La séquence peptidique de la transposase TnpA de l’IS1294b (ou TnpA_IS1294b) de 402 acides aminés est présentée sur la figure 47.
1) Alignement des séquences protéiques
1.1) Motif catalytique : motifs Y2 et HUH
En se basant sur les alignements des séquences de différentes protéines RCR dont les transposases Y2 (IS91, IS801) et les protéines Rep (figure 48), des résidus catalytiques conservés dans le motif Y2 et le motif HUH ont été identifiés sur la séquence de la transposase de l'IS1294b (voir revue de la Littérature). L'implication des tyrosines Y249 et Y253 dans l'activité catalytique de la transposase de l'IS91 a été déjà confirmée par mutagénèse dirigée (del Pilar Garcillan-Barcia, Bernales et al. 2001). Cependant, l'importance de ce motif catalytique n'a jamais été montrée expérimentalement pour la transposition de l'IS1294. De même, la nécessité des histidines H164 et H166 (motif HUH) n’a jamais été vérifiée pour les transposase IS91-like.
Figure 47 : Séquence protéique de la TnpA_IS1294b.Le motif Y2 est coloré en rouge. Le motif HUH et les résidus critiques adjacents sont montrés en vert. Le résidu histidine et les six résidus cystéines critiques, à l'extrémité N-terminale, sont montrés en bleu. Les deux résidus cystéines critiques, à l'extrémité C-N-terminale, sont colorés en orange.
102
1.2) Présence d'un potentiel motif de liaison à l’ADN : motif à doigt de zinc
Un motif potentiel, de liaison à l’ADN riche en cystéines à été identifié dans la partie
N-terminale de la protéine TnpA_91 (figure 49).
(http://supfam.mbu.iisc.ernet.in/CGI/display_pfam.cgi?name=Zn_Tnp_IS91)
2) Mutations ponctuelles dans la séquence protéique de la TnpA_IS1294b : effet in vivo
Utilisation du plasmide donneur pG-TnpA-TKO pour tester les activités de la transposition in vivo
Pour des raisons pratiques (éviter le contrôle par séquençage de toute l’IS), la mutagénèse dirigée a été réalisée sur le pG-pLac-TnpA, puis le fragment HindIII contenant le gène tnpA avec la mutation désirée, une fois contrôlé par séquençage a été réintroduit en amont de la cassette TKO. Les valeurs obtenues ont été comparées à celle (1,6 x 10-4) du plasmide de référence, pG-TnpA-TKO contenant le gène tnpA sauvage ou WT (pour wild-type) (figure 46B).
Figure 48 : Alignement des séquences des motifs Y2 (en rouge) et HUH (en vert) de la TnpA_IS1294b avec celles des autres transposases Y2, des protéines Rep et des relaxases.
Figure 49 : Alignement de la séquence riche en cystéines, à l'extrémité N-terminale, des transposases TnpA_IS1294b, TnpA_IS91 et TnpA_IS801.
103
WT, forme sauvage, Y, tyrosine ; F, phénylalanine (acide aminé tyrosine sans OH) ; H, histidine, A, alanine, C, cystéine).
Le tableau 5 présente les fréquences moyennes de transposition de la cassette TKO (terIS-KanR-oriIS), associées aux différentes substitutions générées dans la TnpA_IS1294b. Elles montrent que :
* Le changement des tyrosines en phénylalanine (F) en position 254 ou 258 est critique : Y254F et Y258F. Ces résidus sont donc nécessaires au fonctionnement de la transposase. Un autre motif Y236-Y240 avait été identifié mais la mutation de chacune de ces deux tyrosines n'était pas inhibitrice de la transposition.
* Un motif HUH ou HVH [histidine-acide aminé hydrophobe (valine)- histidine], a été identifié en position 164-166. La mutation de l'histidine H164 en alanine inactive la transposition (tableau 5). Le mutant H166A est en cours d’analyse.
D'autre part, la comparaison de la séquence du site actif au niveau du motif HUH des transposases de la famille IS91 avec celle des relaxases, révèle la conservation d'un troisième résidu histidine et d'un résidu arginine (figure 48). En effet, pour les relaxases TrwC et TraI, il a été montré que la coordination de l'ion métallique par les deux résidus histidines du motif
104 HUH nécessite également l'intervention d'un troisième résidu histidine (H150 pour TrwC et H146 pour TraI), dont la mutation était responsable d'une diminution très sévère de la fréquence du transfert conjugatif médié par chacune de ces relaxases (Guasch, Lucas et al. 2003; Larkin, Haft et al. 2007). L’'utilisation de trois résidus histidine pour la liaison à l'ion métallique, permet de laisser une charge positive très importante sur le métal, ce qui favorise une plus grande polarisation du phosphate scissile qui est ainsi plus sensible à l'attaque nucléophile par la tyrosine catalytique. De plus, il a été suggéré que le résidu arginine conservé présent dans le site actif de ces relaxases (R154 pour TrwC et R150 pour TraI) permettait de stabiliser l'intermédiaire pentavalent coordonné. En prenant en considération toutes ces données de la littérature, nous avons montré que la mutation de l'histidine H153A ou l'arginine R157A situées à proximité du motif HUH de la TnpA_IS1294b (figure 48) était à l'origine d'une inhibition de son fonctionnement in vivo à des taux non détectables. Ce résultat conforte très fortement que le modèle de catalyse utilisé par les relaxases pourrait être également adopté par celui de la transposase de l'IS1294b.
Les études des alignements des séquences ont également montré la conservation de plusieurs autres résidus. Le résidu H162 dans la transposase de l'IS1294b est aussi conservé au niveau des protéines codées par IS91 et IS801, cependant la mutation H162A n'a pas affecté la fréquence de transposition in vivo de l’IS1294b.
En outre, nos analyses de mutagénèse ont ciblé la séquence riche en cystéines, située à l'extrémité N-terminale de la TnpA_IS1294b (figures 47 et 49). Cette séquence comprend un motif putatif de liaison au zinc, permettant probablement l'interaction avec l'ADN. Nous avons pu identifier un résidu histidine (H65) et six résidus cystéines (C46, C58, C63, C73, C78 et C81) critiques, dont la substitution en alanine ne permet pas la transposition de la cassette TKO.
Au contraire trois résidus Cys (C22, C100 et C171) en posisiton N-terminale ne sont pas critiques au mécanisme de transposition.
Quatre résidus cystéines à l'extrémité C-terminale ont également été retrouvés et modifiés par mutation ponctuelle, et les résultats préliminaires du test de transposition (n= 1) effectué pour chaque mutant, ont montré l'importance de seulement deux de ces cystéines (C366 et C369).
105