Matériels et méthodes
B. L’épithélium bronchique
B. L’épithélium bronchique
Obtention du tissu épithélial
Les cellules de l’épithélium bronchique étaient obtenues à partir de tissus bronchiques issus soit d’une dissection bronchique sous microscope, soit d’un brossage ciliaire réalisé sous endoscopie. Pour cette dernière, une analyse de la morphologie et de la mobilité ciliaire était réalisée en anatomopathologie dans le but d’éliminer des arguments en faveur d’une dyskinésie ciliaire primitive.
Les cellules épithéliales issues de brossage étaient conservées dans un «milieu DMEM 10% + fungizone» (Tableau 3) pour le transport vers le laboratoire à température ambiante. Le prélèvement contenant les cellules épithéliales en suspension et le matériel de brossage était ensuite centrifugé (1500 tours /min, pendant 5 minutes, à 4°C).
Le culot cellulaire obtenu était remis en suspension et homogénéisé dans un milieu « Pneumacult-ex » (tableau 3 et 5) pour être ensuite transvasé dans des flasques de culture de 150 cm² et incubé à 37°C, sous une atmosphère enrichie à 5% de CO2.
Les cellules épithéliales issues de la dissection de pièce opératoire étaient obtenues grâce à la mise en culture d’explants d’épithélium mis en culture de manière identique aux cellules épithéliales en suspension précédemment décrite. Le milieu de culture a été changé toutes les 48-72 heures.
40 Tableau 3. Composition des milieux de culture Tableau 4. Liste des composants utilisés pour la culture cellulaire
Différenciation de l’épithélium respiratoire
Le tapis de cellules épithéliales ainsi obtenu dans les flasques de culture était issu uniquement de la prolifération des cellules basales de l’épithélium. Afin de reconstituer un épithélium bronchique, pseudo-stratifié et composé de cellules ciliées et à mucus, les cellules épithéliales
Milieu DMEM 0% Volume
Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose 450 mL MEM non‐essential amino acid solution 100x 5 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Milieu DMEM 2% Volume
Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose 450 mL
Fetal bovine serum 10 mL
MEM non‐essential amino acid solution 100x 5 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Milieu DMEM 10% Volume
Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose 450 mL
Fetal bovine serum 50 mL
MEM non‐essential amino acid solution 100x 5 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Produits Fournisseur Références
Antibiotics antimycotic solution 100x Sigma A5955 Dulbecco's modified Eagle's Medium ‐high glucose Sigma D0822 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8537
DMSO diméthylsulfoxyde Sigma 276855
Fetal bovine serum Gibco 10270
Héparine solution 2mL Stemcell 7980
MEM non‐essential amino acid solution 100x Sigma M7145
Penicillin‐Streptomycin Sigma P4333
Pneumacult ALI basal medium Stemcell 5002 Pneumacult ALI10x supplement Stemcell 5003
Pneumacult Ex medium Stemcell 5009
Pneumacult ex10x supplement Stemcell 5019
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étaient placées sur des inserts de culture en interface air-liquide comme précédemment décrit (134). Pour cela, les cellules épithéliales confluentes étaient soumises à un passage grâce à une solution trypsine-EDTA (Sigma Aldrich, Saint-Louis, Missouri, Etats-Unis) après deux étapes de rinçage au DPBS Dulbecco’s phosphate buffer saline, (Sigma Aldrich).
La suspension cellulaire contenant la trypsine était transvasée dans un flacon stérile contenant du « milieu DMEM 10% » (tableau 3) et centrifugée pendant 5 minutes à 1500 rotations par minute et à 4°C. Le culot cellulaire obtenu était remis en suspension et homogénéisé et un décompte cellulaire était effectué grâce à une cellule de Newbauer. Un nombre fixe de cellules était déposé sur des inserts de culture (200 000 cellules sur des inserts de plaque 12 puits et 100 000 cellules pour des inserts de plaque 24 puits). Les cellules étaient alors placées en milieu «basal pneumacult-ex» au pôle apical et basal de l’insert jusqu'à l’obtention d’une couche de cellules confluentes sur l’insert. Les inserts étaient ensuite placés en interface air-liquide en retirant le milieu du pôle apical et en remplaçant le milieu basal par un milieu de culture dit «ALI». La différentiation de l’épithélium était obtenue après un minimum de 3 semaines de culture en condition ALI (Tableau 5).
Tableau 5. Composition des milieux de culture
Pneumacult ALI complet Volume
Pneumacult ALI 450 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Pneumacult ALI10x supplement 50 ml
Pneumacult‐EX basal médium complet Volume
Pneumacult‐EX basal médium 490 mL
Penicillin‐Streptomycin 5 mL
Milieu basal Pneumacult ‐ex
Pneumacult‐EX basal médium complet 25 mL
Aliquot supplemental 500 µL
Hydrocortisone 25 µL
Milieu ALI Volume
Pneumacult ALI complet 50 mL
Héparine 2mg/mL 100 µL
Hydrocortisone 250 µL
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Phénotype épithélium
Le contrôle de la bonne différenciation de l’épithélium respiratoire était réalisé par technique d’immunophénotypage et immunofluorescence indirecte (microscope à épifluorescence NIKON TE2000-E et tête confocale D-Eclipse-C1) après avoir marqué les cellules à mucus grâce à des Ac de souris anti-MUC5AC (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et les cellules ciliées avec des Ac de lapin anti-β-tubuline. Les Anticorps secondaires utilisés étaient des Ac anti-souris ALEXA 568(GAM Alexa 568, Invitrogen, Carslbad, Californie, Etats-Unis) et Ac anti-lapin ALEXA 488 (GAR Alexa 488, Invitrogen).
Photo 1. Immunophénotypage épithélial En vert, le marquage positif pour β‐tubuline En rouge, le marquage positif pour MUC 5‐AC
Surnageant épithélial
Les cellules épithéliales bronchiques différenciées ont été stimulées pendant 24h au niveau du pôle apical cellulaire avec soit:
‐ du milieu ALI seul
‐ du milieu ALI contenant du rhinovirus sérotype16 (Multiplicity Of Infection MOI 0.1) soit 10 000 virions/insert (135)
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‐ du milieu ALI contenant des extraits allergéniques d’acariens D.pteronyssinus (Dpter) (Stallergènes, Antony, France)
‐ du milieu ALI contenant du rhinovirus et des extraits allergéniques de Dpter.
Nous avons utilisé du rhinovirus sérotype 16 fourni par le Dr Brian Oliver du Respiratory Research Group de Sydney.
Avant de stimuler l’épithélium, le milieu ALI était remplacé pendant 48h par un milieu ALI sans hydrocortisone.
Le milieu d’infection contenait du ‐ DMEM 2%
‐ 0.5x106 virions/mL
Puis l’épithélium était exposé au milieu d’infection pendant 1h à 37°C.
Le surnageant produit au pôle basal était alors collecté après 24h de stimulation et stocké à -80°C. Le surnageant obtenu après une infection rhino-virale était préalablement placé pendant 15 minutes sous une lampe à ultra violet pour inactiver le rhinovirus en détruisant son ARN.