance (Partridge, Tsafnat et al. 2009). Toutes les familles d'antibiotiques sont quasiment concernées. Récemment, une étude importante a montré que l'induction de la réponse SOS par les antibiotiques entraine l'acquisition de nouvelles cassettes de résistance mais aussi le réarrangement des cassettes présentes dans l'intégron de multirésistance (Guerin, Cambray et al. 2009).

18 3) Les éléments transposables bactériens

Il y a plus de 60 ans Barbara McClintock, qui a découvert les éléments transposables (ETs), a suggéré qu’ils avaient la capacité de remodeler les génomes. Plus récemment, de nombreux travaux effectués ont appuyé l'idée énoncée par Barbara McClintock et ceci en caractérisant les ETs comme des générateurs potentiellement avantageux de la variation sur laquelle la sélection naturelle peut agir (Fedoroff 1999). En effet, la transposition est définie comme le mouvement d'un segment discret d'ADN d'un locus à un autre, entre fragments non homologues, au sein du génome qui les abrite. Les ETs ont été identifiés dans tous les organismes procaryotes et eucaryotes, occupent une grande proportion du génome des espèces. Par exemple, les éléments transposables représentent environ 10% du génome de plusieurs espèces de poissons, 12% du génome de C. elegans, 37% du génome de la souris, 45% du génome humain, 2% du génome d'E. coli et plus de 80% du génome de certaines plantes comme le maïs. De la bactérie à l'homme, les ETs se sont accumulés au fil du temps et continuent à remanier les génomes grâce à leur mobilisation. Lors de leurs insertions, ils peuvent inactiver ou moduler l'expression des gènes, ou même induire la recombinaison homologue. Certains ETs sont impliqués dans la mobilisation et la dissémination des

Figure 6 : Structure d'un intégron de résistance aux antibiotiques. (A) Plate-forme fonctionnelle de l'intégron:

gène intI codant l'intégrase; promoteur de l'intégrase PintI; Promoteur des cassettes de gène Pc; site de recombinaison spécifique attI. (B) Cassettes de résistance libres ou intégrées avec des sites de recombinaison attC

(A)

19 séquences qui y sont adjacentes, comme les séquences codantes pour la résistance aux antibiotiques ou pour les facteurs de virulence.

Chez les bactéries, les éléments transposables impliqués dans la résistance aux antibiotiques sont les suivants : les séquences d'insertion, les transposons composites ou les transposons non-composites, les transposons conjugatifs et les transposons mobilisables.

3.1) les séquences d'insertion

3.1.1) Généralités sur les séquences d’insertion

Les séquences d'insertion ou IS, sont les éléments transposables les plus simples et les plus abondants chez les procaryotes (ISFinder: https://www-is.biotoul.fr). Elles ont une organisation génétique compacte avec une taille inférieure à 2,5 kb, et codent pour une enzyme appelée la transposase dont la fonction est de conférer la mobilité à ces IS. En général, le gène de la transposase est encadré par deux séquences inversées répétées droite et gauche, IRR et IRL (pour Inverted Repeats Right et Left respectivement), de 10 à 40 pb, et qui servent de sites de reconnaissance et de coupure à la transposase. Ces IS qui ne codent que pour des fonctions nécessaires à leur mobilité sont appelées IS classiques. A ce jour, au moins 26 familles comportant plus de 4000 membres ont été répertoriées (Siguier, Gourbeyre et al. 2015). Les IS sont classées en familles en utilisant diverses caractéristiques (MAHILLON and CHANDLER 1998) (Tableau 1), qui incluent :

- La longueur et la séquence des extrémités inversées répétées.

- La longueur et la séquence des répétitions directes (DRs ou Direct repeats) souvent générées dans l'ADN cible lors de l'insertion.

- L'organisation des cadres ouverts de lecture.

- Les séquences cibles dans lesquelles se fait l'insertion des IS

Cependant, le principal facteur dans la classification des IS est la similarité des transposases au niveau de leurs séquences primaires.

Les différentes familles de transposase et les mécanismes de transposition correspondants seront détaillés ultérieurement.

L'implication remarquable des IS dans l'évolution et la plasticité des génomes ont fait l'objet de plusieurs études dans la littérature. Les IS peuvent s'insérer en amont d'un gène et activer son expression (Glansdorff, Charlier et al. 1981) selon deux manières principales : soit

20 via des promoteurs contenus entièrement dans l'IS ou par la formation des promoteurs hybrides suite à l'insertion. Les IS peuvent également incorporer des gènes additionnels, et ensuite agir comme vecteurs pour ces gènes. Cet aspect est surtout lié au phénomène de transfert de la virulence et de la résistance antibactérienne. Les IS classiques peuvent mobiliser un ou plusieurs gènes, tels que des gènes codant pour la résistance aux antibiotiques, à condition que deux copies d'IS identiques ou similaires encadrent ces gènes, formant ainsi un transposon (Tn) composite.

Dans la littérature, on trouve des exemples très variés sur la résistance aux antibiotiques médiée par les IS.

Les insertions des IS1 ou IS10 peuvent surréguler la pompe d'efflux AcrAB-TolC chez

Salmonella enterica (Olliver, Valle et al. 2005); l'insertion de l'IS1 ou IS2 en amont de AcrEF

et l'inactivation du répresseur AcrR par insertion de l'IS186 chez E. coli, conduisent tous à une résistance accrue aux fluoroquinolones (Jellen-Ritter and Kern 2001).

Récemment, un nouveau mécanisme de résistance aux carbapénèmes a été rapporté dans des souches cliniques de Pseudomonas aeruginosa, il est dû à la disruption du gène de la porine oprD par des IS variées telles que ISPa26 et ISPa46 (Wolter, Hanson et al. 2004; Evans and Segal 2007; Diene, L'Homme et al. 2013).

ISAba1, une séquence d'insertion largement répandue dans les souches d'Acinetobacter

baumannii, joue un rôle dans la surexpression des gènes blaAmpC et blaOXA-23 en fournissant

des séquences promotrices très fortes (Heritier, Poirel et al. 2006; Corvec, Poirel et al. 2007). Le génome des souches cliniques de Staphylococcus epidermidis comporte plusieurs copies de l'IS256 dont la présence est associée à la formation de biofilms et à la résistance aux aminosides (Kozitskaya, Cho et al. 2004).

21

Familles Sous-groupes Taille DR _(bp) Extrémités IRs Nb des ORF Frameshift Résidus catalytiques Mécanisme

IS1 - 740–1,180 8–9 GGnnnTG O 2 ORFAB DDE Copier-coller et

cointégrats

Un seul ORF 800–1,200 0–9 1

ISMhu11 900–4,600 0–10 O 2 ORFAB

IS1595 ISPna2 1,000–1,150 8 GGCnnTG O 1 DDNK Copier-coller ?

ISPna2+pass 1,500–2,600 8

ISH4 1,000 8 CGCTCTT 1 DDNK

IS1016 700–745 7–9 GGGgctg 1 DDEK

IS1595 900–1,100 8 CcTGATT 1 DDNK + ER4R7

ISSod11 1,000–1,100 8 nnnGcnTATC 1 DDHK + ER4R7

ISNwi1 1,080–1,200 8 ggnnatTAT 1 DDEK + ER4

ISNwi1+pass 1,750–4,750 8 1

ISNha5 3,450–7,900 8 CGGnnTT 1 DDER/K

IS3 IS150 1,200–1,600 3–4 TG O 2 ORFAB DDE Copier-coller

IS407 1,100–1,400 4 TG

IS51 1,000–1,400 3–4 TG

IS3 1,150–1,750 3–4 TGa/g

IS2 1,300–1,400 5 TG

IS481 - 950–1,300 4–15 TGT O 1 DDE Copier-coller ?

ISNCY IS1202 1,400–1,700 5 TGT O 1 DDEQ

IS4 IS10 1,200–1,350 9 CT O 1 DDE Couper-coller

IS50 1,350–1,550 8-9 C ISPepr1 1,500–1,600 7–8 -T-AA IS4 1,400–1,600 10–13 -AAT IS4Sa 1,150–1,750 8–10 CA ISH8 1,400–1,800 10 CAT IS231 1,450–5,400 10-12 CAT IS701 - 1,400–1,550 4 O 1 DDE ISAba11 O 1 DDE ISH3 - 1,225–1,500 4–5 C-GT O 1 DDE IS1634 - 1,500–2,000 5–6 C O 1 DDE

IS5 IS903 950–1,150 9 GG O 1 DDE

ISL2 850–1,200 2–3 1

ISH1 900–1,150 8 -GC 1

IS5 1,000–1,500 4 Ga/g 1

IS1031 850–1,050 3 GAa/g 1

IS427 800–1,000 2–4 Ga/g 2 ORFAB

IS1182 - 1,330–1,950 0–60 O 1 DDE

ISNCY ISDol1 1,600–1,900 6–7 O 1 DDE

IS6 - 700–900 8 GG O 1 DDE Cointégrats

IS21 - 1,750–2,600 4–8 TG O 2 * DDE

22

Abréviations : O = Oui ; N= Non ; DR = direct repeat (ou répétion directe) ; IR = inverted repeat (répétition inverse) ; ORF = open reading frame (cadre ouvert de lecture)

Familles Sous-groupes Taille DR

(bp) Extrémités IRs Nb des ORF Frameshift Résidus catalytiques Mécanisme

IS30 - 1,000–1,700 2–3 O 1 DDE Copier-coller

IS66 - 2,000–3,000 8–9 GTAA O 3 * DDE *

ISBst12 1,350–1,900 8–9 GTAA O 1 DDE

IS256 - 1,200–1,500 8–9 Ga/g O 1 DDE Copier-coller

IS1249 1,300 0–10 GG O 1 DDE

ISC1250 1,250 0–9 GG O 1 DDE

ISH6 - 1,450 8 GGT O 1 DDE

ISLre2 - 1,500–2,000 9 O 1 DDE

ISKra4 ISAzba1 1,400–2,900 0 O 1 ou + * DDE

ISMich2 1,250–1,400 8 GGG O 1 ou 2 ORFAB DDE

ISKra4 1,400–3,700 9 GGG O 1 ou + * DDE

IS630 - 1,000–1,400 2 * O 1 ou 2 ORFAB DDE Couper-coller

IS982 - 1 3–9 AC O 1 DDE IS1380 - 1,550–2,000 4–5 CC O 1 DDE ISAs1 - 1,200–1,500 8–10 CAGGG O 1 ISL3 - 1,300–2,300 8 GG O 1 Tn3 - >3,000 0 GGGG O >1 DDE cointégrats ISAzo13 - 1,250–2,200 0–4 Ga/g O 1 IS110 - 1,200–1,550 0 N 1 DEDD IS1111 O *

IS91 - 1,500–2,000 0 N 1 HUH/Y2 Cercle roulant

IS200/IS605 IS200 600–750 0 N 1 * HUH/Y1 «

peel-and-paste »

IS605 1,300–2,000 2 * HUH/Y1 **

IS1341 1,200–1,500 1 *

IS607 - 1,700–2,500 0 N 2 * Sérine **

ISNCY IS892 1,600 0–8 CTAG O 2 ORFAB

ISLbi1 1,400–1,500 5 O 1 ISMae2 1,400–2,400 9 CAG O 1 ISPlu15 800–1,000 0 N 1 ISA1214 1,000–1,200 8–12 O 2 ISC1217 1,200 6–8 TAG O 1 ISM1 1,300–1,600 8–9 O 1

23 3.1.2) Cas particulier des ISEcp1, ISCRs et des éléments de la famille IS91

Il a été décrit que la mobilisation des gènes de virulence ou de résistance aux antibiotiques par les IS classiques nécessite la collaboration entre deux copies d'une même IS qui encadrent ces gènes et forment ainsi un transposon composite (dont les caractéristiques sont développées dans le paragraphe 3.2 de ce chapitre). Cependant, il existe des IS qui sont capables de capturer et de mobiliser des gènes avec une seule copie (Partridge 2011; Toleman and Walsh 2011). C'est le cas des éléments ISEcp1, ISCR et IS91. Les ISEcp1 et ISCRs sont fréquemment rencontrées dans la mobilisation très efficace des gènes de résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries. L'ISCR a été caractérisée comme le nouveau système de capture des gènes au cours du 21ème siècle (Toleman, Bennett et al. 2006).

3.1.2.1) Eléments ISEcp1

La séquence d'insertion ISEcp1 a fréquemment été identifiée en amont des gènes blaCTX-M (blaCTX-M-1, blaCTX-M-2, blaCTX-M-3, blaCTX-M-9, blaCTX-M-13, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15,

blaCTX-M-17, blaCTX-M-19, blaCTX-M-20 et blaCTX-M-21) (Bonnet 2004). Cette séquence est capable de

mobiliser ces gènes mais également de favoriser leur expression à haut niveau en apportant un promoteur (Karim, Poirel et al. 2001; Poirel, Decousser et al. 2003; Poirel, Lartigue et al. 2005). L'ISEcp1 (1656 pb) appartient à la famille de l'IS1380 (Poirel, Lartigue et al. 2005; Poirel, Naas et al. 2008), elle est délimitée par deux extrémités inversées répétées imparfaites (IR) de 14 pb, et comprend une orf codant pour une transposase de 420 acides aminés (Lartigue, Poirel et al. 2004; Poirel, Lartigue et al. 2005). La mobilisation des gènes voisins par l'ISEcp1 se fait par un mécanisme de non-reconnaissance de l'extrémité IRR située en aval du gène de la transposase. La transposase reconnait donc une séquence légèrement ressemblante, désignée IRalt, située en aval de l'IRR; ainsi l'évènement de

transposition se produit par la combinaison entre cette IRalt et l'IRL qui est située en amont

du gène de la transposase (Partridge 2011). L'unité de transposition délimité par IRalt et IRL

est capable de générer des séquences répétées directes DR (de 5 pb) lors de son insertion dans l'ADN cible (Poirel, Naas et al. 2008; Partridge 2011).

Outre sa prédominance en amont des gènes blaCTX-M, l'ISEcp1 a aussi été retrouvée en