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Phénotypes et endotypes de l’asthme sévère préscolaire
de l’enfant : rôle du muscle lisse bronchique dans le
remodelage précoce
Valérie Siao Him Fa
To cite this version:
Valérie Siao Him Fa. Phénotypes et endotypes de l’asthme sévère préscolaire de l’enfant : rôle du muscle lisse bronchique dans le remodelage précoce. Médecine humaine et pathologie. Université de Bordeaux, 2018. Français. �NNT : 2018BORD0109�. �tel-03227344�
1
THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR DE
L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX
ÉCOLE DOCTORALE
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
Par Valérie SIAO HIM FA
Phénotypes et endotypes de l’asthme sévère préscolaire
de l’enfant: rôle du muscle lisse bronchique dans le
remodelage précoce.
Sous la direction du Professeur Michael FAYON
Soutenue le 12 juillet 2018 Membres du jury:
Pr. de BLIC Jacques PU-PH, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris Président Pr. JUST Jocelyne PU-PH, Hôpital Armand Trousseau, Paris Rapporteur
Pr. BOURDIN Arnaud PU-PH, CHU Montpellier Rapporteur
2
Phénotypes et endotypes de l’asthme sévère préscolaire de
l’enfant: rôle du muscle lisse bronchique dans le remodelage
précoce.
Introduction: L’asthme est la pathologie chronique la plus fréquente chez l’enfant. Les études épidémiologiques suggèrent que les épisodes sifflants et les facteurs environnementaux notamment les virus vont avoir un impact sur la fonction respiratoire à l’âge adulte. La fonction respiratoire serait déterminée dès l’âge de 6 ans. L’asthme se caractérise par un remodelage et une inflammation bronchiques, responsables des symptômes respiratoires d’asthme. Les caractéristiques du remodelage bronchique RB et plus particulièrement l’augmentation de masse de muscle lisse bronchique BSM est un marqueur de sévérité chez l’adulte puisque corrélé au déclin de la fonction respiratoire. Les traitements antiasthmatiques actuels n’ont pas d’action sur ce RB. La période préscolaire pourrait donc être une période d’opportunité thérapeutique.
Les objectifs de notre étude était donc 1) d’étudier le RB chez l’enfant d’âge préscolaire, 2) d’étudier le rôle de la cellule de muscle lisse bronchique CML dans l’asthme sévère préscolaire, dans l’asthme sévère adulte et chez le nourrisson contrôle et enfin 3) d’étudier des moyens de moduler le remodelage musculaire dans l’asthme sévère préscolaire.
Matériel et Méthodes: Immunohistochimie, comptage cellulaire, cytométrie en flux, western blot, oroboros, seahorse ont été utilisés.
Résultats: Nous avons montré que le RB était présent de manière très précoce, dès l’âge de 12 mois chez l’enfant âgé de 1 à 4 ans atteint d’asthme sévère. La taille du BSM, l’infection persistante au rhinovirus et l’exposition au tabagisme in utero étaient des critères discriminants dans le phénotypage des asthmes sévères préscolaires. Nous avons décrit 2 endotypes en fonction de la taille du BSM. Le « gros muscle » était associé à un asthme plus sévère et à une surexposition au tabagisme maternel anténatal. Sur le plan physiopathologique, les CML du groupe « gros muscle » avaient une capacité de prolifération et une densité et activité mitochondriale plus élevées que dans le groupe «petit muscle». Nous avons également montré que les CML d’asthmatiques préscolaires comme adultes avaient un profil semblable à celui des CML immatures (nourrissons contrôles) en terme de prolifération et de profil mitochondrial, mais différaient de celui des CML d’adultes contrôles. La prolifération des CML était accélérée en présence de surnageant épithélial infecté par le rhinovirus uniquement pour les asthmes préscolaires et adultes en comparaison aux contrôles adultes et nourrissons. In vivo, la sensibilisation à l’ovalbumine entrainait un remodelage bronchique et une inflammation persistant chez la souris immature mais pas chez la souris adulte.
La capacité proliférative des CML d’asthme préscolaire était modulable in vitro par certains agents thérapeutiques (inhibiteurs calciques, Azithromycine). Cette diminution de vitesse de prolifération concernait préférentiellement les CML de l’endotype «Gros muscle» et était associée à une diminution de la densité mitochondriale. In vivo, un traitement par anti-leucotriène permettait une diminution de la taille du BSM chez les souris immatures sensibilisées à l’ovalbumine.
Conclusion: nous avons décrit de nouveaux endotypes basés sur les biopsies bronchiques. Le BSM
est un critère de sévérité dans l’asthme sévère préscolaire. La taille du BSM est associée au tabac maternel anténatal et au rhinovirus. L’augmentation de BSM est liée à la prolifération excessive des CML avec un mécanisme mitochondrie-dépendant. Le remodelage musculaire peut être réversible, notamment en diminuant la prolifération des CML. Cette preuve de concept suggère que la période préscolaire pourrait être une période clés pour la modulation du remodelage bronchique et donc pour modifier l’évolution de la maladie asthmatique à l’âge adulte. La mitochondrie pourrait être une cible thérapeutique clé pour diminuer le remodelage musculaire. L’endotypage des asthmes sévères permettrait une prise en charge plus personnalisée basée sur les biopsies bronchiques et l’étude du remodelage bronchique.
Mots clés: asthme sévère, enfant, remodelage bronchique, muscle lisse bronchique,
3
Phenotypes and endotypes in severe preschool wheezing:
the pivotal role of bronchial smooth muscle in early
bronchial remodeling
Introduction: Asthma, the most common chronic disorder in childhood is a heterogeneous disease. The multiple mechanistic pathways involved result in different clinical phenotypes, leading to the concept of the asthma syndrome. Bronchial remodeling, more particularly increased bronchial smooth muscle BSM, a pivotal feature of asthma, is correlated with asthma severity and lung function decline. Epidemiologic studies suggest that lung function decline follows the same trajectory from the age of six years to the third decade and is determined by the number and the severity of wheezing episodes in the preschool period. BSM remodeling does not appear to respond to current anti-asthmatic treatment.
Aims: 1) to describe the clinical phenotypes and endotypes related to bronchial remodeling in severe preschool wheezers 2) to evaluate the role of BSM remodeling in preschool wheezer in comparison to control infants, control adults and asthmatic adults, 3) to assess the impact of some environmental factors such as house dust mite and rhinovirus and 4) pharmacological agents in BSM proliferation and remodeling.
Methods: An ova-sensitized mouse model and a prospective cohort of severe asthmatic infants were studied using the following methods: western blot, cell culture, immunochemistry, FACs, seahorse.
Results: Bronchial remodeling was present in very early from 12 months. Rhinovirus, antenatal tobacco smoke exposure and BSM size were the main determinants of BR in severe asthma. High BSM mass was associated with a lower asthma control and greater antenatal tobacco exposure. High BSM mass was also associated with an increased BSMc proliferation rate and increased mitochondrial activity. An age-wise comparison showed that asthmatic adults’ and preschool wheezers’ BSMc had a profile similar to control infants’ BSMc regarding BSM proliferation and mitochondrial metabolism. However, environmental factors enhanced proliferation in asthmatic and wheezing groups only. In airways of sensitized mice, bronchial remodeling was enhanced in immature mice vs. adult mice, while bronchial inflammation was presented in both. Azithromycin and Montelukast decreased the in vitro proliferation and mitochondrial density, and the in vivo BSM mass (in immature mice), respectively.
Conclusion: We have described new endotypes and simple cluster algorithms based on bronchial biopsies. Increased BSM mass was correlated with high BSMc mitochondria-dependent proliferation. Asthmatic BSMc appears to maintain an immature profile with no-loss of rapid proliferation needed for initial lung growth. Immature mice seem to be more sensitive to environmental factors with a higher bronchial remodeling, compared to mature mice. We demonstrated proof of concept that pharmacological agents may reverse BSM remodeling. The therapeutic efficacy was improved in the “high BSM endotype”. This suggests that endotyping based on bronchial biopsies will be useful to guide asthma management. Our results suggest that targeting mitochondrial mechanisms in the preschool period may be an interesting approach.
Keywords: Severe wheeze, asthma, children, airway remodeling, airway smooth muscle,
antenatal tobacco smoke, mitochondria, murine model,
Unité de recherche INSERM U1045
Centre de Recherche Cardio-thoracique de Bordeaux,Unité 1045, Equipe 2 Remodelage bronchique, 146 rue Léo Saignat, 33078 Bordeaux Cedex
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REMERCIEMENTS
Monsieur le Professeur De Blic,
Je suis très honorée que vous ayez accepté de présider mon jury et je vous en remercie.
Madame le Professeur Just,
Je vous remercie d’avoir accepté d’être rapporteur de mon travail et suis très honorée de vous compter parmi les membres du jury.
Monsieur le Professeur Bourdin,
Je vous remercie d’avoir accepté d’être rapporteur de mon travail.
Monsieur le Pr Fayon
Je suis fière d’être ton élève. Je te remercie pour ton enseignement, ta patience et ta bienveillance. Ce travail est le témoignage de mon profond respect.
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REMERCIEMENTS
A l’ensemble des membres de l’unité INSERM 1045
Amandine, Laure-Anne, mes bonnes copines de thèse, cette thèse aura permis notre rencontre, merci de m’avoir supportée.
Isabelle, Pauline, Thomas, Elise, Flo, Benoit merci pour vos nombreux conseils.
A Patrick Berger et Mr Marthan, merci de m’avoir accueillie dans votre labo et d’avoir permis mon retour sur Bordeaux. Mon AHU a été plus qu’enrichissant!
Raf’, Noémie, Fabien ….si moi j’écris ces mots, c’est que vous arriverez forcément au bout. Force, Honneur et surtout beaucoup de Caféine !!!
Bonne continuation à tous les autres que je n’ai pas cités.
A notre petite équipe de pneumopédiatrie bordelaise
A mes co-chefs et amis MJ, FG, ALG
Stéphane, Annick merci pour votre gentillesse légendaire et merci de m’avoir toujours accueillie les bras ouverts. C’est toujours un plaisir de bosser à vos côtés.
Sans oublier Vincent, CyCy et Stéphanie, Amitiés
A l’équipe des EFR A ma famille, à mes amis
Done !
... pour la gloire
Promis, je vais essayer de me poser…prochain défi ? Merci de me supporter.
6
TABLES DES MATIERES
ABBREVIATIONS ... 8
I. INTRODUCTION ... 10
1. Asthme et épidémiologie ... 10
2. Histoire naturelle de l'asthme et Fenêtre d’opportunité pour la prévention secondaire de l’asthme ... 10
3. Le concept de Phénotypes ... 16
4. Physiopathologie de l'asthme et Remodelage bronchique dans l’asthme ... 17
5. Remodelage musculaire bronchique et sévérité de l’asthme ... 22
6. Place de la cellule du muscle lisse bronchique CML dans l’asthme ... 23
7. Mitochondrie et asthme ... 27
8. Thérapeutique et remodelage bronchique (Tableau 2) ... 31
II. OBJECTIFS ... 35
III. MATERIELS ET METHODES ... 37
A. POPULATION ... 37
B. L’EPITHELIUM BRONCHIQUE ... 39
C. LA CELLULE DU MUSCLE LISSE BRONCHIQUE ... 43
D. ETUDE DE LA MITOCHONDRIE DES CML ... 50
E. LES TRAITEMENTS (TABLEAU 7) ... 52
F. VIABILITE CELLULAIRE : DIAMIDINO-PHENYLINDOLE (DAPI) ... 52
G. EFFET SUR LE CYCLE CELLULAIRE ... 52
H. APOPTOSE CELLULAIRE ... 53
I. LE MODELE MURIN ... 53
J. ANALYSES STATISTIQUES ... 54
IV. RESULTATS ... 56
A. DESCRIPTION DE LA COHORTE P’TITASTHME ... 56
B. ETUDE DU REMODELAGE BRONCHIQUE ET DESCRIPTION D’ENDOTYPES EN FONCTION DE LA TAILLE DU MUSCLE LISSE BRONCHIQUE ... 58
C. L’ASTHME DE L’ADULTE: UNE CELLULE BRONCHIQUE ETERNELLEMENT JEUNE ? .. 62
D. UNE STIMULATION PRECOCE PEUT – ELLE ETRE UN FACTEUR DE RISQUE D’ASTHME ? 66 E. LE REMODELAGE BRONCHIQUE PRECOCE EST-IL MODULABLE IN VITRO? ... 70
7
F. LE REMODELAGE BRONCHIQUE PRECOCE EST-IL MODULABLE IN VIVO, EXEMPLE DU
MODELE MURIN? ... 73
V. DISCUSSION ... 76
VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 90
8
ABBREVIATIONS
ADNmt ADN mitochondrial
BDR réversibilité post-bronchodilatateur
BSM Muscle lisse bronchique
CML Cellule du muscle lisse
CSI Corticothérapie inhalée
EFR Epreuve fonctionnelle respiratoire
EMTU Unité trophique épithélio-mésenchymateuse
GM Gros muscle
HDM Acariens
HRB Hyperréactivité bronchique
MEC Matrice extracellulaire
PM Petit muscle
PNB Polynucléaire basophile
PNE Polynucléaire éosinophile
PNN Polynucléaire neutrophile
RBM Reticular Basement Membrane thickening ou membrane basale réticulaire ROS Espèces réactives oxygénées ou radicaux libres
9
10
I.
INTRODUCTION
1. Asthme et épidémiologie
L'asthme est une pathologie bronchique chronique qui touche 6,7% de la population adulte française et plus de 10% de la population pédiatrique dans les pays industrialisés (1). Dans les pays d' Europe de l'ouest et aux Etats-Unis, l'enquête ISAAC retrouvait une prévalence d'enfants asthmatiques variant de 7,4 à 20,2% chez les enfants âgés de 6-7 ans, et variant de 8,3 à 26,7% chez les adolescents de 13-14 ans (2). C'est la maladie chronique la plus fréquente en pédiatrie.
Elle représente un problème de santé publique majeur du fait des coûts élevés engendrés. En France, le taux annuel d'hospitalisations pour asthme chez les enfants de moins de 15 ans était de 32/10 000 hospitalisations en 2007 avec un taux de 79,9/10 000 pour les nourrissons de moins de 12 mois (3). On retrouve une augmentation du nombre d' hospitalisations pour exacerbation asthmatique chez les enfants en septembre et en avril au moment des épidémies virales (4).
L'asthme sévère touche 3 à 4% de la population asthmatique totale, soit 10/10 000 habitants (5). La prévalence d'asthme sévère est d'environ 0,5% parmi la population d'enfants âgés de 10 ans, et de 4,5% dans la population d'enfants asthmatiques âgés de 10 ans (6).
Malgré les différentes thérapeutiques mises en place depuis les années 2000, le taux de mortalité liée à une crise d'asthme aigue grave, tout âge confondu, était de 1,9/100 000 habitants en 2005, soit 1129 morts d'asthme aigu grave. Chez les enfants âgés de moins de 15 ans, le taux de mortalité était de 0,1/100000 habitants en 2005 (7).
2. Histoire naturelle de l'asthme et Fenêtre d’opportunité pour la prévention secondaire de l’asthme
L'asthme est une maladie inflammatoire bronchique chronique qui débute dès les premières années de vie. Les nombreuses études épidémiologiques ont démontré que les évènements respiratoires dans l'enfance, et plus précisément pendant la période préscolaire, vont influencer la fonction respiratoire à l'âge adulte (cohorte CAMP, MELBOURNE, TUCSON) (8).
11
La cohorte de Melbourne a montré que la sévérité de l’asthme dans l’enfance était un facteur déterminant pour la fonction respiratoire et l’évolution de l’état respiratoire à l’âge de 50 ans (9). Le fait d’avoir un asthme sévère à l’âge de 7 ans était un facteur prédictif de développer une BPCO à 50 ans indépendamment du sexe, du tabagisme actif et de l’existence ou non de rhinite allergique dans l’enfance (10). De manière plus précise, le VEMS était abaissé dès l'âge de 7 ans et tout au long de la vie, sans amélioration, dans les groupes d'adultes qui avaient présenté à l'âge de 7 ans un asthme modéré ou un asthme sévère, en comparaison avec les groupes qui avaient présenté des sifflements viro-induits transitoires (11). Le nombre d'épisodes sifflant pourrait avoir une répercussion sur la fonction respiratoire: le VEMS était supérieur dans le groupe qui avait présenté moins de 5 épisodes de sifflements viro-induits par rapport à ceux ayant présenté plus de 5 épisodes de sifflements viro-induits (Figure 1).
Figure 1. Suivi du VEMS de 7 à 42 ans (Cohorte Melbourne Epidemiological Study of Childhood Asthma) (11)
La sévérité initiale de la symptomatologie respiratoire est prédictive de la fonction respiratoire tout au long de la vie: le groupe initialement atteint d'asthme ou d'asthme sévère à 7 ans avait un VEMS abaissé par rapport aux groupes initiaux C (contrôle), MWB (< 5 épisodes de sifflements viro‐induits), WB (> 5 épisodes de sifflements viro‐induits). Phelan, JACI 2002 (11).
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Cette notion de « trajectoire » ou « couloir » d’évolution de fonction respiratoire tout au long de la vie a également été décrit lors du suivi de la cohorte américaine de Tucson (8, 12-14). La cohorte de Tucson a permis de différencier 2 trajectoires de fonction respiratoire de 6 à 32 ans: une «low function» et une «normal function». Dans le groupe «low function», il y avait plus de mères asthmatiques, une incidence plus élevée d’infection à VRS dans les 3 premières années de vie et une incidence plus importante d’asthme tout au long des 4 premières décennies. La croissance pulmonaire était également inférieure dans le groupe « low function». Le déclin plus précoce et accéléré du VEMS au cours de la vie est lié à un asthme dans l’enfance à début plus précoce, et un asthme dans l’enfance plus sévère (réversibilité moindre et HRB plus importante) (12).
La cohorte américaine de TUCSON a décrit l'existence de 4 phénotypes d'asthme dans la petite enfance (14) :
‐ non siffleur (no wheezer): les enfants n'ayant jamais présenté d'épisode sifflant dans les 3 premières années de vie, ni après l'âge de 6 ans,
‐ siffleur transitoire/asthme du nourrisson transitoire (transient-early wheezer): les enfants ayant présenté des épisodes sifflant dans les 3 premières années de vie, mais n'ayant plus de symptomatologie respiratoire à l'âge de 6 ans;
‐ siffleur précoce persistant/asthme précoce persistant (persistant wheezer): les enfants ayant présenté des épisodes sifflant avant l'âge de 3 ans et qui présentent un asthme persistant après l'âge de 6 ans;
‐ siffleur tardif/ asthme tardif (late-onset wheezer), les enfants présentant un asthme à l'âge de 6 ans et plus, sans antécédent d'épisode sifflant dans les 3 premières années de vie. Cette cohorte a également démontré que les enfants des groupes "persistant wheezer" et "late-onset wheezer" avaient à l'âge adulte, une fonction respiratoire diminuée par rapport aux adultes qui n'avaient pas présenté d'épisode sifflant (no wheezer) ou avaient présenté un asthme du nourrisson transitoire (early-transient wheezer) (Figure 2) (8).
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Figure 2. Fonction respiratoire chez l'adulte de 22 ans en fonction de ses antécédents asthmatiques à l'âge préscolaire (8)
Quelque soit l'existence ou non d'un asthme chez l'adulte jeune de 22 ans, le VEMS est abaissé s'il a présenté un asthme entre 2 et 6 ans , par rapport à ceux qui ont présenté un asthme plus tardivement (après l'âge de 6 ans).D'après Stern, Lancet 2008 (8)
Dans la cohorte parisienne, Just et al. ont montré que les enfants d'âge préscolaire ayant un asthme non-atopique non contrôlé ou un asthme atopique à facteurs déclenchant multiples MTW évoluaient dans la majorité des cas vers un asthme persistant à l'âge scolaire et plus particulièrement vers un asthme allergique sévère (15). Les infections virales précoces et la sensibilisation allergique participent probablement dans le remodelage bronchique et l'évolution vers un asthme sévère (Figure 3).
âge de diagnostic d'asthme non récent 2-6ans 8-11a 12-16ans 2-6ans 8-11a 12-16ans
14 Figure 3. Devenir de l'asthme à l'âge scolaire en fonction des phénotypes d'asthme à l'âge préscolaire (15, 16) Figure issue de Just, Pediatr Allergy Immunol. 2015 A gauche Phénotype à l'âge préscolaire (à 3 ans) Mild EVW asthme modéré viro‐induit, NAUW asthme non contrôlé non atopique, AMTV asthme atopique avec multiples facteurs déclenchant
A droite à 5 ans, la probabilité en rouge d’un asthme allergique modéré ou sévère persistant, en bleu la probabilité d’asthme en rémission sans allergie
Le suivi de la cohorte ALSPAC de Manchester a permis également de décrire des phénotypes de l’asthme en fonction de l’âge de début et de l’évolution (Figure 4 A) (17) de l’âge de 6 mois à 16 ans et en fonction de trajectoire de fonction respiratoire (figure 4B-C) (18). Les profils de siffleurs à début précoce « preschool et mild » ainsi que les 3 phénotypes de sifflements persistant avaient une fonction respiratoire altérée avec un rapport de Tiffeneau et des DEMM25-75 plus bas (17).
Comme dans les autres cohortes, la présence d’épisodes sifflant dans la période préscolaire était un facteur de risque de développer un asthme à l’adolescence et à l’âge adulte jeune (17). L’exposition au tabac passif, les épisodes récurrents de sifflements à 3 ans (par exemple suite aux infections virales) et la sensibilisation à au moins un allergène aux tests cutanés allergiques à 3 ans étaient des facteurs de risque de baisse de la fonction respiratoire (VEMS) dès l’âge de 7-8 ans (18).
15 Figure 4. Quatre trajectoires d’évolution de la fonction respiratoire et phénotypes de l’évolution des sifflements entre 6 mois et 16 ans issus de la cohorte ALSPAC (17, 18). En A, les 6 phénotypes d’évolution des sifflements NE aucun sifflement, PSR début préscolaire avec rémission, MCR début préscolaire tardif avec rémission, SAP début à l’âge scolaire persistant, LAP début tardif persistant, CW siffleurs permanents
En B, les 4 trajectoires, et en C le pourcentage d’exposition au tabac passif en fonction du phénotype. Le groupe de fonction respiratoire basse « low persistant » a une surexposition au tabac environnemental durant l’enfance.
Toutes ces études de cohorte suggèrent donc que l’histoire naturelle de la fonction respiratoire est influencée par les évènements survenant pendant la période de croissance, de la naissance à l’adolescence. La BPCO serait une maladie à début pédiatrique. C’est pourquoi, nous nous sommes focalisés sur la période préscolaire qui paraît être une fenêtre d’opportunité thérapeutique.
A
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3. Le concept de Phénotypes
L’analyse de l’ensemble des cohortes d’asthmatiques retrouve une hétérogénéité de la maladie asthmatique. Les différents tableaux d’asthme ont été classés en phénotype à partir des caractéristiques cliniques (âge de début, allergie, exacerbation, facteurs déclenchant, fonction respiratoire, évolution) et biologiques (marqueurs d’inflammation) (19). Cette classification phénotypique peut permettre 1) de prédire l’évolution de la maladie 2) de personnaliser la prise en charge thérapeutique (20). Cependant la classification des asthmes sévères en phénotypes à partir des éléments cliniques seuls ne permet pas de prédire l’évolution de la maladie (21). La tendance actuelle est d’inclure les biomarqueurs et idéalement des marqueurs génétiques et physiopathologiques afin de classer les asthmes en « endotypes ». La classification en endotype prend en compte les mécanismes physiopathologiques de l’asthme, dans le but de permettre une prise en charge thérapeutique plus adaptée et plus personnalisée (22).
Par exemple, chez l’adulte, l’augmentation de taille de la RBM, marqueur d’asthme sévère (23), est également un marqueur de trouble ventilatoire obstructif fixé malgré une corticothérapie systémique (1mg/kg/j IV, 10j) et donc un marqueur de non –réponse à une corticothérapie forte dose (24). La caractérisation de l’inflammation au niveau clinique et du LBA associée aux caractéristiques cliniques peut également permettre chez l’adulte atteint d’asthme sévère de choisir le type de biothérapie en fonction du phénotype/endotype (Tableau 1) (19, 20).
Chez l’enfant, l’analyse en cluster de la cohorte parisienne permet de prédire la bonne réponse à certains traitements en fonction du phénotype. Par exemple, les enfants atteints d’asthme préscolaire du cluster « non atopic uncontrolled wheeze » avaient une mauvaise réponse aux CSI forte dose (25). Deux clusters ont été décrits chez les enfants d’âge scolaire atteints d’asthme sévère, un cluster « asthme sévère avec de multiples allergies » et de multiples exacerbations malgré de fortes doses de CSI et qui seraient de bons candidats aux traitements anti-allergiques et à l’Omalizumab. Pour les enfants du cluster « asthme sévère avec obstruction fixe » à inflammation neutrophilique, un traitement additionnel par macrolide pourrait être proposé (26).
17
Tableau 1. Choix thérapeutiques potentiels en fonction du phénotype clinique des asthmes sévères
4. Physiopathologie de l'asthme et Remodelage bronchique dans l’asthme
L’asthme est une maladie complexe plurifactorielle. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité bronchique et une obstruction bronchique liées à une inflammation et à un remodelage des voies aériennes (27, 28). Les différents mécanismes physiopathologiques impliqués, ainsi que les différentes présentations font de l’asthme, non pas une maladie unique mais un syndrome «asthme».
Inflammation et Unité trophique épithélio-mésenchymateuse (EMTU) Il existe dans l'asthme, une altération de l'épithélium respiratoire qui participe à l'inflammation bronchique chronique. Chez l'asthmatique, la susceptibilité de l'épithélium respiratoire aux agressions (allergène, virus, tabac...) est augmentée puisque son système de barrière physique lié à l'existence de «jonctions serrées» intercellulaires est défectueux. En réponse à une infection par le rhinovirus par exemple, l'épithélium d'asthmatique va produire de manière excessive des médiateurs pro-inflammatoires et des chémo-attracteurs des polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et des lymphocytes, ce qui entretient le phénomène inflammatoire de manière prolongée (29-32). Chez l’enfant asthmatique, la fragilité et les
18
lésions de la barrière épithéliale pourraient être un facteur déclenchant les mécanismes de remodelage bronchique et d’inflammation responsables de changements structuraux du mur bronchique (32).
Il existe en plus, un dysfonctionnement immunitaire avec une surexpression du système Th2 par rapport au Th1 (dont le rôle principal est la défense contre les infections), ce qui majore l'infection virale avec une atteinte sous-épithéliale. L'ensemble de ces phénomènes impliquant l'épithélium, les cellules infiltrant le tissu sous-épithéliale (neutrophiles, éosinophiles, lymphocytes, macrophages...) et le tissu mésenchymateux (la sous-muqueuse ou chorion composé notamment de fibroblastes et de muscle lisse bronchique BSM) forme l'unité trophique épithélio-mésenchymateuse. Cet échange de signaux inflammatoires au sein de l'EMTU va moduler parallèlement le remodelage bronchique lié à une synthèse de facteurs de croissance (33) (Figure 5)
19
Figure 5. Le complexe EMTU (34)
Figure issue de Martinez, Lancet 2013
Les dommages au niveau de l ‘épithélium entrainent un relargage de IL25‐IL33 et TSLP qui activent les lymphocyte NK, mastocytes, PNE et PNB et également stimuler les lymphocytes Thelper T2 (ILC2).
La barrière épithéliale lésée autorise également l’entrée d’antigène qui vont polariser l’immunité Th2. Ces marqueurs d’inflammation Th2 vont contribuer au remodelage bronchique.
Remodelage bronchique RB
Le remodelage bronchique fait partie intégrante du phénotype Asthme Sévère (28). Ce
remodelage bronchique responsable de modifications structurales de la paroi bronchique a été décrit initialement dans les "asthmes fatales" en 1922. Le remodelage bronchique est composé chez l’asthmatique, à des degrés divers selon le type de «syndrome asthme»:
- lésion de l’intégrité épithéliale
- épaississement de la membrane sous-épithéliale (RBM) - néo angiogenèse
20
- hyperplasie et hypertrophie de la masse de muscle lisse bronchique (BSM) (Figure 6). c) d) Figure 6. Le remodelage bronchique chez l’adulte asthmatique (28) A droite a) Adulte non asthmatique A gauche b) Adulte asthmatique G indique Glande sero‐muqueuse, SM muscle lisse bronchique BSM Photo a) b) issues de I. BARA,ERJ 2010 (28) Schéma c) d) issu de Kumar, Robbins Basic pathology (35)
Le remodelage bronchique n’est pas la conséquence de l’inflammation bronchique mais est un phénomène qui se développe en parallèle de l’inflammation puisqu’on décrit des stigmates de remodelage bronchique de manière très précoce, dès l’âge de 26-29 mois alors que les stigmates d’inflammation bronchique ne sont pas encore observés (23, 36-40). Le remodelage bronchique est une caractéristique typique de l’asthme bien que certains paramètres aient également été décrits dans d’autres pathologies respiratoires de l’enfant (41). L’analyse de biopsies bronchiques chez des enfants âgés de 2 à 15 ans, ayant une fibroscopie bronchique pour des symptômes respiratoires, a montré que l’altération de l’épithélium bronchique, ainsi que l’épaississement de la membrane basale (RBM) étaient présents seulement chez les enfants asthmatiques contrairement aux enfants atopiques non asthmatiques et aux enfants
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non atopiques non asthmatiques (42). La relation entre altération de l’intégrité de l’épithélium bronchique et sévérité, inflammation ou atopie sont controversées (42, 43).
L’épaississement de la RBM est une caractéristique fondamentale du remodelage bronchique chez l’enfant scolaire et l’adulte atteint d’asthme (44, 45) mais peut chez l’enfant préscolaire être présent (42, 46, 47) comme absent (36, 39). Son lien avec la sévérité de l’asthme (VEMS, nombre d’exacerbations) reste controversé (39, 44, 48, 49). Pour certain, le RBM a également une valeur prédictive d’asthme persistant après 3 ans, et est corrélé à l’inflammation bronchique (FeNo bronchique, inflammation à PNE) (38).
La néoangiogénèse était observée chez les enfants asthmatiques et les enfants atopiques non
asthmatiques (42) (Figure 7). La néoangiogénèse serait corrélée à une altération de la fonction respiratoire et à la sévérité de l’asthme à l’âge scolaire (40).
Figure 7. Lésions épithéliales, épaississement de la membrane basale et néoangiogénèse chez l’enfant asthmatique (42)
A gauche une biopsie de bronchique chez un enfant asthmatique
A droite une biopsie bronchique chez un enfant non atopique, non asthmatique
Les flèches au sommet montrent l’altération de l’intégrité de l’épithélium bronchique. Les doubles flèches indiquent l’épaississement de la membrane basale. En A et B, les vaisseaux sont colorés pas IHC en marron. En C et D, les PNE sont colorés par IHC en rouge.
La transition épithélio-mésenchymateuse EMT
La cellule du muscle lisse bronchique (CML) a une grande plasticité phénotypique lui permettant de passer d’un phénotype prolifératif à contractiles ou sécrétant et inversement (50). La CML peut donc changer de phénotype pour devenir un myofibroblaste aux propriétés circulantes, sécrétrices de composants de la matrice extracellulaire et contractiles (51). Cette plasticité phénotypique va être régulée par les facteurs environnementaux tels que MEC, TGFß, PDGF (50).
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Les fibroblastes circulant, en présence d’épithélium bronchique, vont également contribuer au remodelage bronchique. In vitro, la co-culture avec des cellules épithéliales BEC issus d’adultes atteint d’asthme entrainait une augmentation de la sécrétion de MEC. La co-culture avec des BEC asthmatiques entraine également une transformation des fibroblastes circulant en myofibroblastes (52).
Ce changement de phénotype cellulaire correspond à la transition épithélio-mésenchymateuse et va contribuer au remodelage bronchique.
5. Remodelage musculaire bronchique et sévérité de l’asthme
Nous nous sommes intéressés plus particulièrement au muscle lisse bronchique BSM puisque le remodelage musculaire bronchique a un rôle majeur dans la fonction respiratoire. Il est corrélé au déclin de la fonction respiratoire à l'âge adulte (53) et non à la durée d’évolution de la maladie asthmatique (54). Le remodelage musculaire est également associé à l'hyperréactivité bronchique. Chez l’adulte comme chez l’enfant d’âge scolaire (> 5 ans), l'importance du remodelage musculaire est liée à la sévérité de l'obstruction bronchique (43, 53, 55). Ainsi, plus la masse musculaire bronchique est importante, plus l'obstruction bronchique est sévère et plus le VEMS (volume expiratoire maximale par seconde) est diminué (Figure 8). Figure 8. Corrélation entre Surface de muscle lisse bronchique et VEMS L'importance du remodelage musculaire est corrélée à la sévérité de l'obstruction bronchique En A chez l’enfant asthmatique sévère (Tillié‐Leblond, Allergy 2008) (43) En B chez l’adulte asthmatique, d 'après Kaminska; JACI 2009) (53) VEMS (%th) A B
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Chez l'enfant, il a été démontré que la présence de ce remodelage bronchique, notamment l'augmentation de la masse de BSM, était associée à un asthme plus sévère avec un tableau d'obstruction bronchique persistante et un VEMS abaissé (43) (Figure 8 et 9).
Figure 9. Remodelage bronchique chez l'enfant de 5 à 14 ans
ASM airway smooth muscle (d'après Tillié‐Leblond, Allergy 2008) (43)
A gauche, un asthme avec un trouble ventilatoire obstructif fixé et une augmentation de la taille du BSM. A droite, un asthme avec une obstruction réversible.
Le remodelage musculaire bronchique se caractérise chez l’asthmatique par :
- une altération et augmentation du dépôt de protéines composant la matrice extracellulaire (MEC) dans et autour du muscle lisse bronchique BSM,
- une augmentation de la taille du BSM (hypertrophie),
- une augmentation du nombre de cellules du muscle lisse bronchique CML (hyperplasie) (28).
6. Place de la cellule du muscle lisse bronchique CML dans l’asthme
La cellule du muscle lisse bronchique CML a plusieurs rôles chez le sujet sain et surtout dans la physiopathologie de l’asthme.
Dans l’embryogénèse, la CML est connue pour contribuer au « branching » de l’arbre bronchique (56, 57).
La CML, cellule effectrice de la contraction et de la réactivité bronchique participe au remodelage des voies aériennes par ses propriétés de synthèse de médiateurs pro-inflammatoires et de prolifération (27, 28, 51, 58, 59).
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La CML a une grande plasticité phénotypique: elle est sécrétrice de médiateurs chimiotactiques pour les mastocytes et éosinophiles et de médiateurs de l'inflammation tel que le TGF-β (27). Elle produit des éléments de la matrice extracellulaire tels que le collagène, la fibronectine, laminine, etc...(27, 60). La CML peut également avoir un phénotype migrant: elle peut se dédifférencier pour migrer vers la matrice extracellulaire où elle devient un myofibroblaste (50, 60).
La CML est considérée comme une cellule inflammatoire à part entière (61). Elle
contribue à une boucle d’auto-activation impliquant les mastocytes et la production de cytokines (CXCL10, IP 10, CX3CL1, Fraktalkine) (62-64). Les mastocytes sont attirés par les CML et infiltrent préférentiellement les CML dans l’asthme fatal comme dans l’asthme non fatal (65). Les CML vont stimuler leur survie et prolifération (66, 67). L’activation mastocytaire et la dégranulation des mastocytes peut être allergène-dépendant ou non (68) et peut être responsable d’un dépôt extracellulaire important de produits de l’inflammation, ce qui peut faciliter l’augmentation de la masse de BSM et donc l’HRB (61, 69-71).
Les lymphocytes participent également au remodelage musculaire (72).
L’inflammation chronique bronchique cause des lésions qui font le lit de mécanismes de réparations répétées. Le remodelage bronchique avait initialement été considéré comme une mauvaise cicatrisation bronchique secondaire aux lésions et réparations incomplètes. Mais actuellement, on considère que l’inflammation et le remodelage bronchique sont 2 phénomènes qui évoluent en parallèle puisque le remodelage bronchique peut être observé de manière très précoce en absence d’inflammation (73).
La CML va contribuer à l’altération de la matrice extracellulaire MEC
La MEC autour de chaque CML est augmentée et peut être altérée dans l’asthme (61, 74, 75). Dans certaines études, le profil de protéines composant la MEC est différent entre un sujet sain et asthmatique. Il a été montré que les CML non asthmatiques, in vitro, synthétisent des protéines de la MEC telles que la fibronectine, perlecan, le collagène I, III, IV et V, versican et decorin alors que les CML asthmatiques synthétisent plus de collagène I-III, plus de fibronectine, plus de perlecan et moins de collagène IV (76, 77). L’augmentation de MEC serait également liée à un déséquilibre entre métalloprotéase de la matrice (MMP) et inhibiteur des MMP (TIMP) en terme de quantité et de composition (type d’enzyme) (28, 50).
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ADAM 33 est d’ailleurs un gène codant pour une désintégrine et une métalloprotéase, situé dans le chromosome 20p13 dont certains polymorphismes sont associés au déclin plus précoce de la fonction respiratoire dans l’asthme chez l’enfant (78).
Cependant, in vivo, ces résultats sont controversés avec une absence de différence dans la composition de la MEC après analyse des biopsies bronchiques des asthmatiques adultes peu sévères « mild » et non-asthmatiques adultes (79). De plus, la densité et la variété de la MEC ne sont pas associées à une altération de la fonction pulmonaire sauf chez les asthmatiques. Chez les asthmatiques, la composition de la MEC et la densité par exemple en collagène I était corrélée à l’HRB à la métacholine, mais pas aux paramètres de la fonction respiratoire telle que le VEMS, ou les résistances. Cette relation entre structure et fonction était ici liée au BSM et non à la MEC (80). Au sein de la MEC, il y a des facteurs de croissance dont certains sont produits par les CML. Par exemple, le TGF-ß qui est sécrété par les CML après dégranulation mastocytaire, va être activé par le MMP-9 et va induire une production de Fibronectine et collagène I par les CML (64).
La MEC peut également contribuer au changement de phénotype de la CML (81-83).
L’hypertrophie du BSM est corrélée à la sévérité de l’asthme et non à la durée d’évolution
avec une augmentation en terme de volume, d’épaisseur et de longueur du BSM et des CML que ce soit dans les grosses comme les petites voies aériennes (54, 61, 84). L’analyse des biopsies bronchiques retrouve des CML de diamètre supérieur chez les patients asthmatiques par rapport aux non-asthmatiques et de taille supérieure chez les asthmes sévères (84).
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Figure 10. Mécanismes du remodelage musculaire bronchique chez l’asthmatique adulte (28) EMT epithelial mesenchymal transition : transition épithélio‐mésenchymateuse ECM deposition : dépôt de matrice extracellulaire BSM muscle lisse bronchique
Chez l’asthmatique adulte, associée à l’hypertrophie des CML, il existe une hyperplasie du
BSM c’est à dire une augmentation du nombre de CML (54, 85). Les mécanismes impliqués
dans l’augmentation de prolifération cellulaire sont multiples.
De nombreux stimuli inflammatoires dont les cytokines des voies Th1, Th2 et Th17 (TNF-α, IL-4, IL-5, IL-13, TGF-ß, TSLP, IL-6) jouent un rôle dans l’augmentation de la prolifération et la régulation de l’apoptose (27, 28, 86, 87). Ces cytokines ont une action sur les voies de signalisation ERK1/2, MAPK, NFκB. L’ensemble de ces médiateurs ne peut pas expliquer complètement la prolifération des CML dans l’asthme.
En effet, l’ augmentation du nombre de CML est associée in vitro à une augmentation de la capacité de prolifération des CML humaines issues de biopsies bronchiques d’adultes asthmatiques par rapport à des CML d’adultes non-asthmatiques (88-91) et à une diminution de l’apoptose (92, 93). In vitro, l’exposition à des facteurs environnementaux tel que les extraits d’acariens ou la fumée de cigarette peut augmenter la prolifération des CML (89, 94). Il existe un mécanisme propre à la CML permettant d’augmenter sa prolifération indépendamment des facteurs extérieurs.
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7. Mitochondrie et asthme
Chez l’adulte, la prolifération des CML d’asthmatiques est en partie associée au métabolisme mitochondrial (88, 91). La structure mitochondriale, à travers la régulation de la fission/fusion, la biogénèse mitochondriale, la destruction mitochondriale (mitophagie) et la présence de radicaux libres tels que l’anion superoxyde ROS (espèces réactives oxygénées), sont impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire et l’apoptose (88, 94).
La mitochondrie est une organite cellulaire fondamentale pour le fonctionnement de la cellule en terme de production d’énergie et de capteur d’oxygène mais elle a également un rôle insolite dans des mécanismes physio- pathologiques influençant la structure et la fonction des voies aériennes (95).
La mitochondrie peut répondre aux besoins cellulaires énergétiques via la synthèse d’ATP à partir du métabolisme du glucose et des acides gras. Elle est formée de 2 membranes : une membrane externe et une membrane interne permettant de délimiter 3 espaces : espace inter-membranaire, matrice et cytosol. La membrane externe est composée de porines qui sont des protéines «canal» ou Voltage Dependant Anion Channel VDAC perméables aux molécules hydrosolubles de moins de 10 kDa. La membrane interne contient les complexes de la chaîne de transports d’électrons et enzymes de la phosphorylation oxydative. La matrice mitochondriale contient l’ADN mitochondrial, les enzymes nécessaires à la ß-oxydation et au cycle de Krebs. La respiration mitochondriale produit des ROS potentiellement délétères en excès. Les ROS ont la capacité d’agir comme transducteur de signal et donc de stimuler des cytokines pro-inflammatoires, de moduler des facteurs de transcription impliqués dans le cycle redox, la prolifération/apoptose, l’homéostasie calcique de l’épithélium et CML bronchiques, la réponse inflammatoire, la sécrétion de matrice extracellulaire (96-98).
28 Figure 11. Structure et fonctions bioénergétiques de la mitochondrie dans une CML (95) Issue de Prakash, Chest 2017 La mitochondrie est formée d’une membrane externe en contact avec le cytoplasme et d’une membrane interne qui forme des crêtes mitochondriales composés de la chaîne de transporteurs d’électron et de la chaîne de phosphorylation oxydative et l’ADN mitochondrial. La respiration mitochondriale produit des ROS. Les agressions telles que la cigarette et l’inflammation vont influencer les éléments de la respiration mitochondriale (avec pour conséquence une altération de l’intégrité de l’ADN mitochondriale, régulation du Ca2+
intracellulaire, prolifération cellulaire, apoptose), ce qui en réponse va entraîner une modification de la structure et de la fonction mitochondriale.
Dans les CML d’asthmatiques adultes, l’augmentation de [Ca2+]
cytoplasmique est associée à une
augmentation de masse mitochondriale secondaire à une augmentation de la biogénèse mitochondriale, à une augmentation de la respiration mitochondriale, et contribue à la contractilité et la prolifération des CML (88).
La fonction de la mitochondrie est dépendante de la régulation du [Ca2+]
mitochondriale, et
également de la morphologie du réseau mitochondrial. Le « réseau mitochondrial » est régulé par des protéines impliquées dans la fusion et la fission. La fusion mitochondriale grâce aux protéines mitofusine Mfn-1, Mfn-2 sur la membrane externe mitochondriale, et OPA-1 sur la membrane interne (99). Leur rôle est d’aider les mitochondries à fusionner entre elles pour former une chaîne continue de mitochondries. La fission mitochondriale est régulée par les facteurs Fis-1, Mff (mitochondrial fission factor), MiD49 et MiD51et Drp-1 (cytosolic dynamin related protein) permettant le clivage d’une mitochondrie en 2, ce qui permet d’augmenter le nombre de mitochondries (Figure 12) (100).
29 Figure 12. Régulation du réseau mitochondrial (95) D’après Prakash, Chest 2017 CS fumée de cigarette, ROS espèces oxygénées réactives/radicaux libres
On observe un réseau mitochondrial fragmenté dans la glycolyse alors que le réseau «fusionné» est plutôt présent dans la phosphorylation oxydative. Par exemple, la cigarette sur des CML humaines non-asthmatiques entraine une augmentation de la fragmentation du réseau mitochondriale avec une augmentation de Drp-1 et diminution de Mnf-2 responsable d’une diminution de la respiration mitochondriale (phosphorylation oxydative) et augmentation de la glycolyse (94).
La mitochondrie joue un rôle dans la prolifération cellulaire mais également dans l’apoptose cellulaire. L’apoptose qui est la mort cellulaire programmée passe par 2 voies de signalisation : la voie extrinsèque et la voie intrinsèque dite mitochondriale.
La voie extrinsèque est déclenchée par la liaison de ligands de mort de type FAS (FAS-1) ou de la famille du TNF (Tumor necrosis factor) aux récepteurs de mort spécifique (101). Cette activation entraine un signal activateur des caspases médiatrices (caspases 2, 8, 9, 10) qui vont à leur tour activer les caspases effectrices (caspases 3, 6, 7) (102). Au niveau mitochondriale, lorsque la membrane externe est perméable, le cytochrome C est libéré et va débuter la cascade vers l’apoptose. Le cytochrome C va s’associer à la protéine Apaf-1. Ce complexe va s’associer à la pro-caspase 9 pour former l’apoptosome qui va ensuite activer les
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autres pro-caspases. La perméabilité des pores mitochondriaux est régulée par les protéines apoptotiques comme BAX et anti-apoptotique comme Bcl-2. Les signaux pro-apoptotiques sont nombreux soient provenant de la cellule soient de l’environnement extérieur (103). P53 protéine impliquée dans la régulation du cycle cellulaire et dans la régulation de l’apoptose est surexprimée dans la CML d’asthmatique alors que sa dégradation (via la formation du couple P53/Mdm2) est augmentée chez les contrôles (91). Les travaux de notre laboratoire ont démontré que P53 dans la CML de contrôle avait une action inhibitrice de la prolifération en inhibant PGC-1α et TFAM (facteur de transcription de la biogénèse mitochondriale) et donc en diminuant la densité mitochondriale. Alors que dans la CML d’asthmatique, P53 présentait une dysfonction sélective avec une incapacité à inhiber PGC-1α et TFAM, responsable d’une prolifération des CML augmentée (91).
Figure 13. Proposition de régulation de la densité mitochondriale par P53 (91)
Il y a une dysfonction de P53 dans la CML d’asthmatique responsable d’une absence d’inhibition des facteurs de transcription de la biogénèse mitochondriale PGC‐1α, ce qui entraine une prolifération cellulaire augmentée.
La mitophagie est un processus spécifique de régulation de la quantité et du bon fonctionnement des mitochondries notamment lorsque les mitochondries sont endommagées et lorsqu’il faut réduire le nombre de mitochondries au sein du réseau (104). L’autophagie est un processus aspécifique de dégradation des composants cellulaires grâce au lysozyme cellulaire. La formation d’une membrane cytoplasmique autour des organelles à détruire forme l’autophagosome qui au contact du lysozyme , va permettre la dégradation et le recyclage de certains composants cellulaires (105). Un des marqueurs de l’autophagie est la protéine LC3 (106).
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Donc la mitochondrie a un rôle prépondérant dans le métabolisme cellulaire, particulièrement dans la CML. En effet, la mitochondrie chez l’adulte asthmatique est une cible thérapeutique potentielle. Trian et al. ont démontré que dans la CML d’asthmatique adulte, la diminution de la biogénèse mitochondriale entrainait une diminution de la prolifération des CML (88).
8. Thérapeutique et remodelage bronchique (Tableau 2)
Le remodelage bronchique ne répond pas aux nouvelles thérapeutiques spécifiques de l'asthme (55).
La corticothérapie inhalée CSI quotidienne est le traitement de premier intention dans la
prise en charge d’un asthme persistant (107). La CSI est efficace sur le contrôle de l’asthme et la fonction respiratoire (VEMS, DEMM25-75, HRB, réversibilité post-bronchodilatateur BDR)
mais ne semble pas avoir d’effet sur le remodelage bronchique (108, 109) ni sur l’évolution naturelle de l’asthme (110-114). La CSI est efficace sur l’inflammation avec notamment une diminution de l’inflammation éosinophilique (109, 115, 116) mais concernant le remodelage bronchique, les résultats des études sont contradictoires. Par exemple, la corticothérapie forte dose à court terme permettrait une diminution du mur bronchique au scanner (117) mais pas à long terme (118). Pour certains, les CSI diminuent le dépôt de composant de la MEC (119, 120), alors que dans d'autres études, la CSI à court terme comme à long terme n'entrainait aucune modification de la RBM (40, 108, 121).
L’effet des CSI sur le BSM est également controversé. Chez l’adulte, certaines études évoquent une réduction de la taille du BSM sous CSI (500 µg équivalent fluticasone/j) pendant 6 semaines notamment dans les voies aériennes distales (108, 119, 120).
Les bronchodilatateurs de longue durée d’action LABA (formotérol ou salmétérol) en association avec les CSI dans le modèle équin permettent une amélioration de la fonction respiratoire (résistances), une diminution du BSM dans les voies aériennes périphériques associée à une diminution du dépôt de collagène dans le MEC. Alors que chez l’adulte asthmatique, les CSI seuls et en association avec un LABA (budésonide 400µg+formotérol 12µg x2/j) montraient une diminution de l’inflammation de la réversibilité post-bronchodilatateur et une diminution de HRB mais ne montrait pas de diminution de la masse de BSM. Par contre, il y avait une diminution de myofibroblastes parallèle à une augmentation de la taille du BSM, ce qui suggérait une action des CSI +/- LABA sur la
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transition épithélio-mésenchymateuse (122). In vitro, les CSI permettent une diminution de la prolifération des CML de patients non-asthmatiques via le récepteur C/EBα. Ce récepteur C/EBPα est absent au niveau des CML d’asthmatiques ce qui explique a non-efficacité des CSI sur l’inhibition de prolifération (115).
Les thérapeutiques actuelles ne semblent pas avoir d’effet sur le remodelage bronchique (123). Or, cibler le muscle lisse bronchique pourrait être une alternative pour tenter de modifier l’évolution de la fonction pulmonaire.
En effet, la thermoplastie dont le principe est de diminuer la taille du BSM par radiofréquence via la voie endoscopique montre une persistance de la diminution de la taille du BSM sur les biopsies bronchiques à 2 ans de suivi (124) et une amélioration du contrôle de l’asthme à 3 ans de suivi avec diminution du nombre d’exacerbations, du nombre d’hospitalisation et du nombre de consultations aux urgences pour crise d’asthme chez l’adulte atteint d’asthme sévère réfractaire au traitement (125).
L’Omalizumab, biothérapie anti-IgE empêchant la fixation des IgE sur leur récepteur à haute
affinité FcεRI, a montré une efficacité considérable sur le contrôle de l’asthme (qualité de vie, nombre d’exacerbations), mais également sur la fonction respiratoire dès 4 mois après la mise en place du traitement (126-128). Chez l’adulte, l’Omalizumab a un effet sur l’inflammation et sur le remodelage bronchique. L’Omalizumab permet dès 4 mois de traitement une diminution de l’épaisseur du mur bronchique, une augmentation de la lumière bronchique au scanner, corrélés à l’amélioration du VEMS (129, 130). Dans certaines études, l’amélioration du VEMS était corrélée à la réduction de l’épaisseur du mur bronchique et l’épaisseur du mur bronchique était corrélée à l’inflammation éosinophilique dans les crachats (129, 130). A 1 an de traitement par Omalizumab chez l’adulte, il semble y avoir une diminution du remodelage bronchique avec une diminution du RBM et de l’infiltration éosinophilique sur les biopsies bronchiques (131). In vitro, l’Omalizumab (à une concentration de 1µM) a une action anti-proliférante sur les CML d’asthmatiques en présence de sérum de patients asthmatiques non allergiques comme allergiques non asthmatiques ou asthmatiques allergiques (132).
L’effet de cette molécule sur le remodelage bronchique chez l’enfant n’a pas été étudié. De plus, l’Omalizumab n’a l’AMM dans l’asthme sévère allergique de l’enfant qu’à partir de l’âge de 6 ans (soit chez les enfants d’âge scolaire) avec une sensibilisation à au moins un pneumallergène perannuel (moisissures, acariens).
Peu d'études ont été réalisées sur le remodelage musculaire bronchique à l'âge préscolaire alors que la CML semble jouer un rôle prépondérant dans la sévérité de la maladie
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asthmatique et le déclin de la fonction respiratoire. Les mécanismes régissant ce remodelage bronchique dans l'enfance sont encore mal connus.
Pour une meilleure prise en charge de l’asthme et surtout pour tenter de modifier l’évolution de la maladie asthmatique et donc de la fonction pulmonaire, la connaissance physiopathologique du remodelage bronchique semble essentielle.
C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à étudier des agents pharmacologiques capables de moduler la taille du BSM chez l’enfant préscolaire.
Tableau 2. Cibles thérapeutiques des traitements actuels et leurs effets sur le remodelage bronchique (133)
Les ß2‐mimétiques ciblent les récepteurs ß2 adrénergiques avec un effet limité sur le RB. En combinaison avec les CSI, ils limitent l’angiogenèse et la prolifération des fibroblastes.
Les CSI ciblent les récepteurs aux glucocorticoïdes. En combinaison avec les ß2‐mimétiques, ils limitent l’angiogenèse, ont une action anti‐proliférative sur les CML et les fibroblastes, réduisent la sécrétion de mucine et le dépôt de composants de la MEC.
Les anti‐leucotriènes ciblent les CysLT‐récepteurs et ont un effet modéré sur les CML, les cellules glandulaires et le dépôt de collagène sous‐épithélial. Ils diminuent l’accumulation de fibroblastes dans les poumons.
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35
II.
OBJECTIFS
L’objectif principal de ce travail était d’étudier le remodelage bronchique dans l’asthme sévère préscolaire de l’enfant et d’étudier son rôle dans la sévérité du tableau clinique. Pour cela, nous avons divisé notre travail en 4 parties.
A. Description d’une cohorte d’enfants d’âge préscolaire atteints d’asthme sévère
Afin de
- D’étudier l’incidence du remodelage bronchique précoce,
- Puis de caractériser des phénotypes d’asthme sévère préscolaire grâce à l’endoscopie bronchique et la réalisation de biopsie bronchique. (Article 1)
B. Etude du remodelage bronchique précoce chez l’enfant asthmatique d’âge préscolaire
Afin de
- D’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ce remodelage bronchique,
- D’étudier la relevance clinique de ce remodelage bronchique. (Article 2)
C. Comparaison des différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le remodelage bronchique chez l’adulte et chez l’enfant asthmatique
- En comparant la prolifération de CML humaines asthmatiques et non asthmatiques, matures et immatures (Research letter),
- En étudiant l’effet de l’environnement sur la prolifération cellulaire (Research letter), - En étudiant le remodelage bronchique dans un modèle murin asthmatique adulte et
enfant. (Article 4)
D. Etude d’agents pharmacologiques modulant le remodelage bronchique
- En étudiant l’effet de traitements anti –asthmatiques sur la prolifération des CML humaines d’enfants, in vitro (Article 5),
- En étudiant dans un modèle murin immature d’asthme, le remodelage bronchique et sa modulation in vivo après utilisation d’agents thérapeutiques (Article 4).
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III.
MATERIELS ET METHODES
A. Population
Enfants âgés de moins de 12 mois, groupe « nourrissons témoins» Les tissus bronchiques ont été obtenus à partir de pièces opératoires issues d’enfants âgés de moins de 12 mois, après recueil d’un consentement parental libre, écrit éclairé:
- soit vivants, lors d’une chirurgie thoracique pour malformation pulmonaire (malformation adénomatoïde kystique pulmonaire, atélectasie, kyste bronchogénique, etc.),
- soit post-mortem, chez des nourrissons décédés brutalement (mort subite du nourrisson, accident de la voie publique)
Enfants d’âge préscolaire
Les enfants étaient inclus dans le protocole de recherche clinique «P’tit asthme» d’Avril 2012 à Octobre 2015. Ce protocole a fait l’objet d’un PHRC inter-régional (numéro de PHRC n° B101222-30; 2010-A01134-35) au sein des hôpitaux des enfants des CHU de Bordeaux et de Toulouse, avec accord du Comité de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outre-mer III (signé le 15/12/2010).
Les critères d’inclusion du groupe «asthme enfant» étaient: ‐ un âge entre 1 et 4 ans;
‐ un asthme persistant sévère selon les critères de l’ATS (American Thoracic Society) [annexe 1].
Pour le groupe «témoin enfant», étaient inclus les enfants: - âgés de 1 à 4 ans;
- ayant recours à la chirurgie thoracique (malformation adénomatoïde kystique pulmonaire, atélectasie, dilatations des bronches, etc.);
- ou à l’endoscopie bronchique (inhalation de corps étrangers, exploration de dilatation de bronche, suspicion de dyskinésie ciliaire, arc vasculaire compressif, etc.);
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- en absence d'allergie ou d'atopie personnelle. Les critères de non-inclusion étaient:
‐ une exacerbation asthmatique ayant nécessité une hospitalisation dans les 3 semaines précédant la fibroscopie pour le groupe «asthme»;
‐ une infection des voies aériennes supérieures ou inférieures virale ou bactérienne ou toute autre infection ORL avec fièvre (température > 39°C) dans les 4 semaines précédant la fibroscopie bronchique;
‐ l’existence de comorbidités associées (mucoviscidose, prématurité inférieure à 32 semaines d’aménorrhée, cardiopathie, etc.);
‐ l’existence de malformations bronchiques (la non-inclusion était faite a posteriori); ‐ une contre-indication à l’endoscopie ou à l’anesthésie générale: coagulopathie,
absence de jeûne… Adultes
Les patients avaient été inclus dans le protocole de recherche clinique «Remodel' asthme» ayant fait l’objet d’un PHRC au sein du CHU de Bordeaux, après accord du Comité de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outre-mer III et «COBRA», après recueil d’un consentement éclairé et signé du patient.
Etaient considérés comme faisant parti du groupe «asthme adulte», les adultes âgés de plus de 18 ans présentant un asthme sévère selon les critères ATS [annexe 2].
Les adultes inclus dans le groupe «témoin adulte» étaient non-asthmatiques, non-atopiques mais présentaient une pathologie pulmonaire indiquant une chirurgie thoracique ou une endoscopie bronchique (cancer broncho-pulmonaire, BPCO, pneumopathie interstitielle, fibrose pulmonaire, etc.).
Les critères de non-inclusion étaient:
‐ la non prise en charge par la sécurité sociale;
‐ les sujets sous sauvegarde de justice, sous tutelle, sous curatelle; ‐ les sujets privés de liberté par décision judiciaire ou administrative; ‐ les majeurs protégés par la loi;
‐ les antécédents d’infections chroniques (VIH; hépatites); ‐ les antécédents d'aspergilloses.
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B. L’épithélium bronchique
Obtention du tissu épithélial
Les cellules de l’épithélium bronchique étaient obtenues à partir de tissus bronchiques issus soit d’une dissection bronchique sous microscope, soit d’un brossage ciliaire réalisé sous endoscopie. Pour cette dernière, une analyse de la morphologie et de la mobilité ciliaire était réalisée en anatomopathologie dans le but d’éliminer des arguments en faveur d’une dyskinésie ciliaire primitive.
Les cellules épithéliales issues de brossage étaient conservées dans un «milieu DMEM 10% + fungizone» (Tableau 3) pour le transport vers le laboratoire à température ambiante. Le prélèvement contenant les cellules épithéliales en suspension et le matériel de brossage était ensuite centrifugé (1500 tours /min, pendant 5 minutes, à 4°C).
Le culot cellulaire obtenu était remis en suspension et homogénéisé dans un milieu « Pneumacult-ex » (tableau 3 et 5) pour être ensuite transvasé dans des flasques de culture de 150 cm² et incubé à 37°C, sous une atmosphère enrichie à 5% de CO2.
Les cellules épithéliales issues de la dissection de pièce opératoire étaient obtenues grâce à la mise en culture d’explants d’épithélium mis en culture de manière identique aux cellules épithéliales en suspension précédemment décrite. Le milieu de culture a été changé toutes les 48-72 heures.
40 Tableau 3. Composition des milieux de culture Tableau 4. Liste des composants utilisés pour la culture cellulaire
Différenciation de l’épithélium respiratoire
Le tapis de cellules épithéliales ainsi obtenu dans les flasques de culture était issu uniquement de la prolifération des cellules basales de l’épithélium. Afin de reconstituer un épithélium bronchique, pseudo-stratifié et composé de cellules ciliées et à mucus, les cellules épithéliales
Milieu DMEM 0% Volume
Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose 450 mL MEM non‐essential amino acid solution 100x 5 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Milieu DMEM 2% Volume
Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose 450 mL
Fetal bovine serum 10 mL
MEM non‐essential amino acid solution 100x 5 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Milieu DMEM 10% Volume
Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose 450 mL
Fetal bovine serum 50 mL
MEM non‐essential amino acid solution 100x 5 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Produits Fournisseur Références
Antibiotics antimycotic solution 100x Sigma A5955 Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose Sigma D0822 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8537
DMSO diméthylsulfoxyde Sigma 276855
Fetal bovine serum Gibco 10270
Héparine solution 2mL Stemcell 7980
MEM non‐essential amino acid solution 100x Sigma M7145
Penicillin‐Streptomycin Sigma P4333
Pneumacult ALI basal medium Stemcell 5002 Pneumacult ALI10x supplement Stemcell 5003
Pneumacult Ex medium Stemcell 5009
Pneumacult ex10x supplement Stemcell 5019
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étaient placées sur des inserts de culture en interface air-liquide comme précédemment décrit (134). Pour cela, les cellules épithéliales confluentes étaient soumises à un passage grâce à une solution trypsine-EDTA (Sigma Aldrich, Saint-Louis, Missouri, Etats-Unis) après deux étapes de rinçage au DPBS Dulbecco’s phosphate buffer saline, (Sigma Aldrich).
La suspension cellulaire contenant la trypsine était transvasée dans un flacon stérile contenant du « milieu DMEM 10% » (tableau 3) et centrifugée pendant 5 minutes à 1500 rotations par minute et à 4°C. Le culot cellulaire obtenu était remis en suspension et homogénéisé et un décompte cellulaire était effectué grâce à une cellule de Newbauer. Un nombre fixe de cellules était déposé sur des inserts de culture (200 000 cellules sur des inserts de plaque 12 puits et 100 000 cellules pour des inserts de plaque 24 puits). Les cellules étaient alors placées en milieu «basal pneumacult-ex» au pôle apical et basal de l’insert jusqu'à l’obtention d’une couche de cellules confluentes sur l’insert. Les inserts étaient ensuite placés en interface air-liquide en retirant le milieu du pôle apical et en remplaçant le milieu basal par un milieu de culture dit «ALI». La différentiation de l’épithélium était obtenue après un minimum de 3 semaines de culture en condition ALI (Tableau 5).
Tableau 5. Composition des milieux de culture
Pneumacult ALI complet Volume
Pneumacult ALI 450 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Pneumacult ALI10x supplement 50 ml
Pneumacult‐EX basal médium complet Volume
Pneumacult‐EX basal médium 490 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Milieu basal Pneumacult ‐ex
Pneumacult‐EX basal médium complet 25 mL
Aliquot supplemental 500 µL
Hydrocortisone 25 µL
Milieu ALI Volume
Pneumacult ALI complet 50 mL
Héparine 2mg/mL 100 µL
Hydrocortisone 250 µL
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Phénotype épithélium
Le contrôle de la bonne différenciation de l’épithélium respiratoire était réalisé par technique d’immunophénotypage et immunofluorescence indirecte (microscope à épifluorescence NIKON TE2000-E et tête confocale D-Eclipse-C1) après avoir marqué les cellules à mucus grâce à des Ac de souris anti-MUC5AC (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et les cellules ciliées avec des Ac de lapin anti-β-tubuline. Les Anticorps secondaires utilisés étaient des Ac anti-souris ALEXA 568(GAM Alexa 568, Invitrogen, Carslbad, Californie, Etats-Unis) et Ac anti-lapin ALEXA 488 (GAR Alexa 488, Invitrogen).
Photo 1. Immunophénotypage épithélial En vert, le marquage positif pour β‐tubuline En rouge, le marquage positif pour MUC 5‐AC
Surnageant épithélial
Les cellules épithéliales bronchiques différenciées ont été stimulées pendant 24h au niveau du pôle apical cellulaire avec soit:
‐ du milieu ALI seul
‐ du milieu ALI contenant du rhinovirus sérotype16 (Multiplicity Of Infection MOI 0.1) soit 10 000 virions/insert (135)
