Les transposases à motif catalytique DDE

1.1) Variété des éléments utilisant une transposase à motif catalytique DDE

Les transposases à motif catalytique DDE sont caractérisées par la présence de deux résidus acide aspartique (D) et un résidu acide glutamique (E) dans le cœur catalytique. Elles constituent la classe la plus abondante chez les organismes procaryotes et eucaryotes, et catalysent les réactions de clivage et transfert de brin d'ADN nécessaires à la transposition sans former une liaison covalente à leur substrat. La majorité des IS classiques, les transposons unitaires, les transposons composites et les bactériophages transposables utilisent des transposases à motif DDE. Les IS classiques les plus dominantes chez les espèces bactériennes appartiennent à la famille IS3. Les membres de cette famille diffèrent significativement au niveau de leurs séquences nucléotidiques, par contre leurs transposases putatives présentent une haute conservation du motif DDE. Le transposon unitaire le plus connu est le Tn7 dont la transposase TnsB appartient à la famille des transposases à DDE. Les transposons composites Tn5 et Tn10 ainsi que le bactériophage Mu sont aussi des exemples

32 très connus des éléments transposables bactériens possédant des transposases avec une triade catalytique DDE.

Chez les eucaryotes, les éléments transposables utilisant des transposases DDE sont aussi très variés; les plus répandus sont ceux appartenant à la famille Tc/mariner (Plasterk, Izsvak et al. 1999).

Les rétrotransposons à LTR (Long Terminal Repeat), apparentés aux rétrovirus, codent au moins deux gènes: gag et pol. Le gène gag code une protéine de structure de la capside, et le gène pol comprend trois activités enzymatiques distinctes parmi lesquelles celle codant pour une transposase DDE, plus communément connue sous le nom de l'intégrase (Curcio and Derbyshire 2003).

1.2) Mécanisme de catalyse

Du point de vue structural et catalytique, les transposases à motif DDE (Acide aspartique-Acide aspartique-Acide glutamique) appartiennent à la superfamille des polynucléotidyl-transférases qui partagent un motif structurel commun, le domaine RNaseH-like (Rice and Baker 2001) qui a été identifié pour la première fois dans la structure cristalline de la nucléase RNase H d'E. coli (Yang, Hendrickson et al. 1990). Le repliement RNaseH-like permet un positionnement étroit des trois résidus catalytiques (Nowotny 2009). Les transposases à DDE sont composées de multiples domaines fonctionnels: un (ou des) domaine(s) de fixation à l'ADN, situé le plus souvent dans la partie N-terminale, et un domaine catalytique dans la partie C-terminale, séparés par des domaines variés parmi lesquels ceux qui sont impliqués dans la multimérisation.

La triade DDE hautement conservée sert à coordonner un ou deux cations divalents tels que Mg²⁺ qui, à leur tour assistent la polarisation du groupe phosphate appartenant à la liaison phosphodiester cible, ce qui facilite le clivage. Les enzymes DDE utilisent des groupes hydroxyles comme des nucléophiles pour réaliser le clivage et le transfert de brin: une molécule d'H2O pour le clivage initial et un 3'OH, généré par clivage des extrémités, pour la réaction de transfert de brin. Le mécanisme de transposition est déclenché suite à un clivage monocaténaire aux bornes de l'élément transposable. La molécule d'H2O attaque la liaison phosphodiester qui lie le transposon à l'ADN donneur, ce qui génère des extrémités 3'-OH à chacune des extrémités de l'élément. Ces extrémités 3'-OH sont ensuite transférées par la transposase, dans un ADN cible, via une réaction de transestérification. Toutes ces réactions

33 se déroulent au sein d'un complexe nucléoprotéique, appelé le transpososome, qui assure l'intégration concertée de chaque extrémité du transposon, dans l'ADN cible (Surette, Buch et al. 1987). L'attaque nucléophile des extrémités 3'-OH dans la cible est décalée, et entraine une duplication de l'ADN cible au niveau du site d'insertion et ceci après réparation par la machinerie cellulaire de l'hôte. La taille de cette duplication varie de 2 à 9 nucléotides et elle est caractéristique de chaque transposon (par exemple Tn5 : 9 pb, Tn7 : 5 pb, IS911 : 3-4 pb) (Curcio and Derbyshire 2003).

En effet l'importance des résidus DDE pour la catalyse a été établie par des études de mutagénèse dirigée dans plusieurs cas (intégrase du VIH, MuA, InsAB, TnsAB…) (Mizuuchi 1992; Sarnovsky, May et al. 1996; Engelman, Liu et al. 1997; Ton-Hoang, Turlan et al. 2004). Les cations bivalents dont le Mg²⁺ ou Mn²⁺ sont absolument requis pour l'activité catalytique de la transposase, ils sont fixés et orientés par le phosphate scissile et par les résidus carboxylates chargés négativement dans le site catalytique. Un mécanisme de catalyse à deux ions a été proposé, dans lequel la position précise des deux ions et la distance qui les sépare peuvent varier à chaque étape du mécanisme de transposition, en fonction des changements dans l'environnement du site de coordination. Le premier ion agit comme activateur de la molécule d'eau (étape d'hydrolyse de l'ADN donneur) ou du groupe 3'-OH (étape de transfert de brin dans l'ADN cible) en favorisant le départ d'un proton. Le deuxième cation permet la stabilisation de l'intermédiaire pentavalent adopté par le phosphate scissile (Nowotny, Gaidamakov et al. 2005; Yang, Lee et al. 2006). Outre leur rôle fondamental en tant que cofacteurs dans les activités catalytiques des transposases, les ions métalliques bivalents semblent également intervenir dans l'assemblage du transpososome. Pour les rétrovirus, Mg²⁺, Mn²⁺ ou Ca²⁺ sont nécessaires pour l'établissement des interactions stables entre l'intégrase du VIH et les extrémités LTR virales (Vink, Lutzke et al. 1994). Pour le phage Mu, les cations divalents sont également requis pour l'assemblage d'une transposase tétramérique active aux extrémités de l'élément: le Ca²⁺ stabilise le transpososome, mais contrairement aux ions Zn²⁺ et Co²⁺, il ne favorise pas le clivage du premier brin (Mizuuchi, Baker et al. 1992).

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Figure 12 : Comparaison de la structure du domaine catalytique RNAse H de différentes protéines de la superfamille des polynucléotidyl-transférases (Nowotny 2009). Le feuillet β central (avec des brins numérotés) et l'hélice α conservée sont représentés en orange et en jaune respectivement. Les parties non conservées sont colorées en gris. Les résidus du site catalytique sont représentés en boules et bâtons. Les deux ions métalliques observés dans les structures de Tn5 et RNase H1 sont colorés en violet. Les sites des insertions dans le repliement RNase H sont représentés par des lignes pointillées.

Figure 13 : Conservation du motif DDE de différentes transposases, intégrases et rétrotransposases (Ohta, Tsuchida et al. 2002).Les acides aminés constituant le motif DDE sont montrés en noir.

35 1.3) Modalités de transposition

Historiquement, les mécanismes de transposition ont été divisés en deux modes principaux, conservatif et réplicatif. Dans la transposition conservative, le transposon est libéré complètement de la molécule donneuse suite à un clivage double-brin aux deux

Figure 14 : Réactions de clivage et transfert de brin catalysées par les transposases à DDE. A) Réaction d'hydrolyse de la liaison phosphodiester par une molécule d'H2O. B) Réaction de transestérification via une attaque réalisée par les extrémités 3'-OH sur l'ADN cible.

Figure 15 : Modèle de catalyse à deux ions (Yang 2008; Nowotny 2009). La coordination des ions métalliques A et B est indiquée par des pointillés. L'acide aspartique Asp conservé est représenté en rose. Les atomes d'oxygène de la protéine et du phosphate scissile sont représentés en rose. La molécule nucléophile est colorée en bleu. Selon ce modèle, l'ion métallique A agit comme un acide de Lewis, il active une molécule d'eau par déprotonation. L'ion B stabilise l'intermédiaire pentavalent formé entre la transposase et le phosphate scissile du substrat ADN. L'attaque nucléophile par la molécule d'eau permet de dissocier la liaison phosphodiester pour libérer le transposon avec une extrémité 3'-OH nucléophile coordonnée à l'ion B (étape d'hydrolyse). Dans l'étape de transfert de brin (non schématisée ici), l'extrémité 3'-OH activée par l'ion B est capable d'attaquer le phosphate scissile au niveau de l'ADN cible.

36 extrémités. Cependant la transposition réplicative implique une coupure simple-brin à l'extrémité 3' et permet la réplication du transposon à la fois dans la molécule donneuse et receveuse.

1.3.1) La transposition conservative ou "couper-coller"

Dans la transposition conservative ou "couper-coller", le transposon est excisé du site donneur et réinséré dans un site cible sans réplication. Ceci implique le clivage des deux brins d'ADN au niveau des extrémités 3' et 5' de l'élément et leur ligature à l'ADN cible pour générer une insertion simple. Cette stratégie est adoptée par une variété d'éléments comme le Tn7, IS10 et IS50 (Kleckner 1990; Goryshin and Reznikoff 1998) et la famille des Tc/mariner (Richardson, Dawson et al. 2006). La cassure double brin introduite à la molécule donneuse

Figure 16 : Les deux modes principaux de transposition (Hallet and Sherratt 1997). Dans la transposition conservative, l'élément transposable (représenté par un rectangle) est excisé de l'ADN donneur par des coupures double brin à chaque extrémité (triangles noirs), puis transféré dans l'ADN cible. La transposition réplicative conduit à la formation d'un cointégrat dans lequel l'ADN donneur et cible sont fusionnés; la réplication de l'élément génère deux copies dont l'une est attachée à l'ADN donneur et l'autre est liée à la cible. Le cointégrat est résolu par recombinaison homologue site spécifique entre les deux copies de transposon. Des répétitions directes (représentées par des triangles blancs) sont généralement générées, dans les deux modes de transposition, au niveau du site d'insertion.

37 peut conduire à sa perte. Cependant, dans certains cas on peut observer une réparation des cassures double brin ou un phénomène de conversion génique.

Une variété des stratégies ont été développées par les éléments transposables pour performer le clivage du second brin d'ADN:

- Formation de structures en "épingles à cheveux" aux extrémités du transposon: Cette stratégie est adoptée par les séquences d'insertion IS10 et IS50, et par les transposons Tn5 et Tn10. La première étape de clivage est une coupure hydrolytique catalysée par la transposase aux extrémités 3' du transposon. Les groupes 3'OH libres attaquent les extrémités 5 ', formant ainsi une épingle à cheveux aux extrémités du transposon, ce qui permet la libération de l'ADN donneur flanquant. L'épingle à cheveux est résolue par une hydrolyse, catalysée, par la transposase, en 3' des extrémités. Ensuite, les extrémités 3'-OH libérées sont transférées dans l'ADN cible via la réaction de transestérification (Bhasin, Goryshin et al. 1999; Curcio and Derbyshire 2003).

- Formation de structures en "épingles à cheveux" sur l'ADN flanquant:

Cette stratégie implique des clivages aux extrémités 5' du transposon, générant ainsi des 3'-OH nucléophiles sur l'ADN flanquant. La transestérification directe par les 3'-3'-OH libres sur les brins opposés entraine la formation des structures en "épingle à cheveux" mais cette fois au niveau de l'ADN flanquant, ce qui permet la libération du transposon sous forme linéaire. Ce mécanisme est utilisé uniquement par les transposons eucaryotes appartenant à la famille

hAT (Zhou, Mitra et al. 2004) dont leur transposase présente des similarités significatives

avec la recombinase RAG responsable de la recombinaison V(D)J qui implique également la formation des structures en hairpin.

- Cas du transposon Tn7: deux protéines libèrent le Tn7 de l'ADN flanquant

Le transposon bactérien Tn7 nécessite cinq protéines pour la transposition, dont deux, TnsA et TnsB, effectuent les réactions de clivage et de transfert de brin. Une deuxième paire de protéines - soit TnsC et TnsD ou TnsC et TnsE - est responsable de la coordination de la transposition et de la sélection de la séquence cible (Waddell and Craig 1988). TnsA et TnsB fonctionnent comme un hétérodimère, chacune d'elles clive un brin flanquant différent. TnsB est une transposase à DDE, elle se lie aux extrémités du transposon et clive précisément en 3'. Cependant, aucune structure en hairpin n'est impliquée dans le clivage

38 du second brin; c'est la protéine TnsA, recrutée par TnsB, qui catalyse la coupure du transposon au niveau de ses extrémités 5' (Sarnovsky, May et al. 1996).

1.3.2) La transposition réplicative: Formation de cointégrat

La transposition réplicative est réalisée par un clivage monocaténaire aux extrémités 3' du transposon (le transposon ou l’IS, n'est pas excisé de la molécule donneuse). Les groupements 3'-OH libérées sont ensuite transférés sur les brins opposés de l'ADN cible de façon à créer une structure similaire à une fourche de réplication à chaque extrémité du transposon. Cette structure est appelée "intermédiaire de Shapiro" (Shapiro 1979), dans laquelle le transposon est lié covalemment à l'ADN cible (en 3') et l'ADN donneur (en 5'). La résolution de l'intermédiaire de Shapiro est sous la dépendance de la machinerie de réplication de l'hôte. La réplication est initiée à partir des groupements 3'-OH nouvellement générés dans l'ADN cible; cela conduit à la duplication du transposon, à la réparation du site cible et à la fusion des deux molécules (donneuse et accepteuse du transposon) dont le produit est appelé "cointégrat" qui comprend donc deux copies du transposon (Curcio and Derbyshire 2003). Les deux copies ont un brin d'ADN du transposon d'origine et un brin nouvellement répliqué. Le cointégrat peut être résolu en deux molécules d'ADN qui contiennent chacune une seule copie du transposon, par l'un des deux mécanismes: 1) Certains transposons codent une protéine spécifique appelée résolvase qui se lie à un site particulier à l'intérieur du transposon et favorise la recombinaison site-spécifique entre les deux copies de l'élément (Machida and Machida 1989); 2) D'autres transposons comptent sur les enzymes de recombinaison homologue de l'hôte pour résoudre les cointégrats (MAHILLON and CHANDLER 1998). Les éléments qui utilisent cette stratégie de transposition comprennent le bactériophage Mu, les membres de la famille Tn3 et la famille IS6.

1.3.3) La transposition "copier-coller": Formation d'un intermédiaire circulaire C'est une stratégie de transposition alternative qui permet d'éviter la coupure double-brin. Elle est utilisée par l'IS911, l'IS2 et l'IS3 (Curcio and Derbyshire 2003), et permet de générer, avec l'aide des protéines réplicatives de l'hôte, une copie circularisée de l'élément sans passer par une structure en hairpin (Curcio and Derbyshire 2003). La première étape, l'hydrolyse catalysée par la transposase, est asymétrique et implique le clivage d'une

39 seule extrémité 3' du transposon. Au lieu d'attaquer le brin complémentaire, comme dans le cas de l'IS10, le groupement 3'-OH libéré agit comme nucléophile pour attaquer la liaison phosphodiester située sur le même brin mais à l'extrémité opposée du transposon, générant ainsi un intermédiaire simple brin circularisé (Lewis and Grindley 1997; Sekine, Aihara et al. 1999). La machinerie de réplication de l'hôte permet de régénérer une copie intacte de l'élément sur la molécule donneuse, et de produire un intermédiaire circulaire double brin. Ce dernier est excisé par des coupures simple brin à chaque extrémité, et le transposon ainsi linéarisé porte les groupements 3'-OH nécessaires pour l'attaque de l'ADN cible.

Figure 17 : Mécanismes de transposition performés par les transposases à motif DDE (Curcio and Derbyshire 2003). Les lignes vertes représentent l'ADN donneur flanquant. Les lignes bleues représentent le transposon. L'ADN cible est coloré en orange. L'ADN synthétisé par la réplication est montré en lignes mauves. Les cercles colorés selon la nature de l'ADN (donneur, transposon, cible ou issu de la réplication) représentent les groupements 3'-OH terminaux issus des réactions de clivage.

40 1.4) Stratégie de sélection du site cible

Le site cible peut être choisi par une interaction directe entre l'ADN cible et la transposase, ou alternativement, grâce à une collaboration entre la transposase et d'autres protéines accessoires qui peuvent être codées par l'élément transposable et/ou par la cellule hôte. Plusieurs mécanismes de sélection du site cible sont utilisés par les éléments qui possèdent des transposases à DDE. Dans certains cas, la transposase interagit préférentiellement avec des séquences spécifiques; dans d'autres cas, la transposase préfère des structures d'ADN particulières.

1.4.1) Sélection du site d'insertion via une interaction entre la transposase et l'ADN cible

Certains éléments transposables présentent une nette préférence pour des sites cibles qui partagent une séquence consensus commune. L'interaction de la transposase avec ces séquences semble être le facteur déterminant dans le choix du site cible. Un exemple notable et particulièrement bien étudié d'un élément de ce genre est le transposon bactérien Tn10, un élément composite formé par la collaboration entre deux séquences d'insertion IS10 qui flanquent un module de résistance à la tétracycline. Tn10 et IS10 s'insèrent de manière préférentielle dans des "hotspots" qui partagent la séquence cible consensus 5' GCTNAGC 3' (Halling and Kleckner 1982). Cependant, il a été montré que l'identité des nucléotides qui flanquent la séquence consensus déjà décrite, peut également avoir un impact considérable sur la sélectivité du site cible (Halling and Kleckner 1982). En outre, des mutations dans la transposase de l'IS10 peuvent altérer spécifiquement la reconnaissance de la cible (Bender and Kleckner 1992).

D'autres éléments comme le Tn3 présentent une spécificité d'insertion dans des sites homologues à leurs extrémités (Tu and Cohen 1980). Pour le transposon Tn9 et son constituant IS1, les sites d'intégration privilégiés sont des sites riches en AT (Zerbib, Gamas et al. 1985). Certains éléments de la famille Tc/mariner (Tc1 et Tc3) génèrent une duplication TA lors de l'intégration dans l'ADN cible au niveau du dinucléotide TA préférentiel situé dans la séquence consensus CAYATATRTG (Korswagen, Durbin et al. 1996).

41 1.4.2) Sélection du site cible via une interaction entre la transposase et d'autres protéines

Une caractéristique notable de nombreux systèmes de transposition qui utilisent des protéines accessoires pour la sélection de la cible est que l'insertion de l'élément est préférentiellement dirigée vers des sites d'insertion "sûrs" qui ne se trouvent pas dans des gènes essentiels à l'hôte.

Le transposon bactérien Tn7 peut utiliser deux types de sites cibles: Il s'insère à haute fréquence dans un site spécifique attTn7 dans le chromosome de E. coli et de nombreuses autres bactéries, et s'insère également à basse fréquence dans des sites non-attTn7 (Waddell and Craig 1988). La spécificité d'insertion du Tn7 est assurée par la transposase TnsAB en présence de la protéine régulatrice TnsC et la protéine de ciblage TnsD. Tn7 est dirigé vers le site d'insertion suite à la fixation spécifique de la protéine TnsD sur le site

attTn7; ce qui permet le recrutement de la protéine régulatrice TnsC qui interagit également

avec la transposase TnsAB liée aux extrémités de l'élément (Bainton, Kubo et al. 1993). TnsAB est alors activée pour performer les réactions de clivage et de transfert de brin.

Il a été également montré que la spécificité d’insertion du Tn7 est influencée par la machinerie de réplication. En effet, le Tn7 peut utiliser une voie de transposition alternative médiée par une autre protéine de ciblage appelée TnsE, permettant de diriger les insertions dans les plasmides conjugatifs avec une préférence pour la région d’ADN conductrice de la conjugaison (Peters and Craig 2001). Le transfert conjugatif est une forme spécialisée de la réplication de l’ADN, il est initié suite à une coupure simple brin, médiée par la relaxase, au niveau du site nick situé dans l’origine de transfert oriT. La relaxase se lie à l’extrémité 5’ clivée et dirige le passage d’un brin du plasmide dans la cellule receveuse. Ensuite un brin d’ADN complémentaire est synthétisé durant le transfert, à la fois dans les cellules donneuses et receveuses afin de régénérer un plasmide double brin. Il a été montré que l’ADN conjugatif synthétisé dans la cellule réceptrice est une cible privilégiée pour la transposition du Tn7. Le mécanisme qui régit le ciblage de cette intégration est récemment connu ; il implique une interaction spécifique entre la protéine TnsE et le facteur ß-clamp associé à la fourche de réplication du brin retardé retrouvé dans la cellule receveuse (Parks, Li et al. 2009).

42 L’effet de la réplication a été également étudié pour quelques autres éléments comme l’IS903 qui semble aussi utiliser le facteur ß-clamp pour le ciblage des insertions (Hu and Derbyshire 1998).

Figure 18 : Voie de transposition TnsABC+D utilisée par Tn7 pour l'intégration dans le chromosome (Peters and Craig 2001). La fixation de TnsD induit une distorsion asymétrique du site attTn7, ce qui permet le recrutement de TnsC. TnsC constitue une plateforme dans le sillon mineur du site d'insertion, et active la transpsase TnsAB liée aux extrémités de Tn7, conduisant à l'intégration dans attTn7. L'encadré montre le décalage de 5 pb généré après intégration. Le chiffre zéro indique le point central de l'insertion.

Figure 19 : Voie de transposition TnsABC+E utilisée par Tn7 pour l'intégration au niveau du plasmide conjugatif. TnsABC+E permet une transposition spécifique de Tn7 au niveau des plasmides conjugatifs à leur entrée dans la cellule réceptrice.

43 1.5) Régulation de la transposition

Les éléments utilisant une transposase à DDE ont développé différentes stratégies pour contrôler leur activité de transposition. Les mécanismes de régulation peuvent intervenir à des étapes très variées du processus de transposition: transcription et traduction du gène de