Effet de modifications dans l’extrémité oriIS

1.1) Etude du tétranucléotide adjacent à l’extrémité oriIS

Dans le chapitre précédent, nous avons montré que l'IS1294b était capable de transposer et de mobiliser les séquences adjacentes au terIS (Yassine, Bientz et al. 2015).

Cependant l’une des caractéristiques de l’IS1294b, est la présence à l'extrémité oriIS du tétranucléotide ^5'GTCC (ou ^3’CCTG^5’, sur la figure 40). L’IS1294 décrite et analysée par Tavakoli et al. (2000) présente la séquence ^5’GTTC. Les travaux de Mendiola et al. (1994) sur l'IS91 ont montré que les tétranucléotides ^5’GTTC ou ^5’CTTG adjacents à l’extrémité oriIS étaient absolument requis pour la transposition (leur délétion entraîne une perte de transposition). Les fréquences de transposition de l’IS91 utilisant le plasmide conjugatif receveur R388, avec ^5’GTTC (plasmide donneur pSU234, de type pACYC184) ou ^5’CTTG (plasmide donneur pSU240, de type pBR322) ne montrent pas de différence significative de la fréquence de transposition : 1,1 x 10^-6 et 5 x 10^-6, respectivement (Mendiola, Bernales et al. 1994).

Delgado et al. (2005) ont identifié une IS1294 avec le tétranucléotide ^5’CTCG (GenBank # AJ008006). Ces auteurs indiquent que ce tétranucléotide n’a jamais été rapporté dans la

Figure 40 : Représentation schématique de l'IS1294b.

Le gène de la transposase (tnpA) est indiqué par la flèche rose indiquant le sens de sa transcription. Les séquences terIS et oriIS sont montrées respectivement en vert et bleu. Les flèches verticales indiquent les sites de clivage reconnus par la transposase TnpA au niveau des extrémités oriIS et terIS.

Le brin 5’3’ (brin du haut ou ‘’Top’’) est le brin portant l’ATG initiateur du gène tnpA. Le brin clivé par la TnpA est le brin 3’_{5’ (ou brin ‘’Bottom’’).}

84 littérature, et montrent que l’IS était fonctionnelle dans un test utilisant l’inactivation du gène sacB, mais sans préciser l’efficacité de transposition (Delgado and Salomon 2005). Devant ces résultats contradictoires, et pour vérifier si la nature du tétranucléotide présent au niveau de l’oriIS avait une influence sur l'efficacité de transposition, une étude a été entreprise au cours de ce travail.

1.1.1) Influence des tétranucléotides ^5'GTCC, ^5'GTTC, et ^5'CTTG adjacents à l’oriIS sur l’efficacité de transposition in vivo

Dans un premier temps, l'IS1294b a été amplifiée par PCR avec une polymérase haute fidélité en utilisant des amorces qui modifient le tétranucléotide flanquant l'oriIS. Après insertion de l’IS1294b sauvage ou modifiée dans le multi-site de clonage du vecteur pGEMT-easy (plasmide avec une origine de réplication dérivée des pUCs, pBM1*, voir chapitre VI) et transformation de la bactérie E. coli SM10, trois plasmides recombinants ont été obtenus : pGIS2 (IS1294b avec le tétranucléotide natif, ^5’GTCC), pGIS3 (^5’GTTC) et pGIS4 (^5’CTTG). Les IS ont été entièrement séquencées pour vérifier l’absence d’erreur de la polymérase. Les IS ont toutes été insérées dans le même sens, c'est-à-dire le gène de la transposase (brin 5’3’ contenant l’ATG initiateur) était orienté dans le sens contraire de l’origine de réplication du plasmide pGEMT-easy (voir Chapitre VI).

Les plasmides recombinants pGIS2, pGIS3, pGIS4 (plasmides résistants à l’ampicilline) ont été introduits par transformation dans la souche d’E. coli SM10 contenant le plasmide receveur pEX19Gm (résistance à la gentamicine et porteur du gène cible sacB). Les expériences de transposition ont été réalisées comme précédemment décrites (chapitre IV). Au moins quatre expériences indépendantes ont été effectuées pour déterminer la fréquence moyenne de transposition. A chaque expérience, dix UFC prises au hasard ont été contrôlées par PCR (amorces oriIS-131/SacBR1, voir figure 38, chapitre IV).

Nos résultats indiquent qu’en utilisant le plasmide pGIS3, rebaptisé pGIS3_ref, l’IS1294b avec le tétranucléotide ^5'GTTC adjacent à l’oriIS, permet d’obtenir la transposition la plus efficace, avec une fréquence moyenne égale à 3,8 x 10^-2 (écart type = 1,7 x 10^-2).

En considérant cette fréquence comme 100% (référence), la valeur moyenne de transposition observée avec le tétranucléotide natif ^5'GTCC (0,9 x 10^-3) n’est que de 2,4%, soit 42 fois moins que celle de l’IS avec ^5’GTTC. Le pGIS2 a donné une fréquence de l’ordre de 10^-4, similaire à celle obtenue précédemment avec le pKB2735SE (plasmide avec une origine

85 de réplication similaire à celle du pGEMT-easy, voir Chapitre IV). Ces deux plasmides donneurs portent l’IS1294b avec le même tétranucléotide, ^5'GTCC.

La fréquence générée avec le tétranucléotide ^5'CTTG (3,2 x 10^-4) est de 0,84% comparée à la valeur de référence (soit 119 fois plus faible). Ainsi, contrairement aux travaux de Mendiola

et al. (1994) (voir ci-dessus), le tétranucléotide ^5'CTTG associé à l’IS1294b génère des efficacités de transposition plus faibles qu’avec ^5'GTTC.

La spécificité d’insertion dans le site cible ne semble être pas modifiée. En effet, bien qu’un séquençage de la borne oriIS/SacB (figure 38, chapitre IV) n’a pas été effectué, la taille des amplicons obtenue suggère ce résultat. Ces tailles semblent compatibles avec des insertions dans l’un des 10 sites du gène sacB, sans préférence entre les sites ^5’GTTC ou ^5’CTTG.

1.1.2) Mutations ponctuelles des tétranucléotides adjacents à l'extrémité oriIS Au vu des résultats précédents qui soulignent l'importance de la nature des 4 bases présentes à l'extrémité oriIS de l’IS1294b, nous avons voulu élargir cette étude en les modifiant d'une manière systématique par mutations ponctuelles. Toutes les constructions réalisées par la suite (tétranucléotides, oriIS, terIS…) sont contrôlées à chaque fois par séquençage pour s’assurer qu’aucune mutation, autre que la(les) mutation(s) désirée(s) n’a été introduite lors de la mutagénèse. La fonctionnalité de toutes les nouvelles constructions obtenues a été validée ( 3 expériences) à l'aide du test de transposition in vivo décrit précédemment. Le pourcentage de la fréquence moyenne de transposition obtenue pour chaque construction comparé à la valeur de référence (pGIS3_ref) est présenté dans le tableau 4.

Les résultats expérimentaux des 12 mutations ponctuelles introduites au niveau du tétranucléotide de l’oriIS, ont montré que la séquence ^5'GTTC est toujours celle qui permet la transposition la plus efficace. Quelque soit le changement, une diminution supérieure à 90% de la fréquence de transposition est toujours notée. Cependant, ces changements ne génèrent pas des efficacités de transposition similaires :

(i) au niveau de la 1^ère position, la mutation du C en A entraine une diminution de la fréquence de transposition de 98%. Cette efficacité de 2% est cependant du même ordre de grandeur que celle de 2,4% obtenue avec le tétranucléotide natif, ^5’GTCC. Le changement du

86 C en T a donné une fréquence de transposition de 0,8% ; cette réduction est comparable à celle obtenue pour le tétranucléotide ^5'CTTG (0,84%). Cependant, la présence du G en 1^ère position aboutit à une baisse très significative de l'activité de transposition (0,07%, diminution d’environ 3 logs). La présence de l’IS1294b dans le gène sacB a été validée en PCR.

(ii) la mutation de la base située en 2^ème position affecte la transposition d'une façon modérée (1,8 à 7,3%), surtout pour le changement ^5’GTTC → ^5’GTGC qui n’entraine qu’une baisse de 14 fois (7,3%).

Le numéro de la position (1^ère à 4^ième) de chaque mutation est donné par rapport au site de clivage représenté par une flèche verticale.

1

, La fréquence de transposition est donnée en pourcentage de fréquence de transposition généré par chaque mutation calculée par rapport à la valeur de référence 100% (3,8 x 10^-2, pGIS3_ref).

(iii) au contraire, le changement de la base T en 3^ème position par n’importe quelle autre base, a inhibé la transposition à des taux non détectables par notre test. Ce résultat, reproductible, a été obtenu soit par l'absence de croissance sur milieu avec saccharose ou par la négativité de la PCR effectuée sur toutes les colonies testées. Cette base T est donc critique pour le mécanisme de transposition de l’IS1294b. Dans la séquence consensus

Position après le site de coupure Tétranucléotide de l’oriIS % la fréquence de transposition¹ 5’ G T T C …A 100 (pGIS3_ref) 1^ère position G T T A 2 G T T T 0,8 G T T G 0,07 2^ième position G T A C 1,8 G T G C 7,3 G T C C 2,4 (pGIS2, IS1294b) 3^ième position G A T C <0,05 G G T C <0,1 G C T C <0,03 4^ième position A T T C 1,3 T T T C 4,2 C T T C 0,4

Tableau 4 : Etude de l'effet de mutations ponctuelles introduites au niveau du tétranucléotide de l'oriIS, sur l’efficacité de transposition

87 définie pour l’IS801, cette base T est également très conservée (voir chapitre précédent) (Richter, Bjorklof et al. 1998).

(iv) au niveau de la 4^ème position, l'effet de la mutation sur le mécanisme de transposition

in vivo, est variable. Il est beaucoup plus important (0,4%), dans le cas du changement ^5’G →C, et moins important dans le cas des autres modifications.

L’analyse de la taille des produits d’amplification oriIS-131/SacBR1 analysées (10 UFC à chaque expérience) semble indiquer que quelque soit le tétranucléotide inséré au niveau de l’oriIS, il n’y a pas de changement dans la spécificité d’insertion dans le site cible ; les insertions se sont effectuées aussi bien dans les sites ^5’GTTC ou ^5’CTTG du gène sacB.

1.2) Effet de mutations de l'extrémité oriIS

La séquence oriIS de l’IS1294b est composée de 171 nucléotides : A¹ à G¹⁷¹ (figure 41).

Dans le but d'identifier les nucléotides de l’extrémité oriIS située sur le plasmide pGIS3_ref qui seraient nécessaires au mécanisme de transposition in vivo, différentes modifications ont été réalisées. L'effet de toutes ces modifications sur l'activité de transposition a ensuite été analysé par le test de transposition in vivo précédemment décrit, et comparé au témoin, pGIS3_ref.

Figure 41 : Séquence nucléotidique de l'oriIS.Le tétranucléotide ^5'GTTC est coloré en bleu. La séquence commence par une adénine (chiffre 1, A¹) située après le site de coupure et se termine au nucléotide G¹⁷¹, situé juste après le codon stop du gène tnpA. Une séquence inverse répétée est soulignée. Elle correspond à une potentielle structure tige boucle, signalée par Tavakoli et al. (2000).

5’

88 1.2.1) Alignement de séquences des extrémités oriIS des IS1294 et IS91-like

Des données des alignements des 90 premières bases de l’oriIS de différentes oriIS1294 retrouvées dans les banques de gènes (GenBank) ont révélé la conservation importante de cette séquence, sauf aux positions 22, 24, 25, 33, 40, 60 et 67 et 87. Une délétion ou insertion de la base 75 (cytosine) peut être présente chez certaines IS1294 (figure 42).

Figure 42 : Alignements de séquences des 90 premières bases de l’oriIS des IS1294.

N° accession Genbank : IS1294b (Kp017243) ; 2, Delgado et al., 2005 (NG_035642.1) ; 3, Tavakoli et al., 2000 (X82430.1); 4, GenBank # NC_019197 ; 5, GQ167042 ; 6, EU704128 ; 7, KF537631 ; 8, NG_041523 ; 9, CP000039 ; 10 et 11, AF386526

Des alignements de séquences avec d’autres membres de la famille des IS91-like, montrent la présence de la séquence consensus AnnnATAGGAAnTTnAA au niveau de l’oriIS (figure 43). Une conservation de ces nucléotides a également été retrouvée à l’extrémité des ISCRs (Toleman, Bennett et al. 2006; Toleman, Bennett et al. 2006).

89 1.2.2) Modifications dans la séquence oriIS

1.2.2.1) Délétions au niveau des 87 bases situées après le site de coupure Mendolia et al. ont montré que la séquence terminale de 82 pb (bases 1 à 82) à l’oriIS de l’IS91 était absolument indispensable au mécanisme de transposition (Mendiola, Bernales et al. 1994).

Des délétions () au niveau des 87 premières bases de l’oriIS ont été effectuées : 2 bases (2-3 ; 4-5 ; 7-8 ; 13-14), 13 bases (2-14 et 74-87), 17 bases (39-56); 33 bases ( 28-60), et 58 bases (15-72). Toutes ces délétions ne permettent pas de détecter de transposition (fréquences <10^-6).

Une délétion de 12 bases de la position 75 à 87 (75-87) a permis d’observer une fréquence de 1,2 x 10^-4 (0,4%) alors que la délétion _{74-87 génère une fréquence <10}-6

(voir ci-dessus). Tavakoli et al. (2000) suggèrent que la séquence de 76-87 (séquence inverse répétée CCACxxxxxGTGG, figure 41) pourrait être un éventuel terminateur de transcription du gène

tnpA. Nos résultats permettent de conclure que cette séquence est importante puisque sa

délétion génère une diminution de 316 fois par rapport à l’IS1294b de référence, mais elle n’abolit pas le mécanisme de transposition in vivo de l’IS1294b, à un seuil non détectable comme les délétions précédentes.

1.2.2.2) Mutations ponctuelles dans l’oriIS o Mutations ponctuelles des bases 73 à 75

Les changements C⁷³ (en A, T, G), C⁷⁴ (en A, T, G) et T⁷⁵ (en A, G ou C) montrent des efficacités de transposition comprises entre 9 et 15% comparées à celle du pGIS3_ref. Si la délétion 74-87 est critique pour le mécanisme de transposition comparée à 75-87, il est difficile de l’expliquer par la simple modification des bases 73 à 75.

o Mutations ponctuelles des bases 1 à 25

Nous avons voulu évaluer l’importance de mutations ponctuelles dans les bases situées après le site de coupure. La figure 44 montre les % des fréquences de transposition comparés à celle de l’IS1294 dans le plasmide de référence pGIS3_ref.

90 La première modification introduite au niveau de l'oriIS a été de changer l’adénine localisée après le site de coupure, en position 1 (A¹) (figure 40). Nos résultats ont montré que la mutation en cytosine (A¹C) abolissait complètement l'activité de transposition (<0,01%, réduction d’au moins 4 log) ; le remplacement par une thymine (T) ou guanine (G) entrainait aussi une baisse significative (0,24 et 0,26%, respectivement); confirmant l'importance de cette base dans le mécanisme de transposition de l'IS1294b. Il a été rapporté que le site de clivage au niveau de l'extrémité oriIS de l’IS91 (Mendiola, Bernales et al. 1994) comporte la séquence conservée ^5'GTTC/AT ou ^5'CTTG/AT similaire à celles d’autres protéines de la famille HUH, comme celle du phage x174 (Mendiola, Bernales et al. 1994).

Pour l’IS1294, cette séquence est ^5’GTTC/AC. Le changement du C² T, G ou A n’est pas critique (1,2 à 2,2%, selon la base changée), au contraire du changement de la troisième position (Figure 44).

Ainsi, bien que tous les changements envisagés de 1 à 25, ne soient pas encore obtenus et/ou analysés, ils tendent clairement à montrer la présence de résidus critiques dans la séquence de 1 à 14 : positions 1, 3, 6, 7, 8, 10 et 14 (notés en rouge sur la figure 44) :

A¹→ C ; G³ → A/C/T ; T⁶ → C/G ; A⁷ → G/T (C, non déterminé) ; G⁸ → T ; A¹⁰ → T/C ; T¹⁴→G. Ce résultat pourrait suggérer la liaison de la transposase via des interactions plus spécifiques au niveau de ces 7 nucléotides (A¹, G³, T⁶, A⁷, G⁸, A¹⁰ et T¹⁴), pour lesquels au moins un seul changement de base a un effet très délétère sur l'activité de transposition.

Figure 44 : Fréquences de transposition des mutants ponctuels introduits dans la séquence oriIS (bases 1 à 25). Les fréquences de transposition sont exprimées en pourcentage par rapport à la valeur de référence 3,8 x 10-2

obtenue avec le plasmide pGIS3_ref. La séquence de référence est indiquée au-dessus de la table. Les nucléotides critiques sont représentés en rouge. ND, non déterminé.

91 o Autre mutation ponctuelle

Comme nous l’avons vu précédemment avec les alignements de séquences (figure 42), certaines positions de la région oriIS ne sont pas conservées. Nous avons confirmé que le changement C⁶⁷T n’affecte que modérément l’efficacité de transposition (1,8 %).

Ce travail est la première étude où des mutations ponctuelles systématiques ont été réalisées au niveau de l’oriIS des IS91-like. Cette analyse est un préliminaire important pour de futures études in vitro à l’aide d’une TnpA purifiée (voir Conclusions-Perspectives).