Identification de l’IS1294b et étude de son rôle dans la mobilisation du gène
2) Analyse de l'environnement génétique du gène bla CMY-2
Après extraction de p2735 à partir du transconjugant Tc2735 et double digestion par les enzymes Sal1 et EcoR1, un fragment contenant le gène blaCMY-2, a été inséré dans le plasmide pBK-CMV, générant le plasmide recombinant pBK2735SE. L’insert Sal1-EcoR1 de 9,466 kb a été séquencé (GenBank # Kp017243). Cet insert présentait 99,9% d'homologie avec la région correspondante d’un fragment de 10,669 kb (GenBank # FM246883) trouvé dans la souche d’E. coli TN38148 isolée en 2004 d’un patient d’un hôpital parisien (Verdet,
p2735
Figure 36 : Analyse par PFGE-S1 nucléase du contenu plasmidique de la souche Kp2735 et son transconjugant. Piste 1, Kp2735 ; Piste 2, Tc273 ; Piste 3, Marqueur de taille (les valeurs sont indiquées en kb)
73 Gautier et al. 2009). Comme on peut le constater sur la figure 37D, le gène blaCMY-2 a été encadré en amont, par un élément ISEcp1 tronqué (laissant un fragment de 372 pb) et en aval, par des gènes codant pour une lipoprotéine de la membrane externe (blc), une protéine d'efflux d'ammonium quaternaire (sugE) et l'extrémité 5' de l'entéricidine R (∆ecnR). Cette région (blaCMY-2-blc-sugE-ecnR) de 2823 pb présente une forte homologie
avec le chromosome de Citrobacter freundii et a probablement été mobilisée du génome de cette bactérie progénitrice par l’ISEcp1 avant son inactivation, comme cela a été suggéré dans la littérature (Verdet, Gautier et al. 2009; Partridge 2011; Tagg, Iredell et al. 2014). En effet, un tel transfert médié par l’ISEcp1 a été démontré expérimentalement pour la mobilisation du gène de la -lactamase à spectre étendu, blaCTX-M-2 à partir du chromosome de la bactérie de l’environnement, Kluyvera ascorbata (Lartigue, Poirel et al. 2006). Par ailleurs, l’extrémité droite IRR-like (ou IRalt) de l’ISEcp1 a été retrouvée dans le gène ecnR ;
elle contient une séquence répétée directe, ATTTC, habituellement retrouvée aux bornes de cet élément (figure 37A) (Tagg, Iredell et al. 2014) . Une séquence de 1395 pb correspondant à une partie de l'orf1 (gène de fonction inconnue) a été retrouvée en aval du gène ecnR
(figure 37D). Cette séquence appartient au "backbone" (partie constante) des plasmides de groupe d’incompatibilité IncA/C, comme indiqué par les résultats d'alignement des séquences (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (données non montrées). Sur le plasmide p2735,
orf1 était suivie par les gènes yafA (tronqué en 3') et yafB. Les séquences yafA et yafB,
ainsi que le gène de la réplication repIncI1 (localisé en amont du gène blaCMY-2) présentaient une forte homologie avec le "backbone" des plasmides de type IncI1 (figure 37C). En outre, le plasmide p2735 présentait en amont de l’ISEcp1 tronquée, une IS1294-like (1713 bp) qui présentait 95,0% d’identité de séquence avec celle décrite par Tavakoli et al. (2000) (GenBank # X82430.1). Cette séquence, renommée IS1294b, code pour une transposase de 402 acides aminés.
3) Hypothèse de la formation du plasmide p2735 via le mécanisme "one-ended transposition" médié par IS1294b
Comme l'IS1294b a été retrouvée en amont du gène blaCMY-2, une explication possible à la formation de p2735 (plasmide de type IncI1) pourrait être proposée. Selon cette hypothèse, p2735 résulterait de la mobilisation avec une extrémité (ou "one-ended transposition") médiée par l’IS1294b d’une séquence de 6303 pb provenant d’un plasmide IncA/C. Après
74 insertion de l’IS1294b dans l’ISEcp1 (figure 37B), la mobilisation aurait débuté depuis la séquence oriIS de l’IS1294b jusqu’à une séquence ter2 (5’GTTC) localisée dans le gène orf1 (figure 37D). La séquence ainsi mobilisée se serait insérée au niveau d’un site 5’GTCC situé sur un plasmide de type IncI1. Ainsi, l'IS1294b serait impliquée dans la mobilisation du gène
blaCMY-2 et les gènes adjacents (IS1294b-ISEcp1-blaCMY-2-blc-sugE-ecnR-orf1) d'un
plasmide IncA/C vers un plasmide IncI1 générant le plasmide conjugatif correspondant, p2735.
(A) Backbone IncA/C
(B) Plasmide IncA/C avec insertion de l'IS1294b
(C) Backbone IncI1 (D) p2735 blaCMY-2 sug E ISEcp1 orf1 traB traA blc IS1294b ter2 One-ended transposition yafA yafB repIncI1 repY-Z GTTC 5’ GTCC oriIS terIS Sal1 EcoRI ecn R 6,303 bp 1,395 bp ATTTC
Figure 37 : Hypothèse de la formation du plasmide p2735 (A-D). La zone mauve représente le chromosome de C.
freundii mobilisé par ISEcp1, avec la séquence répétée directe (DR : ATTTC) désignée par un triangle gris. La zone verte
représente le ‘’backbone’’ IncA/C. La zone jaune montre le ‘’backbone’’ IncI1. L'IS1294b est représentée par un rectangle rose encadré par oriIS (petit rectangle bleu foncé) et terIS (petit rectangle vert foncé). Les tétranucléotides flanquant sont aussi montrés, GTCC au niveau de l'oriIS et GTTC au niveau du terIS. L'extrémité ter2 flanquée par GTTC est également indiquée. Les flèches verticales indiquent les sites de clivage de la transposase de l'IS1294b. La taille du segment mobilisé de l'oriIS jusqu'au ter2 et la taille du ‘’backbone’’ IncA/C à partir de la séquence DR de l'ISEcp1 jusqu'au ter2, sont indiquées. Les flèches rouges indiquent les positions des amorces sens P1 et P2 utilisées pour vérifier par PCR, les insertions dans le gène sacB.
GTTC
ter2
P1 P2
Cadre ouvert de lecture
75 4) Analyse de la fréquence de transposition de l'IS1294b insérée dans le plasmide pBK2735SE
Pour argumenter l’hypothèse précédente, nous avons voulu vérifier expérimentalement la mobilisation du gène blaCMY-2. L'IS1294b localisée sur pBK2735SE présentait le tétranucléotide 5'GTCC adjacent à l'extrémité oriIS, dont l’efficacité sur la transposition n’a jamais été décrite dans la littérature. Ainsi dans un premier temps, nous avons voulu vérifier la fonctionnalité de l'IS1294b par un test de transposition in vivo chez la bactérie E. coli.
4.1) Mise au point du test de transposition basé sur l’utilisation du marqueur de sélection positif, sacB
Le plasmide donneur pBK2735SE (résistance à la ceftazidime) contenant l’IS1294b a été utilisé pour transformer la souche d’E. coli SM10 (recA-) contenant le plasmide receveur, pEX19Gm (cible sacB et résistance à la gentamicine). S’il y a transposition, l’IS1294b va s’insérer dans le gène sacB et inactiver ce gène qui code pour une lévansucrase, enzyme toxique si les bactéries sont cultivées sur un milieu contenant 5 à 10 % de saccharose. Après transformation, la fréquence de transposition est calculée comme le rapport du nombre d’UFC cultivant sur saccharose sur le nombre total d’UFC.
Conditions initiales utilisées pour le test de transposition
Après transformation avec le plasmide pBK2735SE, les colonies d’E. coli SM10 contenant les deux plasmides obtenues sur une gélose LB additionnée de ceftazidime et gentamicine ont été congelées à -80°C. Après remise en culture en milieu liquide LB (ceftazidime et gentamicine), à 37°C avec agitation jusqu’à une DO600 nm de 0,9 (fin de la phase exponentielle), les cultures ont été étalées (après dilution) sur milieu solide contenant de la gentamicine avec ou sans saccharose. Pour tester la reproductibilité, six expériences indépendantes ont été effectuées et ont permis d’obtenir une fréquence moyenne de 3,8 x 10-4 (écart type, 1,2 x 10-4). La numération d’UFC n’est pas une donnée précise. Ainsi, nous avons considéré les expériences comme reproductibles lorsque l’écart entre la valeur la plus basse et la plus haute était inférieure à 1 log.
Ces tests ont donc montré que l'IS1294b localisée sur le plasmide pBK2735SE, était fonctionnelle avec la fréquence de transposition de l’ordre de 10-4.
76 4.2) Vérification de l’insertion de l’IS1294b dans le gène sacB
Dans la littérature, deux cibles privilégiées, 5’CTTG and 5’GTTC, ont été reportées pour l’IS91 (Bernales, Mendiola et al. 1999). Le gène cible sacB de 1,4 kpb (GenBank # AF047518) possède 10 sites d’insertion potentiels : 6 sites 5’GTTC et 4 sites 5’CTTG (figure 38A). A chaque expérience de transposition, dix UFC prises au hasard sur le milieu contenant du saccharose ont été testées en amplification par PCR, utilisant une amorce divergente dans l’extrémité oriIS (oriIS-131, 131 pb jusqu’au site de coupure) et une amorce sur le gène sacB (sacBR1 ou sacBF1, située aux extrémités du gène sacB). Cette vérification est d’autant plus utile que les fréquences de transposition sont proches de 10-6 - 10-7, valeurs proches du taux de mutation élevé du gène sacB. Ces valeurs de mutation sont obtenues en utilisant un plasmide donneur sans l’IS1294, et sont contrôlées à chaque nouveau lot préparé de cellules compétentes d’E. coli SM10 contenant le plasmide pEX19Gm.
Un exemple de résultats est montré sur la figure 38B.
Ces vérifications, ainsi que les données du séquençage des amplicons, nous ont permis de montrer que :
i) Comme rapporté dans la littérature, nous avons confirmé qu’il n’y a pas génération des séquences répétées directes lors de l’insertion. Le tétranucléotide au niveau de l'extrémité
oriIS n'est pas déplacé au cours de la transposition de l'IS1294b, mais il est restauré lors de
l'intégration en 3’ du gène cible. Le tétranucléotide flanquant l'extrémité terIS est lui conservé après intégration.
ii) Les différents événements de transposition dans le gène sacB ont montré que l’IS1294b s’intègre en 3’ d’une séquence 5’CTTG ou 5'GTTC. Sur 10 amplicons séquencés lors d’une même expérience : 6 étaient dans un site 5'GTTC et 4 dans un site 5’CTTG. Bien qu’une étude statistique n’a pas été réalisée vu le faible échantillonnage, ces résultats tendent fortement à démontrer qu’aucun site 5'GTTC ou 5’CTTG n’a été privilégié, dans les conditions de nos expériences.
77
B
Figure 38 : Représentation schématique de l’insertion de l’IS1294b dans le gène sacB et exemple de résultats obtenus après amplification par PCR.
A. Le gène sacB est représenté par la flèche horizontale en marron ; l’orientation indiquant le sens de sa
transcription. Les petites flèches verticales marron et bleue claire montrent la position des sites 5’GTTC et
5’
CTTG, respectivement. Le chiffre indiqué en dessous mentionne la position de la base située juste avant le site de coupure par rapport à l’ATG initiateur du gène sacB. Les petites flèches bleues montrent la position des amorces utilisées pour l’amplification par PCR.
B. Résultats obtenus après électrophorèse en gel d’agarose de l’amplification par PCR de l’ADN de 10 UFC
prises au hasard (pistes 1 à 10) utilisant les amorces oriIS-131 et SacBR1. Les tailles peuvent s’échelonner de 327 pb (site n° 1: 196pb + 131 pb) à 1524 pb (site n°10 : 1393 pb + 131 pb). M, marqueur de taille
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pb 1500 – 1000 – 750 – 500 – 250 –
78 Tavakoli et al. (Tavakoli, Comanducci et al. 2000) ont rapporté que l’IS1294 présentait une préférence d’insertion pour le site 5’CTTG (7 sites d’insertion analysés). Mendiola et al. (Mendiola, Jubete et al. 1992; Mendiola, Bernales et al. 1994) ont montré que l’IS91 cible les séquences 5’CTTG que 5'GTTC, de façon équimolaire. L’IS801 présente une stringence encore plus faible pour ses sites d’insertion. Richter et al. (1998) ont répertorié 13 séquences dont 5 (5’GTTC), 4 (5’CTTG) et également des sites similaires : 2 (5’GTCC) et 2 (5’CTCG). Une séquence consensus pour l’IS801 a été définie, comme suivant :
5’G TC T
5’C CG
iii) Dans les conditions de nos expérience, l'insertion de l'IS1294b s'est toujours effectuée sur le brin d'ADN 5'→3' du gène sacB.
4.3) Variations des conditions du test de transposition
Afin de déterminer les meilleures conditions de transposition, les expériences ont été renouvelées avec des cultures ayant une DO600 nm de 0,5 (milieu de la phase exponentielle). La fréquence de transposition était similaire (4,0 x 10-4, écart type, 0,9 x 10-4). Des tests ont aussi été effectués avec des bactéries ayant des temps de génération différents. En effet, à partir d’une culture ayant une D0 de 0,9, des dilutions ont été réalisées et cultivées à 37°C sous agitation, jusqu’à elles atteignent une DO de 0,9. En prenant un temps de doublement en milieu LB de 20 min (Sezonov, Joseleau-Petit et al. 2007), les temps étudiés correspondaient à 13 et 35 générations, respectivement. Les résultats ont montré des fréquences de transposition du même ordre de grandeur (tableau 2). A partir d’un même lot de culture de départ, incubé soit à une température de 37°C ou soit 40°C, aucune variation des fréquences de transposition n’a été observée (tableau 2). Ces tests ont été effectués avec une autre souche d’E. coli (HPS-1, recA-). Des fréquences de transposition similaires ont été obtenues (résultats non montrés).
Toutes les modifications testées n’ont pas permis d’améliorer l’efficacité de transposition. Pour la suite des expériences (chapitres V à VII), ce test sera effectué selon les conditions initiales.
79 Fréquence de la transposition Ecart-type
Temps de génération : 13 3,3 (2,3 - 4,0) x 10-4 9,1 x 10-5 35 7,6 (5,2-10,6) x 10-4 2,7 x 10-4 Température : 37°C 1,2 (1,1-1,4) x 10-4 1,5 x 10-5 40°C 1,3 (1,3-1,3) x 10-4 0
5) Analyse de la mobilisation du gène blaCMY-2 par le mécanisme de "one-ended transposition"
Les expériences de "one-ended transposition" ont été également réalisées avec la stratégie d'inactivation du gène sacB par insertion de l'IS1294b (Figure 39). Etant donné que la transposition par le mécanisme du cercle roulant est un mécanisme réplicatif (l’IS1294b est présente à la fois sur le plasmide donneur et le plasmide receveur), une étape de conjugaison bactérienne à la souche d'E. coli K12 (Nal-R Rif-R) a été rajoutée pour sélectionner les transconjugants qui ont acquis le plasmide receveur de l'IS1294b (pEX19Gm portant le gène cible sacB), dans lequel il y a eu mobilisation du gène blaCMY-2. En effet, le plasmide pEX19Gm est un plasmide contenant une origine de transfert (oriT). La souche d’E.
coli SM10 possède dans son génome une partie du plasmide conjugatif RP4, capable de
mobiliser en trans le plasmide mobilisable, pEX19Gm.
Tableau 2 : Fréquence de transpostion en fonction du temps de génération et de la température.
Les résultats de fréquence de transposition montrés en gras résultent de la moyenne de 3 expériences indépendantes (n=3). Les chiffres entre parenthèses représentent l’écart entre les valeurs obtenues (valeur inférieure et valeur supérieure).
80 Ainsi, la fréquence de "one-ended transposition" a été calculée en divisant le nombre d’UFC (transconjugants NalR-RifR, résistants à la gentamicine) cultivant sur saccharose et ceftazidime par le nombre d’UFC poussant sur saccharose.
Les résultats de cinq expériences indépendantes ont montré que l'IS1294b était capable de mobiliser le gène blaCMY-2 avec une fréquence allant de 1,7 % à 14,0 % (Tableau 3). Des amplifications par PCR ont été réalisées sur un certain nombre de transconjugants poussant sur saccharose et ceftazidime, et ceci en utilisant des amorces sens localisées après le gène
blaCMY-2 (P1 ou P2, voir figure 37D) avec une amorce anti-sens localisée dans le gène sacB. Les analyses par séquençage de cinq transconjugants donnant des produits de PCR de tailles différentes, ont montré la présence de l'IS1294b-blaCMY-2 dans différents sites du gène sacB. Les segments mobilisés par IS1294b avaient des tailles allant de 4628 à 7978 pb, et l'arrêt de la transposition s'est toujours effectué au niveau de tétranucléotide 5’GTTC ou 5’CTTG. Le
Figure 39 : Représentation schématique du test de transposition in vivo. La bactérie donatrice E. coli SM10, représentée en bleu foncé, contient d’une part le plasmide mobilisable pEX19Gm portant le gène sacB (en bleu) et le gène de résistance à la gentamicine (en orange) et d’autre part le plasmide pBK2735SE contenant l’IS1294b (en rose) et le gène blaCMY-2 (en mauve). La transposition de l’IS1294b peut s’effectuer à différents sites et en particulier dans le gène sacB. L’insertion de l’IS1294b dans le gène sacB inactive la levansucrase, la bactérie peut donc pousser en présence de saccharose. La transposition peut être «classique», c’est à dire, qu’il y a eu uniquement la transposition de l’IS1294b (A) ; ou se faire selon le mécanisme «one-ended transposition» ayant mobilisé le gène blaCMY-2 (B). Cette mobilisation du gène blaCMY-2 peut être plus facilement détectée après avoir réalisé des expériences de conjugaison, utilisant la bactérie réceptrice E. coli K12 résistante à l’acide nalidixique et à la rifampicine (C).
81
ter2 théorique retrouvé au niveau du gène orf1, et qui correspondait à une mobilisation de
6303 pb à partir de l'oriIS (figure 37D), a été identifié dans un des clones testés (clone 3) (Tableau 3).
Ces pourcentages de ‘’one-ended transposition" (1,7% à 14%) sont similaires à ceux qui ont été obtenus par Tavakoli et al. pour la mobilisation du gène de résistance à la kanamycine (fréquence variant entre 1 et 10%). Ces auteurs ont montré une mobilisation de fragments plus larges que 10 kb, c'est-à-dire plus grands que la forme linéaire du plasmide donneur (pUB2380) qui était de 8,5 kb (Tavakoli, Comanducci et al. 2000). Pour l’IS91, il a été évalué que les événements de transposition simple s’effectuaient à 87%, et que des fusions de plasmides ou des co-intégrats que les auteurs supposent être de résultats d’une "one-ended transposition" étaient de l’ordre de 13% (Bernales, Mendiola et al. 1999).
Ainsi au cours de cette étude, nous avons montré expérimentalement que l’IS1294b était capable de mobiliser le gène blaCMY-2 d'un plasmide à un autre, via le mécanisme de "one-ended transposition". Nos données argumentent fortement l’hypothèse de l'implication de l'IS1294b dans la formation d'un plasmide IncI1 (p2735), à partir d’un plasmide de type IncA/C. Notre étude constitue une première description expérimentale de la mobilisation d'un gène d’une ß-lactamase par un élément appartenant à la famille des IS91. Une partie de ce travail a été publiée dans le Journal of Antimicrobial Chemotherapy (Yassine, Bientz et al. 2015).
82
La flèche verticale indique le site de clivage. Le site d'insertion dans sacB (numéro d'accession AF047518) est numéroté à partir du codon initiateur. CAZ, ceftazidime.
enolC
Longueur des séquences mobilisées (pb) à partir de l’oriIS
Séquence au niveau du site de jonction
Site d’insertion site dans sacB
Séquence et site de clivage dans sacB
Fréquence de transposition sans CAZ avec CAZ
1 4628 GTTCA, stop dans ecnR 693 GTTCA 5,8×10−4 1,0×10−5
2 5990 CTTGG, stop dans orf1 693 GTTCA 4,0×10−4 2,7×10−5
3 6303 GTTCT, stop à ter2 1393 CTTGA 3,7×10−4 1,5×10−5
4 6937 GTTCA, stop dans yafB 497 GTTCA 6,8×10−4 2,3×10−5
5 7978 CTTGA, stop après yafB 372 GTTCT 4,5×10−4 6,3×10−5
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