1) Insertion d’une étiquette Histidine en N-terminale de la transposase
Comme il a été déjà mentionné, aucune transposase à deux tyrosines catalytiques n'a été purifiée et caractérisée à ce jour. Ainsi nous avons voulu essayer de purifier la transposase de l’IS1294b (TnpA_IS1294b) dans le but de pouvoir ultérieurement étudier le mécanisme in
vitro de la transposition, de trouver des protéines partenaires et d’étudier ses propriétés
structurales.
Dans un premier temps, nous avons inséré une séquence de 23 bases (8 codons CAC, histidine) en N-terminale (juste après le codon ATG initiateur) du gène tnpA_IS1294b dans l’IS1294b du pGIS3_ref. Cette construction, vérifiée par séquençage, a été analysée avec le test de contre-sélection au saccharose. La fusion d’une étiquette histidines en N-terminale n’a pas modifié la fréquence de transposition de l’IS1294b (1,8 x 10-2).
2) Surexpression mais insolubilité de la transposase sauvage TnpA_IS1294b
Le gène codant pour la transposase avec l’étiquette en 8 histidines en N-terminale (8H-TnpA) a été cloné dans la bactérie E. coli, dans un vecteur d'expression (de type pET32) sous le contrôle d'un promoteur T7 inductible (opérateur lacI).
En utilisant différentes conditions :
- différentes souches d’E. coli(DE3) contenant le plasmide pLysE (contrôle plus strict de l’induction par l’IPTG) : BL21, Origami, et Shuffle,
- Variation de la concentration d’inducteur (0,5 et 1 mM)
- de température et du temps d’induction : 18° (16h), 30°C et 37°C (1 à 4 h)
- des conditions d’extraction en conditions salines (NaCl 1M), incluant soit 0,3% de triton ou 7 mM CHAPS.
Ces différentes conditions ont montré la présence de la 8H-TnpA (47 kDa) qui est bien surexprimée, mais insoluble : pas de détection dans le surnageant (même après western-blot avec un anticorps Anti-Histidine). La transposase 8H-TnpA (47 kDa) n’était présente que dans le culot (données non montrées).
106 3) Amélioration de la solubilité avec la thiorédoxine (TRX)
Pour améliorer la solubilité de la transposase de l'IS1294b, nous avons décidé de fusionner la transposase 8H-TnpA au niveau de son extrémité N-terminale à deux protéines : la thiorédoxine (TRX) ou la glutathion S-transférase (GST).
Des essais de surexpression réalisés sur les deux constructions de protéines recombinantes ont montré, après la migration sur un gel SDS-PAGE, que la TRX permettait une expression et une solubilité (données non montrées) plus importantes que celles induites avec la GST. Des essais de surexpression effectués avec la protéine fusionnée à la TRX (TRX-8H-TnpA, 60 kDa) dans deux souches d'E. coli, BL21 (pLysE) et Shuffle pLysE, ont indiqué que la bactérie E.
coli Shuffle (pLysE) était la plus efficace pour la surexpression de la production de la protéine
et la solubilité en gardant des conditions expérimentales optimales comme la température de 37°C et le temps d'induction par l’IPTG 1 mM fixé à 3 heures (figure 50).
L'utilisation d'E. coli Shuffle favorise la formation des ponts disulfures dans le cytoplasme permettant ainsi un bon repliement de la protéine. Le plasmide pLysE, comportant le gène du lysozyme du phage T7, permet de réduire les fuites de transcription avant l'induction par l'IPTG, et est recommandé lorsque la protéine recombinante exprimée génère une toxicité pour la bactérie.
D'autre part, après un essai d’extraction et de purification (Volume de culture de 50 ml) sur des billes de Ni-NTA agarose et réalisation d'un Westen-blot, nous avons bien confirmé la présence de la protéine TRX-8H-TnpA dans la fraction soluble. Cependant, l’accrochage des
Figure 50 : Gel SDS-PAGE à 11% et coloration au bleu de coumassie
Piste 1, E. coli Shuffle non induite ; piste 2, E. coli Shuffle induite 3h à 37°C (IPTG 1 mM) ; piste 3, E. coli Shuffle induite 3h à 28°C ; piste 4, E. coli BL21 induite 3h à 37°C (IPTG 1 mM) ; piste 5, E. coli BL21 induite 3h à 28°C.
107 résidus Histidine sur le Nickel était faible, probablement en raison de la position interne de l’étiquette Histidine (Figure 52A).
Une construction (9H8N-TRX-8H-TnpA) comme suivante a été réalisée :
Une protéine de fusion contenant : 9 histidines (9H), suivies par 8 asparagines (8N), la thioredoxine (TRX), une ‘’séquence spacer’’ (SGSG, S pour sérine et G, pour glycine), le site de coupure par la protéase Tev et la 8H-TnpA a été obtenue (Taille théorique de 63 kDa, avec un point isoélectrique de 9,56).
L'accrochage de cette séquence supplémentaire en N-terminale a amélioré l’affinité pour les billes de Nickel par rapport à la précédente construction (figure 52B).
Figure 51 : Représentation schématique de la protéine recombinante 9H8N-TRX-8H-TnpA. Le vecteur d'expression utilisé est le pET32.
La taille de la protéine de fusion est de 63 kDa, avec un point isoélectrique de 9.56.
Figure 52 : Gels SDS-PAGE à 11% comparant de deux purifications différentes réalisées sur des billes de Ni-NTA agarose.Le gel (A) correspond à la purification de la protéine recombinante TRX-8H-TnpA de taille 60 KDa. Le gel (B) correspond à la purification de la protéine recombinante 9H8N-TRX-8H-TnpA de taille 63 KDa. Les protéines d'intérêt sont indiquées par une flèche rouge. Pistes 1 et 1'= Culot. Pistes 2 et 2' = Lysat. Pistes 3 et 3' = Fraction non retenue. Pistes 4 et 4' = Fraction de stripping. Pistes 5 et 5' = Elution à 100 mM d'imidazole. Pistes 6 et 6' = Elution à 250 mM d'imidazole. Le chiffre M indique le marqueur de taille.
A B
108 Des expériences de western-blot ont confirmé que la bande de 63 kDa (flèches rouge sur figure 52) a été révélée par l’anticorps Anti-Histidine (résultat non montré).
4) Purification sur une colonne d'affinité au Cobalt suivie d'un gel-filtration
Dans les conditions d’extraction décrites dans le Matériel et Méthodes et à partir de deux litres de culture, une purification a été réalisée.
L’utilisation d’une colonne d'affinité au cobalt (GE/Healthcare) a permis d'éliminer un certain nombre de contaminants (figure 53A) : bandes d’environ 70 kDa (probablement des protéines de type HSP, ou heat shock proteins) qui étaient présentes après purification avec les billes de Nickel (voir figure 52 A et B).
La figure 53 A montre une bande de la taille attendue éluée à 75 mM d’imidazole et 250 mM d’imidazole. Cette bande est révélée en western-blot par l’anticorps Anti-histidine (figure 53 B). Cependant, une dégradation de cette protéine recombinante est probable (présence en grande quantité d’une bande notée par une flèche bleue, pouvant correspondre à la taille de la thiorédoxine seule).
Les protéines contenues dans les fractions à 250 mM ont cependant été soumises à une purification selon leur taille, par exclusion sur gel filtration (Superdex 75 GE/Healthcare).
Figure 53: Purification de la protéine recombinante 9H8N-TRX-8H-TnpA sur une colonne de Cobalt. Analyse de la protéine recombinante par un gel SDS-PAGE 11% coloré au bleu de coomassie (A) et en western-blot révélé avec un anticorps anti-histidine (B). La protéine recombinante est indiquée par une flèche rouge. Piste 1 = Lysat. Piste 2 = Fraction non retenue. Piste 3 = Culot dilué. Piste 4 = Elution à 75 mM d'imidazole. Pistes 5 et 6 = Elution à 250 mM d'imidazole.
6 5 4 M 3 2 1 6 5 4 M 3 2 1
109 Une bande de la taille attendue a été obtenue comme indiqué par le résultat du gel SDS-PAGE et après coloration au bleu de coomassie (Figure 54).
5) Résultat de la spectrométrie de masse
La bande obtenue précédemment a été découpée, puis analysée par spectrométrie de masse.
Le nombre total de séquences peptidiques identifiées ou PSMs (peptide spectrum matches) était égal à 499 pour la protéine GroEL (57,3 kDa, numéro d’accession P0A6F5), alors que le nombre de séquences peptidiques pour la protéine d’intérêt (TnpA), n’était que de 62 spectres (PSMs)
Ainsi, la spectrométrie de masse a montré une présence prédominante de la protéine chaperone GroEL dont la copurification est un phénomène souvent rencontré, et est le résultat des interactions hydrophobes stables avec les protéines de fusion. La présence de GroEL en grande quantité pourrait indiquer des difficultés survenues dans le repliement de la protéine recombinante.
Pour essayer d’améliorer la qualité de la purification, nous avons utilisé d’autres détergents que le triton X100 à 0,3%, comme le CHAPS (7 mM) et le N-Octyl Glucoside (0.2 %) dans le tampon d’extraction, mais encore une fois, la spectrométrie de masse a indiqué la présence de GroEL en grande quantité dans les échantillons de transposase recombinante analysés.
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