Matériels et méthodes
C. La cellule du muscle lisse bronchique
‐ du milieu ALI contenant des extraits allergéniques d’acariens D.pteronyssinus (Dpter) (Stallergènes, Antony, France)
‐ du milieu ALI contenant du rhinovirus et des extraits allergéniques de Dpter.
Nous avons utilisé du rhinovirus sérotype 16 fourni par le Dr Brian Oliver du Respiratory Research Group de Sydney.
Avant de stimuler l’épithélium, le milieu ALI était remplacé pendant 48h par un milieu ALI sans hydrocortisone.
Le milieu d’infection contenait du ‐ DMEM 2%
‐ 0.5x106 virions/mL
Puis l’épithélium était exposé au milieu d’infection pendant 1h à 37°C.
Le surnageant produit au pôle basal était alors collecté après 24h de stimulation et stocké à -80°C. Le surnageant obtenu après une infection rhino-virale était préalablement placé pendant 15 minutes sous une lampe à ultra violet pour inactiver le rhinovirus en détruisant son ARN.
C. La cellule du muscle lisse bronchique
Les prélèvements de tissus bronchiques ont été réalisés soit à partir de dissections de bronches en zone de poumon sain, obtenues après lobectomie ou pneumectomie, soit à partir de fibroscopies bronchiques pour les CML.
Microscopie optique
Les biopsies bronchiques ont d’abord été fixées dans le formaldéhyde pour le transport vers le laboratoire d’anatomopathologie du CHU de Bordeaux, site Haut-Lévêque, service du Pr Begueret. La coloration des coupes de biopsies bronchiques en microscopie optique a été réalisée en HES (hématotoxiline, éosine, safran) et en immuno-histochimie sur des coupes de 3µm d’épaisseur. La procédure de coloration a été faite grâce à un automate (Bond-III TM, Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, Royaume-Uni)
La liste des anticorps utilisés est décrite dans le tableau 6.
Les biopsies sont visualisées grâce au logiciel NDP NanoZoomer Digital Pathology (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japon).
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Tableau 6. Liste des anticorps utilisés pour les analyses en histologie
Etude du remodelage (cf article 1)
L’étude du remodelage bronchique a été réalisée grâce au logiciel ImageJ software version 1.40g (Fuji. Domaine publique Java http://rsb.info.nih.gov/ij/). Le comptage cellulaire a été fait grâce au logiciel ImageJ. L’intégrité de l’épithélium bronchique a été évaluée en faisant le rapport entre mesure de l’épithélium totale de la biopsie sur mesure de la sous-muqueuse. La taille de muscle lisse bronchique a été évaluée en mesurant la surface d’actine, rapportée sur la surface totale de la biopsie bronchique.
Afin de déterminer les « normes », nous avons fait les analyses de remodelage sur 11 patients « contrôles » sans antécédent de pathologie pulmonaire, décédés suite à des causes extra-pulmonaires. Aucun des patients contrôles n’avaient de malformation pulmonaire.
Toutes les mesures ont été réalisées en double aveugle, par 2 opérateurs différents et sur 3 échantillons de biopsies. Nous avons pris la moyenne des 3 mesures.
Les résultats ont été exprimés en valeur absolue et en z-score (cf article 1)
Culture cellulaire
Pour chaque spécimen pulmonaire issu de lobectomie ou pneumectomie, la bronche proximale (diamètre interne de 3 à 5 mm, inférieur à la 10ème génération) était placée dans un milieu de culture stérile «DMEM 10% + fungizone», puis était disséquée sous microscope à partir d'une zone macroscopiquement saine. Cette manipulation a permis l'élimination des tissus non désirés, i.e. épithélium, sous-muqueuse, tissus adipeux et pulmonaire. Chaque faisceau de muscle lisse était rincé avec ce même milieu et découpé en fragments de 2 à 3 mm3.
Eléments d'intérêt Anticorps primaires Fournisseurs Référence Dilution
Myofibroblaste rabbit anti‐calponine abcam ab 46794 1/500
Muscle lisse bronchique alpha‐smooth muscle actin Dako 1A4 ready‐to‐use
Eosinophile anti‐PRG2 Abcam ab14462 1/200
Mastocyte anti‐human mast cell tryptase Dako AA1 1/500
Neutrophile anti‐human neutrophile elastase Dako NP57 1/200
Macrophage, monocyte anti‐human CD68 Dako PG‐M1 1/100
Lymphocytes anti‐human CD31 Dako JC70A 1/200
noyau DAPI Dako 1/500
Réseau mitochondrial msTom20 Santa cruz sc17764 1/1000
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Pour les biopsies sous fibroscopie, les prélèvements étaient issus de la 2ème à la 8ème
génération. La dimension de la biopsie (quelques mm3) rendant la dissection impossible, celles-ci ont été découpées directement en fragments de 2 à 3 mm3.
Les fragments obtenus étaient ensuite mis en culture sur des plaques 6 puits dans un milieu de culture stérile dit «milieu DMEM 10% + fungizone».
Le milieu de culture «milieu DMEM 10% + fungizone» contenait ‐ 500 ml de milieu DMEM 10%
‐ 0,25 g/ml de fungizone (Sigma-Aldrich)).
Les plaques de culture étaient ensuite placées à 37°C dans une atmosphère enrichie avec 5% de CO2. Le milieu de culture était remplacé toutes les 48 à 72 heures. La viabilité des cellules était appréciée quotidiennement sous microscope avec contrôle de l’aspect typique des CML de forme allongée «spindle-shaped cells», orientées parallèlement les unes aux autres, formant des faisceaux.
Après 2 à 3 semaines de culture, les cellules confluentes étaient soumises à un premier passage et placées dans des flacons de culture de 75 cm2. Après quelques jours, les cellules, de nouveau confluentes, étaient soumises à un deuxième passage à la trypsine puis utilisées pour différentes expérimentations ou congelées en dans un milieu contenant du SVF supplémenté avec 10% de DMSO à -80°C.
Contrôle du phénotype CML
Pour confirmer la pureté de la lignée cellulaire, nous avons utilisé une technique d’immunophénotypage par immunofluorescence indirecte (microscope à épifluorescence NIKON TE2000-E et tête confocale D-Eclipse-C1). Toutes les CML devaient être marquées positivement pour l’actine du muscle lisse (msAC anti-αASM à 1/500) et l’ immunoglobuline G aspécifique a servi de contrôle (136).
46 Photo 2. Immunophénotypage des CML En vert le marquage par Ac anti alpha‐smooth muscle actine En bleu : le DAPI En rouge: le marquage par Ac anti‐calponine
Estimation de la prolifération des CML par comptage cellulaire
Pour évaluer la prolifération cellulaire, nous avons compté les CML manuellement pour chaque patient et établi une courbe de prolifération. Un nombre fixe de CML a été déposé dans chaque puit d'une plaque 6 puits et les CML ont été mises en culture dans différentes conditions pendant 5 à 9 jours. Le comptage cellulaire a été réalisé à J2, J5, J7 et J9.
Pour cela, les CML étaient soumises à un passage à l’aide de trypsine après 2 étapes de rinçage à l’HBSS. Après centrifugation de la suspension cellulaire contenant de la trypsine (1500 tours/min, pendant 5min à 4°C). Le culot cellulaire était remis en suspension et homogénéisé dans 1mL de «milieu DMEM10%». Le nombre de cellules comptées à l'aide d'une cellule de Newbauer correspondant à un volume de 1µL, celui-ci était ensuite multiplié par le volume total de la suspension cellulaire. Nous avons ensuite calculé le temps de dédoublement cellulaire «doubling time» selon une formule précédemment décrite (137) en déterminant le jour de l’accélération de la croissance cellulaire sur les courbes de prolifération.
Estimation de la prolifération des CML par CFSE
La prolifération cellulaire a également été mesurée par un traceur membranaire fluorescent carboxy fluorescein succimidyl ester (CelltraceTMCFSE cell proliferation kit, Thermofisher, Villebon sur Yvette, France). En incorporant un traceur fluorescent dans la membrane des CML, on pouvait suivre la division cellulaire grâce à la décroissance de fluorescence du
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traceur membranaire. Nous avons déposé un nombre identique de CML dans chaque puit d’une plaque de 6 puits (25 000 cellules). Ces cellules ont été synchronisées pendant 24 heures grâce au «milieu DMEM 0%». Puis le traceur a été incorporé à une concentration de 500nM et les CML ont été mises en culture pendant 5 jours. La fluorescence du traceur décroît au fur et à mesure de la division cellulaire et donc de la division membranaire. Nous avons mesuré le taux de fluorescence des CML à J0, J2, J5. En faisant le rapport taux de fluorescence à J2 ou J5 sur le taux de fluorescence à J0 pour chaque patient, nous avions une estimation du nombre de division cellulaire et donc de la prolifération cellulaire (Figure 14).
Figure 14. Principe d’évaluation de la prolifération par cytométrie en flux Utilisation d’une sonde membranaire CFSE, dont la fluorescence va décroitre au fur et à mesure de la division cellulaire
Stimulation des CML
Pour évaluer l’effet de traitement sur la prolifération des CML, nous avons après 24h de synchronisation en DMEM 0%, mis les CML directement en contact avec les traitements cités ci-après, selon la dilution décrite dans le tableau 7, pendant 5 jours au total. Les milieux contenant les traitements étaient changés toutes les 48h, sauf pour le D600 (hydroxy-vérapamil) qui était changé tous les jours.
Pour étudier l’effet de l’environnement sur la prolifération des CML, nous avons utilisé le surnageant sous épithélial stimulé comme précédemment décrit. Après 24h de
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synchronisation en DMEM 0%, les CML étaient mises en contact pendant 5 jours comme décrit dans la figure 15 avec
‐ DMEM 0% ‐ DMEM 10%
‐ Surnageant épithélial ALI ‐ Surnageant épithélial ALI + RV ‐ Surnageant épithélial ALI + Dpter ‐ Surnageant épithélial ALI + Dpter+ RV
Tableau 7. Traitements utilisés sur les CML
Molécule Fournisseurs Références Poids moléculaire Concentrations
Azithromycine Sigma‐Aldrich PHR1088 785,02 10‐5 à 10‐8 M Analogue Macrolide S. C. 588,78 10‐5 à 10‐8 M D600 hydroxy‐verapamil Sigma‐Aldrich M5644 521,09 10‐6M Dexaméthasone Sigma‐Aldrich D4902 392,45 10‐6M Montelukast Sigma‐Aldrich SML0101 608,17 10‐6M
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Figure 15. Etape de la stimulation épithéliale et de la stimulation du muscle lisse bronchique chez l’adulte et chez l’enfant
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