Algorithmes de super-résolution pour la microscopie à balayage laser avec modelage de faisceau par diffraction conique

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balayage laser avec modelage de faisceau par diffraction

conique

Anne-Sophie Mace

To cite this version:

Anne-Sophie Mace. Algorithmes de super-résolution pour la microscopie à balayage laser avec mod-elage de faisceau par diffraction conique. Algorithme et structure de données [cs.DS]. Université Sorbonne Paris Cité, 2018. Français. �NNT : 2018USPCB212�. �tel-02468152�

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UNIVERSIT´E PARIS DESCARTES ´

Ecole doctorale 386 : Sciences Math´ematiques de Paris Centre Laboratoire MAP5 (CNRS UMR 8145)

Algorithmes de super-r´

esolution pour la

microscopie `

a balayage laser avec modelage de

faisceau par diffraction conique

Super-resolution algorithms for laser scanning

microscopy with illumination patterns shaped by

conical diffraction

Par Anne-Sophie Mac´

e

Thèse de doctorat de Mathématiques Appliquées

Présentée et soutenue publiquement le 5 juillet 2018, devant le jury composé de

Sylvain Durand Université Paris Descartes Examinateur Jean-Fran¸cois Giovannelli Université de Bordeaux Examinateur Jérôme Idier CNRS/École Centrale de Nantes Rapporteur Charles Kervrann INRIA Rennes Rapporteur Cécile Louchet Université d’Orléans Examinatrice Lionel Moisan Université Paris Descartes Directeur de thèse Gabriel Sirat BioAxial Examinateur Jean-Yves Tinevez Institut Pasteur Examinateur

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R´

esum´

e

Cette thèse s’intéresse à des techniques non linéaires de reconstruction d’images, appliquées au problème de la super-résolution en microscopie, qui vise à dépasser la li-mite de résolution de Abbe en combinant des techniques de mesure et de traitement d’images. Nous considérons un système à fluorescence avec une méthode d’Image Scanning Microscopy (ISM), produisant des micro-images obtenues en scannant un échantillon biologique et en y projetant une distribution lumineuse. La forme de cette distribution peut être assez singulière lorsqu’elle est créée par un modelage de faisceau laser, rendu possible grâce à un phénomène optique appelé diffraction conique. Un cadre mathématique s’appuyant sur la transformée de Fourier à quatre dimensions est proposé, permettant de comparer théoriquement les méthodes ISM, en quantifiant leur impact en terme de résolution. Nous considérons également la modélisation mathématique exacte de ces méthodes et en particulier les questions de discrétisation, permettant ensuite de simuler un système ISM. Cette modélisation est indispensable lorsque l’on cherche à résoudre le problème inverse induit par la super-résolution. Nous abordons sa résolution avec des contraintes très faibles, à savoir uniquement la positivité de l’image recherchée. Nous mettons en évidence un arte-fact, appelé night sky, produit par l’estimateur du Maximum A Posteriori (MAP). Nous montrons néanmoins que cet artefact peut être évité en imposant à l’image super-résolue d’être à bande limitée, contrainte convexe qui peut être ajoutée à la positivité moyennant un algorithme de projection adapté. Nous introduisons ensuite un nouvel estimateur, le E-LSE, pour Emitters-Least-Square Error, qui minimise l’erreur quadratique moyenne a posteriori et qui est adapté aux images parcimo-nieuses, une caractéristique souvent satisfaite par les images biologiques obtenues en microscopie à fluorescence. Nous montrons qu’en dépit de la dimension élevée et du caractère non convexe de la contrainte de parcimonie, cet estimateur E-LSE peut-être évalué numériquement par un algorithme de type MCMC (Markov chain Monte Carlo). L’estimateur E-LSE permet de limiter certains artefacts spécifiques du MAP et, sur plusieurs exemples, produit une image mieux résolue.

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This thesis focuses on non-linear image reconstruction methods applied to super-resolution in microscopy, which aims to overcome Abbe super-resolution limit by combin-ing specific acquisition and image processcombin-ing techniques. We consider a fluorescence Image Scanning Microscopy (ISM) system, which scans a biological sample with a particular light distribution and records a micro-image at each scan position. This specific light distribution is created by shaping a laser beam thanks to an optical phe-nomenon called conical diffraction. We propose a mathematical framework based on a four-dimensional Fourier transform, which enables us to provide a theoretical com-parison of the different ISM methods in terms of resolution gain. We also address the exact mathematical modelling of these methods, and in particular the discretiza-tion issues involved in the simuladiscretiza-tion of an ISM system. These quesdiscretiza-tions indeed play an essential role for the super-resolution system we study, naturally written as an inverse problem. We first consider a formulation with very little constraints by imposing only the positivity of the reconstructed image. We show that in that case, the Maximum A Posteriori (MAP) estimate suffers from an artifact called night sky, but it can be avoided by imposing an additional band-limitedness constraint on the reconstructed image. The two resulting convex constraints can be simultane-ously handled by means of a specific projection algorithm. We then introduce a new estimator, called E-LSE (for Emitters-Least-Square Error), which minimizes the a posteriori mean square error and is particularly suited to sparse samples, which are often encountered in fluorescence microscopy. Despite the very high dimension of the problem and the non-convexity of the sparsity constraint, this E-LSE estimator can be numerically computed with an MCMC (Markov Chain Monte Carlo) algorithm. We show that it outperforms the MAP estimate in terms of artifacts and, on several examples, produces a better-resolved image.

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Chapitre 1

Introduction

En 1873, Ernest Abbe évoquait l’impossibilité pour un microscope optique de visualiser des éléments plus petits qu’environ la moitié de la longueur d’onde utilisée pour illuminer l’échantillon biologique. Le domaine des longueurs d’onde du spectre visible étant compris entre 400 et 800 nanomètres environ, des détails plus petits qu’environ 200 nanomètres ne pourront donc pas être distingués lors de l’utilisation d’un microscope optique. En 2014 le prix Nobel de chimie est remis à Eric Betzig, Stefan W. Hell et William E. Moerner, pour leurs différentes techniques de super-résolution “repoussant les limites de la science”, utilisant les propriétés des molécules fluorescentes. Aujourd’hui, la plupart des microscopes à fluorescence sont équipés d’un module de super-résolution, indispensable pour visualiser des phénomènes bio-logiques dont l’ordre de grandeur est la centaine de nanomètres. En effet si la taille des cellules biologiques est plutôt de l’ordre de la dizaine de micromètres, celle des virus et des protéines est de l’ordre de la dizaine de nanomètres, rendant impossible la visualisation de leurs interactions avec une cellule sans technique de super-résolution. La microscopie électronique, différente de la microscopie optique car elle éclaire l’échantillon avec un faisceau d’électrons, permet de dépasser sans difficulté cette limite, mais requiert de fixer, c’est-à-dire tuer les cellules constituant l’échantillon. Elle n’offre donc pas la possibilité d’observer des échantillons et phénomènes vivants, ce qui explique l’utilisation toujours actuelle des microscopes optiques. Pour autant, l’observation de la dynamique des processus biologiques nanoscopiques permettrait de mieux comprendre leurs étapes et la durée de chacune, afin d’être capable d’agir sur celle-ci (par exemple dans le cas d’une contamination par un virus, être capable de visualiser les différentes étapes par lequel le virus passe avant d’infecter une cel-lule pourrait permettre de stopper la contamination en rendant impossible une des étapes).

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La microscopie à fluorescence utilise des fluorophores, c’est-à-dire des protéines émettant de la lumière suite à une excitation (à l’aide un laser par exemple) par un photon d’une longueur d’onde adaptée à ce fluorophore. Au moment de retourner dans son état fondamental, le fluorophore libère un photon, appelé photon de fluo-rescence, créant une lumière qui est ensuite enregistrée par une détecteur (caméra, PMT etc.), par exemple. Les longueurs d’onde d’émission et d’excitation d’un fluo-rophore sont différentes, permettant de visualiser uniquement, au moyen d’un filtre, les photons émis par les fluorophores.

Plusieurs techniques, et en particulier celles traitées dans cette thèse, dans les chapitres 3 et 6, utilisent un microscope à balayage laser ; il s’agit d’un système où le laser se déplace sur l’échantillon, le plus souvent par l’intermédiaire de mi-roirs galvanométriques. Une mesure ne correspond donc pas à l’image complète de l’échantillon biologique mais à une petite partie uniquement. À chaque mouvement du laser, une mesure est effectuée et l’ensemble de ces mesures permet, après traite-ment des données, de créer ensuite l’image finale. On les appelle souvent méthodes ISM, pour Image Scanning Miscroscopy.

Dans cette thèse, on s’intéresse particulièrement aux images parcimonieuses, sparses en anglais. Dans [64], la parcimonie est définie comme suit : “une repré-sentation sparse est une reprérepré-sentation dans laquelle un petit nombre de coefficients contient une large proportion d’énergie”. La création même des images en microscopie de fluorescence induit une notion de sparsité dans le domaine de l’image, puisqu’on illumine des sources ponctuelles de lumière, les fluorophores. Les représentations sparses sont de plus en plus présentes dans la littérature, notamment grâce au développement du compressed sensing [36], qui cherche, étant donné un système linéaire, une base dans laquelle, la représentation de la solution du système linéaire soit la plus sparse possible.

1.1 Formation de l’image et mod´

elisation du bruit

li´

e `

a la mesure

Une image numérique (monochromatique) est modélisée par un tableau de nombres, dont chaque case est appelée un pixel. Les valeurs de ces pixels sont appelés les ni-veaux de gris, le 0 représentant le noir absolu. On revient sur la création de ce tableau

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1.1. Formation de l’image et modélisation du bruit lié à la mesure 11 et en particulier sur la notion de capteur. Ensuite, on s’intéresse aux différents bruits intervenant lors de la création d’une image sur le capteur de la caméra, en s’appuyant sur l’article de Aguerrebere et al. [6]. On décrit ici les deux principales sources de bruit : le bruit dit de “grenaille” (photon shot en anglais), dû au caractère quan-tique de la lumière et caractérisé par un processus de Poisson, et le bruit de lecture de la caméra, dû par exemple à son électronique. Ce dernier est le plus souvent modélisé par un bruit additif gaussien, dont la déviation standard est spécifiée dans les caractéristiques de la caméra.

1.1.1 Formation de l’image sur le capteur

Une caméra numérique est composée d’éléments électroniques appelés capteurs photographiques ou photosites, qui sont photosensibles et qui convertissent un rayon-nement électromagnétique (pouvant être dans le domaine du visible, c’est-à-dire entre 400 et 800 nanomètres environ, mais également dans l’infra-rouge ou l’ultra-violet) en un signal électrique analogique. Dans le cas d’un capteur CMOS, pour Complemen-tary Metal Oxide Semi-Conductor en anglais, ce signal passe par un amplificateur puis un convertisseur analogique-numérique créant l’image numérique en sortie. Sur ce type de capteur, la lecture se fait ligne par ligne, c’est-à-dire que toutes les co-lonnes sont lues en même temps, chacune étant associée à un amplificateur ; chaque amplificateur étant différent, un motif de colonne se crée alors à la lecture de plu-sieurs lignes (représenté sur la figure1.1), qu’il faudra ensuite intégrer dans le modèle pour qu’il n’altère pas la qualité de l’image finale.

Figure 1.1: Exemple d’image “noire” (pas de lumière projetée, temps d’exposition d’environ 1 ms) à gauche obtenue sur un capteur de type CMOS. En raison du processus de lecture, avec un amplificateur par colonne, on voit apparaˆıtre un motif de colonne ; sur la seconde image, on a retiré à chaque colonne sa moyenne, laissant apparaˆıtre une image uniformément bruitée, sans motif. À droite, l’histogramme des niveaux de gris de l’image du milieu. L’histogramme de cette image est très proche d’une courbe Gaussienne (représenté en rouge), la modélisation du bruit de lecture par un bruit Gaussien semble donc cohérente.

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Si l’on note C la surface d’un photosite, le signal récupéré sur le photosite ima-geant l’échantillon biologique u est donné par

Z Z

C

u(kδ + x, lδ + y)dxdy,

où δ est le pas d’échantillonnage ; il s’agit alors d’un échantillon de la discrétisation de la convolution entre l’échantillon u et et la fonction indicatrice de la surface collectrice C.

1.1.2 Analyse des bruits pr´

edominants

Bruit de grenaille Comme expliqué, par exemple dans [118], la lumière peut être vue comme une série de particules, appelés photons. D’après les lois de la physique, chaque photon possède une énergie définie par hc/λ, où λ est la longueur d’onde, c la vitesse de la lumière et h la constante de Planck. La physique quantique permet de décrire l’émission de photons par une source lumineuse selon un processus statistique de Poisson. Le nombre de photons observés durant un intervalle de temps T (appelé temps d’exposition) suit une loi de Poisson de paramètre ρT où ρ est le flux de photons. La figure 1.2 illustre ce phénomène.

Bruit de lecture Le bruit de lecture est dû à deux phénomènes : la conversion analogique-numérique au sein du capteur et un bruit intrinsèque à chaque pixel. Plus ce bruit de lecture est faible, plus les changements faibles d’intensités peuvent être observés sur la caméra, ce qui prend particulièrement sens pour les applications bio-logiques où l’éclairement des échantillons est le plus limité possible, afin d’éviter de tuer les cellules ou de faire perdre aux fluorophores leurs propriétés de fluorescence. Il est de coutume de modéliser ce bruit de lecture comme un bruit additif Gaussien [109]. Une expérience faite en prenant une image constante (sans lumière) confirme cette hypothèse : sur la figure 1.1, la répartition des valeurs prises par les pixels est très proche d’une courbe Gaussienne. L’image étant obtenue sur une caméra avec un capteur CMOS, le motif de colonne mentionné ci avant est visible, on retire donc à chaque colonne sa moyenne, laissant apparaˆıtre une image similaire à du bruit pur, et dont les pixels ont été utilisés pour la comparaison avec la gaussienne.

Dans le cas d’une acquisition en faible lumière, comme la microscopie à fluores-cence, on considère uniquement le bruit de grenaille, analysé prédominant [7]. Ce n’est pas la seule application où l’on considère uniquement ce type de bruit ; c’est également le cas en tomographie par émission [110] ou en astronomie [12]. Cette

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1.1. Formation de l’image et modélisation du bruit lié à la mesure 13

(a) Maximum à 50 photons : (b) Maximum à 500 photons : originale et bruitée originale et bruitée

Figure 1.2: Illustration du bruit de Poisson sur deux images de dynamiques différentes : l’image originale est représentée dans la moitié supérieure, au dessus de la séparation rouge dans les deux cas. À partir de cette image, on a généré du bruit de Poisson, pour un maximum de photons de 50 en (a), 500 en (b), dont les représentations sont dans les moitiés inférieures, sous la séparation rouge. Visuellement l’effet du bruit de Poisson est bien plus fort lorsque le nombre de photons est plus faible (à gauche). La valeur des pixels bruités étant liée au nombre de photons sur l’image, et non additive, comme dans le cas Gaussien, des algorithmes spécifiques pour ce type de bruit doivent être mis en place. Image de cellule fongique (le canal vert est le seul représenté sur cette image) par Fernan Federici et Anna Gordon pour le concours Olympus BioScapes Digital Imaging 2011, licence CC BY-NC-ND 3.0

hypothèse est aussi valide car les caméras utilisées dans ces applications sont perfor-mantes et donc limitent le bruit Gaussien. Pour plus d’informations sur un modèle prenant en compte également le bruit Gaussien, le lecteur peut se référer à [72]. A contrario, lorsque le nombre de photons est plus important, le bruit Gaussien additif est souvent le seul considéré.

Les images obtenues sur la caméra doivent donc être débruitées, à l’aide d’al-gorithmes adaptés au bruit de Poisson, mais aussi déconvoluées car l’image par un système optique d’un point très petit n’est pas un point mais une tâche ; ceci est dû à un phénomène physique, appelé diffraction : l’étalement de l’énergie d’un point par tout système optique fini.

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1.2 Limitation fr´

equentielle d’un syst`

eme optique

En 1873, Abbe [1] définit la limite de diffraction, d, c’est-à-dire la plus petite période représentable par le système optique, comme une fonction de la longueur d’onde utilisée λ et l’ouverture numérique de l’objectif NA, donnée par

d = λ

2NA. (1.1)

L’ouverture numérique, NA, est une caractéristique capitale d’un objectif décrivant le cône de lumière entre le foyer et la lentille. Elle est proportionnelle à l’indice de réfraction du milieu et au demi-angle d’ouverture, angle entre l’axe optique et le plus grand rayon pouvant pénétrer dans la lentille. Plus NA est grand, plus la résolution est bonne (en effet, d dans (1.1) est inversement proportionnel à NA). Une grande ouverture numérique limite cependant la profondeur de champ, c’est-à-dire la zone sur l’axe z contenant des objets nets est plus restreinte. Dans la suite de cette intro-duction, on se référera à d quand on parlera du pouvoir de résolution d’un système optique.

Cette limite de diffraction peut aussi s’exprimer dans le domaine de Fourier comme expliqué par Goodman [44] : les transformées de Fourier des images générées par un microscope sont à support borné, contenues dans [_−fmax, fmax]2, où fmax,

appelée la fréquence de coupure, est donnée par fmax =

2π d =

4πNA

λ . (1.2)

On revient plus précisément dans le chapitre2sur la définition de la transformée de Fourier, définie pour toute fonction ˜f ∈ L1_(Rn_{) par}

∀ξ ∈ Rn_, _{F(f) : ξ 7−→}

Z

Rn

˜

f (x)e−ihξ,xidx.

Le détecteur de la caméra étant pixelisé, il faut introduire la Transformée de Fourier Discrète, DFT ; étant donnés N échantillons (f (k))_{k=0,...,N −1}, tels que f (k) = ˜f (kT ), où T est le pas d’échantillonnage, la DFT de f s’écrit

∀p ∈ Z, ˆf (p) =

N −1_X

k=0

f (k)e−2iπpkN

La DFT est un outil très intéressant numériquement car sa complexité est en O(N log N ), pour tout N positif.

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1.2. Limitation fréquentielle d’un système optique 15 On présente sur la figure 1.3 une image numérique et sa transformée de Fourier discrète. Puisque cette dernière est complexe, on ne peut la représenter directement ; dans cette thèse, on représente toujours son module, car on s’intéresse au poids des composantes les unes par rapport aux autres. L’utilisation de l’échelle logarithmique pour son observation est assez fréquente car l’étendue des intensités est en générale assez grande.

Figure 1.3: Représentation d’une image numérique et de sa transformée de Fourier discrète. À gauche, image de la figure 1.2, représentée cette fois en niveau de gris, à droite l’image du module de sa transformée de Fourier discrète, en échelle logarithmique. On remarque que l’énergie est plus condensée dans l’espace de Fourier, en particulier autour des basses fréquences, situées près du centre. L’image de départ étant réelle, le module de sa transformée de Fourier est une fonction paire, ce qui explique la symétrie centrale observée dans l’image de droite.

Le fait que tout système optique soit limité en fréquence signifie qu’au-delà de la fréquence fmax donnée par la Formule (1.2), les coefficients capturés sont

théoriquement nuls, donc dans la pratique, uniquement dus au bruit. Cela signi-fie également que, dans le domaine spatial, c’est-à-dire dans le domaine de l’image, par opposition au domaine de Fourier1_{, un point plus petit que la limite de résolution} du système d apparaˆıt comme une tache. Dans le cas d’une source ponctuelle, cette tache est appelée PSF, pour Point Spread Function en anglais, fonction d’étalement du point en fran¸cais et notée ϕ. Pour un échantillon u, en deux dimensions, on ob-serve non pas u mais u∗ ϕ, où ∗ dénote la convolution, sur laquelle on revient dans la suite. Pour un microscope, lorsque l’ouverture est circulaire et la lumière considérée monochromatique et incohérente, la PSF est modélisée par la tache d’Airy. Cette “tache d’Airy” est représentée dans le domaine spatial et de Fourier sur la figure1.4.

1. cette définition du domaine spatial sera celle utilisée dans le reste de cette introduction ainsi que dans les différents chapitres

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On note ra, pour rayon d’Airy, le premier z´ero du profil vertical de la fonction d’Airy ;

sa valeur est fonction de la longueur d’onde λ, de l’ouverture num´erique NA et est donn´ee par

ra≃ 0.61

λ NA.

On remarque sur la figure 1.4 que la majorité de l’énergie de la PSF est concentrée dans le cercle de rayon ra. Cela signifie qu’en plus d’être à bande limitée, c’est-à-dire

que sa transformée de Fourier est bornée, la PSF est aussi très condensée dans le domaine spatial.

Espace

Fourier

Figure 1.4: Illustration de la tache d’Airy, modélisant la tache optique du microscope, en espace (en haut) et dans le domaine de Fourier (en bas). Un profil vertical est représenté pour les deux images. En espace, on voit qu’une grande proportion de l’énergie est située dans le cercle centré en 0 et de rayon ra. Dans le domaine de Fourier, on remarque que les coefficients discrets plus grands

que fmax ont des valeurs nulles, ce qui est dû au fait que le système optique crée des signaux à

bande limit´ee.

Pour comprendre le problème de cette limitation dans le domaine de Fourier, il est important de comprendre ce que représentent les hautes et basses fréquences d’une image. L’énergie des fréquences hautes d’une image correspond dans la majorité des cas aux changements brusques d’intensité, par exemple les contours mais également

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1.2. Limitation fréquentielle d’un système optique 17 le bruit ; a contrario, celle des basses fréquences représente les parties homogènes, avec des changements de contraste assez lents, comme présenté sur la figure 1.5. Pour séparer ces composantes, on utilise un filtre dit passe-haut (i.e, laissant passer les fréquences hautes) et un passe bas (i.e, laissant passer les basses fréquences). Sur la figure 1.5, l’application des deux filtres témoigne des caractéristiques recensées ci-avant : l’image résultat du filtre passe-bas est quasiment identique avec ou sans bruit contenant les parties homogènes, donnant une version floue de l’image originale. L’image résultat du filtre passe-haut contient les détails fins, à savoir les contours et le bruit pour l’image bruitée.

Figure 1.5: Illustration des hautes et basses fréquences de la transformée de Fourier d’une image. Sur la première colonne sont représentées les images “originales”, en haut, l’image usuelle de Lena, en bas, cette même image dégradée par un bruit Gaussien. Sur les deux colonnes suivantes : l’image de la première colonne filtrée avec un filtre de Butterworth [19] passe-bas (fréquence de coupure à 3% de la taille de l’image), image originale filtrée avec un filtre passe-haut (fréquence de coupure à 10% de la taille de l’image). Le filtre passe-bas atténue les contours et détails de l’image (la rendant plus floue) et produit un résultat similaire que l’image de base soit bruitée ou non. Au contraire, le filtre passe-haut contient tous les contours et détails précis (par exemple les plumes du chapeau ou les cils) mais également le bruit.

En microscopie, lors de la convolution du signal avec la tâche d’Airy, les hautes fréquences perdues peuvent par exemple éliminer des séparations (de taille inférieure à d) entre les éléments biologiques, des filaments de très faible épaisseur ou encore des éléments ponctuels de très petite taille. Cependant, ces caractéristiques peuvent permettre au biologiste de mieux appréhender les phénomènes qu’il étudie. C’est

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pourquoi de nombreuses techniques de super-résolution se sont développées au cours des dernières années.

1.3 Techniques de super-r´

esolution en

microsco-pie `

a fluorescence

Dans le cas de la microscopie à fluorescence, la protéine GFP (pour Green Fluo-rescent Protein, dont le prix Nobel de Chimie 2008 a récompensé la découverte et les applications), utilisée dans la préparation de nombreux échantillons car peu toxique sur les cellules vivantes, possède un maximum d’excitation autour de 480 nm. Les meilleurs objectifs ont une ouverture numérique autour de NA = 1.5, nous donnant donc une limite de diffraction de

d = 480

2× 1.5 ≃ 160 nm,

signifiant qu’aucun élément plus petit que 160 nm ne peut-être résolu dans ces circonstances. Pour pallier cette limite, de nombreuses techniques dites de “super-résolution” ont été créées, exploitant les propriétés des molécules fluorescentes, no-tamment la possibilité de les allumer/éteindre sélectivement dans une scène donnée. De nombreux articles recensent les différentes techniques de super-résolution ac-tuelles, parmi lesquels on peut citer en 2009 l’article de Chi [25] ou encore celui de Huang at al. [59] et en 2011 celui de Leung et Chou [73]. Les techniques de super-résolution peuvent être divisées en deux catégories : les méthodes plein champ comme le SIM, pour Structured Illumination Microscopy, et le PALM/ STORM, pour Photo-Activated Localization Microscopy et STochastic Optical Reconstruction Microscopy, et les méthodes plus locales, utilisant le plus souvent un microscope de fluorescence à balayage laser. Le chapitre suivant de cette thèse traite du SIM et des méthodes dites ISM, pour Image Scanning Microscopy. Pour ces deux méthodes, les valeurs des coefficients fréquentiels entre fmax et 2fmax (voir formule (1.2)) existent dans la

transformée de Fourier des images acquises. De plus, l’hypothèse de positivité sur les données pourrait permettre de repousser cette limite [100]. Dans la suite on appelle widefield l’image obtenue avec le système optique sans traitement, en plein champ.

Plusieurs paramètres doivent être pris en compte pour caractériser une méthode de super-résolution, comme souligné par Schermelleh, Heintzmann et Leonhardt-dans [99]. En effet, si le gain de résolution est évidemment un point très important (séparation de points, épaisseurs de filaments, etc.), d’autres critères sont à respecter.

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1.3. Techniques de super-résolution en microscopie à fluorescence 19 En particulier la phototoxicité, très particulièrement liée à la possibilité d’étudier des phénomènes vivants ; en effet la projection d’une forte lumière sur l’échantillon peut tuer celui-ci, et donc empêcher ou altérer une mesure sur plusieurs minutes ou heures. Deux autres points sont importants, comme la facilité à créer les échantillons et aussi à utiliser la technique ainsi que la possibilité de faire de la colocalisation ; en effet il peut arriver de vouloir étudier l’interaction entre deux objets biologiques, marqués alors par des fluorophores répondant à des longueurs d’onde différentes, (on utilise le système de super-résolution deux fois, une fois avec chaque longueur d’onde). On souhaite alors que les deux images obtenues puissent être comparées spatialement, afin de caractériser le lien entre les deux objets biologiques.

Il est important de souligner également que les systèmes de super-résolution ont souvent pour but de valider ou non une hypothèse formulée par un biologiste, il est donc important que ce dernier ait “confiance” dans les résultats, connaisse les limites du système et en particulier que ce système ne l’induise pas en erreur quant à la validité de ses hypothèses. Ceci est encore plus vrai lorsque le biologiste utilise le système pour émettre une hypothèse, établie d’après l’observation des données. La connaissance et la gestion des artefacts est donc un point très important pour la super-résolution.

1.3.1 STED

La microscopie STED, en fran¸cais Déplétion par Émission STimulée, a été pu-bliée en 1994 dans [56] par Hell, et réalisée physiquement pour la première fois en 2000. Cette technique utilise le fait qu’il existe en fait un autre moyen pour le fluo-rophore de retourner dans son état fondamental : l’émission stimulée. On illumine le fluorophore juste après l’excitation par une longueur d’onde correspondant à son énergie de transition, ce qui le désexcite sans libérer de photon.

Le STED est utilisé avec un microscope à balayage laser, et utilise l’émission simulée ; on utilise d’abord le système normalement (avec la PSF usuelle), puis on projette juste après, par l’intermédiaire d’un autre laser, un faisceau dit “STED” ou d’émission stimulée dont la longueur d’onde appartient au spectre d’émission de la molécule. Ce faisceau a la forme d’un anneau, permettant de ne laisser excités que les fluorophores au centre (cf figure 1.6). Il est à noter que les fluorophores en périphérie (dans l’anneau) ont été doublement éclairés par rapport au confocal et saturés. Comme spécifié dans [39], l’anneau de déplétion est obtenu le plus souvent grâce à un masque de phase placé sur le chemin optique du faisceau STED même si

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des alternatives sont possibles [123]. Comme expliqué dans [37], plus on augmente l’intensité du faisceau d’émission stimulée, plus la zone de fluorescence finale est diminuée, sans réelle limite et surtout de manière non linéaire. Il est à noter que les deux lasers ont le plus souvent un chemin optique différent, afin que l’un ait la forme usuelle de la PSF et le second la forme d’anneau.

Figure 1.6:Illustration simplifiée du principe du STED ; de gauche à droite : illumination projetée sur l’échantillon (tache optique conventionnelle, PSF) - faisceau de déplétion STED, de la forme d’un anneau - illumination excitatrice équivalente qui en résulte. Sans aucun doute le faisceau de déplétion a permis de réduire la taille de la PSF, en désexcitant les photons en périphérie de la PSF conventionnelle ; ces derniers ont par contre été doublement éclairés : une fois par la PSF usuelle à gauche et une fois par le faisceau de déplétion (au milieu).

Une image obtenue sur des microtubules est présentée sur la figure 1.7 où l’on peut clairement voir que le STED permet de dépasser la limite de résolution du widefield.

D’autres comparaisons peuvent être vues par exemple dans [99] ou [25], où la forme du neurone est mise en avant grâce au STED. Dans [54], Hell et al. prouvent que la limite de diamètre atteinte par le STED est décrite par la formule

λ

2NAp1 + IS/I

,

où λ est la longueur d’onde utilisée, NA l’ouverture numérique de l’objectif, IS

l’inten-sité du faisceau de déplétion et I l’intenl’inten-sité des fluorophores. D’après cette formule, le moyen d’augmenter la résolution (en réduisant ce diamètre) est donc d’augmenter l’intensité du faisceau de déplétion Is, pouvant mener à la destruction des cellules,

(22)

1.3. Techniques de super-r´esolution en microscopie `a fluorescence 21

(a) Imagerie conventionnelle (b) STED (c) Profil microtubule

Figure 1.7:Exemple de super-résolution par méthode STED : (a) image obtenue par un microscope widefield (et donc limité par la formule de Abbe), (b) image obtenue par un microscope Leica avec technologie STED (taille du pixel∼25 nm). Les protéines fixées sur les microtubules ont été excitées avec une longueur d’onde de 488 nm. On peut voir que l’image de droite est plus résolue (comme montré sur le profil d’une microtubule en (c)) et laisse apparaˆıtre des séparations non visibles sur celle de gauche.

Image de microtubules dans une cellule de drosophile par Cazares-Chao-Andlauer-J. et C. Galbraith disponible sur cellimagelibrary.org, licence CC BY-NC-ND 3.0

1.3.2 Microscopie `

a mol´

ecule unique

Il existe différentes techniques de la microscopie à molécule unique, parmi les plus connues, le PALM [17] et le STORM [98]. Ces deux techniques ont été créées en 2006 par deux laboratoires différents mais reposent sur le même principe : seul un petit nombre de fluorophores sont excités, stochastiquement, à chaque prise d’image, de manière à ce que deux fluorophores très proches aient une très faible probabilité d’être excités (et donc d’émettre de la lumière) au même moment. Une caméra enregistre ensuite un très grand nombre d’images obtenues par ce processus, avec activation de différents fluorophores. Comme précisé auparavant, toute source ponctuelle plus petite que la limite de diffraction renvoie une tache de la forme de la PSF. Sur chaque image enregistrée, on retrouve donc une somme de PSFs, isolées, créées par les sources ponctuelles éclairées. La forme de la PSF étant connue, on peut déterminer la position et l’intensité de chacun des fluorophores avec une bonne précision. Ce processus est effectué pour chaque image et finalement l’ensemble des positions et intensités permet de créer l’image finale, super-résolue. La figure 1.8 présente des résultats obtenus dans [106], les structures détectées par le PALM n’auraient pu être devinées sans super-résolution, en particulier sur l’image widefield, les deux canaux, vert et

(23)

rouge, semblent se recouvrir l’un l’autre alors que l’un se révèle plutôt constitué de structures continues (en rouge) et l’autre de structures ponctuelles (en vert).

(a) Microscope optique (b) R´esultat PALM

Figure 1.8: Illustration du PALM sur une image réelle : l’image (a), limitée par la diffraction, l’image (b) représente la même structure imagée par un système de super-résolution PALM. Les images originales ne sont pas à la même résolution (le pixel est plus petit sur l’image PALM). Le gain en super-résolution est indéniable, et les structures qui semblaient se recouvrir complètement en (a) s’avèrent en fait assez différentes, les protéines vertes formant des sources beaucoup plus ponctuelles que les rouges.

Image par Catherine et James Galbraith, correspondant `a la figure 4 de l’article [106] et rendue disponible par les auteurs sur cellimagelibrary.org, licence CC BY-NC-ND 3.0

Dans [84], Mortensen et al. prouvent que la pr´ecision de la position du fluorophore est donn´ee par

s σk+ rc2/12 N 16 9 + 8πσkb2 r2 cN , (1.3)

avec N le nombre de photons collect´es par fluorophore, σk la variance de la PSF,

souvent approxim´ee Gaussienne, rc la taille du pixel de la camera et b le nombre de

photons dans le fond de l’image, consid´er´e constant.

Il est à noter que la super-résolution obtenue par cette méthode repose sur le fait que les molécules sont excitées stochastiquement. En effet, si par hasard deux molécules séparées par une distance plus petite que (1.1) étaient allumées simul-tanément, l’ajustement avec la PSF ne ferait pas apparaˆıtre les deux molécules mais situerait le fluorophore au milieu de la tache créée par la somme des deux spots. Cela signifie qu’il faudrait que très peu de molécules soient excitées en même temps, ce qui requiert un grand nombre d’images et donc un temps d’acquisition assez long.

(24)

1.3. Techniques de super-résolution en microscopie à fluorescence 23 Très récemment, en 2014 et 2016, deux articles ont développé des méthodes va-riationnelles autour des techniques à molécules uniques, par exemple l’algorithme FALCON - pour FAst Localization algorithm based on a CONtinuous-space formu-lation en anglais [82] ou l’algorithme SPIDER - pour Sparse Image DEconvolution and Reconstruction en anglais [63]. Dans le premier article, un algorithme en trois étapes est proposé pour traiter des données de PALM/STORM assez denses (et donc où plusieurs points sources pourraient interagir) : une déconvolution avec pénalisation au sens de la norme L1, suivie d’une localisation grossière des différentes molécules puis une recherche précise de position et intensité pour chacune d’entre elles, cher-chant la PSF translatée la plus proche des données obtenues. Pour le second article, une pénalité de type L0 (c’est-à-dire sur le nombre de pixels non nuls) est utilisée ;

si le problème n’a pas de solution explicite, un schéma itératif peut être créé, don-nant des résultats concluants sur des données simulées mais pour l’instant très peu de résultats sur données réelles existent. Il est à noter que la création d’échantillons utilisables avec cette technique est assez compliquée et requiert des experts dans le domaine, rendant plus difficile son utilisation.

1.3.3 Structured Illumination Microscopy - SIM

Dans le SIM, publié en 2000 par Gustafsson [46] et inspiré par Heintzmann [55], un ensemble de grilles est projeté sur l’échantillon biologique u. Ces grilles s’écrivent sous la forme

∀x ∈ R2_{, m}i,θ_{(x) = M}

0(1 + α cos(hkθ, xi + φi)) .

La transformée de Fourier de mi,θ _{se formule comme une somme pondérée de}

distri-butions de Dirac, en 0 et ±kθ. Soit Iui,θ l’image cr´e´ee par l’utilisation de la grille mi,θ,

sa transform´ee de Fourier est donn´ee par

c

Iui,θ(ξ) = M0u(ξ) + Mˆ 0α′ u(ξ + kˆ θ)eiφi + ˆu(ξ− kθ)e−iφi

b

ϕ(ξ) + cni,θ_(ξ),

où ϕ est la PSF du système, à bande-limitée, vérifiant donc ∀ξ ∈ R2 _{| ξ ∈ B(0, f}

max), ϕ(ξ) = 0,b

où_{B(0, f}max) est la boule de rayon fmax centrée sur la fréquence 0. Cela signifie que

∀ξ ∈ R2 _{| |ξ| > f}

max, cIui,θ(ξ) = 0. Cependant, on peut voir que la transform´ee de

Fourier de la mesure à la fréquence ξ contient les valeurs de la transformée de Fourier de l’échantillon pour des fréquences entre ξ_{− k}θ et ξ + kθ, c’est-à-dire supérieures à

(25)

fmax. Ces composantes peuvent être séparées si le nombre de phases φi pour chaque

θ est supérieur à 3 puis la fusion de toutes les composantes est faite grâce à un filtre de Wiener. La figure 1.9 résume le principe du SIM.

1 fmax −fmax 2 3 4 2fmax −2fmax

Figure 1.9: Illustration du SIM avec_|kθ| = fmax : (1) les fréquences des images créées au sein du

microscope sont à bande limitée, de fréquence maximale fmax, les coefficients fréquentiels présents

dans la mesure sont donc ceux contenus à l’intérieur du cercle noire (2) transformée de Fourier de la grille mi,0_{utilisée par le SIM, constituée de 3 distributions de Dirac, (3) les coefficients fréquentiels}

de l’image obtenue grˆace `a l’acquisition mi,0_{sont contenues dans un domaine plus grand que celui}

des images initiales, mais uniquement dans une direction provilégiée ; le nouveau domaine est celui à l’intérieur de l’union des cercles rouges et noirs, (4) grâce aux acquisitions mi,θ _{pour θ}

∈ {0,π 3,

2π 3},

le domaine des fréquences de l’échantillon representés dans les mesures est élargi dans différentes directions. Ce domaine est délimité par les cercles colorés. On peut voir que grâce à la forme particulière de la grille, des fréquences contenues entre fmaxet 2fmaxpeuvent être calculées.

La figure présentée s’inspire de la figure de l’article de Gustafsson [46] présentant la technique SIM.

L’avantage du SIM est qu’il s’agit d’une technique plein champ et lin´eaire. Uni-quement 9 images sont n´ecessaires : 3 valeurs de φi pour chaque angle θ, et 3 valeurs

de θ, rendant la méthode très rapide. Cependant une erreur d’estimation des pa-ramètres (notamment φi, |kθ|, à cause du bruit ou d’un mauvais alignement des

optiques par exemple) pour une des mesures peut très fortement altérer le résultat final. C’est pourquoi les méthodes d’Illumination Scanning Microscopy, qui scannent localement l’échantillon semblent plus adaptées car chaque image concerne une pe-tite partie de l’échantillon (et altère donc moins le résultat final) et la redondance d’informations apporte plus de confiance quant au résultat obtenu.

1.3.4 Interpr´

etation des m´

ethodes ISM

Dans les méthodes ISM, l’échantillon biologique, u, est scanné à un certain nombre de positions, notées (Xs)s∈{1,...,S}, en utilisant une distribution lumineuse, pouvant

être dépendante de la position, Ds; l’image observée sur la caméra est une fonction en quatre dimensions, les deux premières correspondant au pixel caméra, Xc, les deux

(26)

1.3. Techniques de super-résolution en microscopie à fluorescence 25 autres à la position Xs :

Iu(Xs, Xc) = ((u(·) × Ds(· − Xs))∗ ϕ(·)) (Xc). (1.4)

Dans le chapitre 3, on prouve que, comme dans le SIM, il est possible de doubler le domaine des fréquences mesurées avec les méthodes ISM. En effet, la transformée de Fourier 4-dimensions de (1.4) s’écrit, comme nous le verrons dans le chapitre 2, sous la forme b Iu(η) =ϕ(ηb 34) cDs(−η12)û(η12+ η34), η = η12 η34 (1.5) avec η12∈ B(0, fmax), η34∈ B(0, fmax) et donc η12+ η34∈ B(0, 2fmax), ce qui signifie

que les fréquences de l’échantillon u dans la boule _{B(0, 2f}max) sont présentes dans

les acquisitions bIu.

La discrétisation d’un problème de type (1.4) est le sujet du chapitre 3; pour les méthodes ISM en microscopie, il est assez rare de trouver une description détaillée de la discrétisation, mais pour les techniques de super-résolution plus générales, sur images naturelles, utilisant plusieurs images basse résolution, avec, parfois, un mou-vement de la caméra, pour créer une image super-résolue, la bibliographie est plus dense [92]. On peut voir que l’opérateur ISM peut se décomposer en opérations simples, à savoir

Iu = DM Hu,

où la matrice de convolution H est une matrice de Toeplitz dont chaque ligne est composée du noyau (ou plus exactement ici la PSF) translaté, celle de multiplication M est une matrice diagonale et D est la matrice de sous-échantillonnage. Dans [79], Marquina et Osher choisissent une matrice D, décomposée en Dx et Dy, avec

Dx =      1 1 0 0 . . . 0 0 0 0 1 1 . . . 0 0 ... . .. ... 0 0 0 0 . . . 1 1     ,

et Dy défini symétriquement, c’est-à-dire D effectue la moyenne des pixels

super-résolus correspondant au pixel sous-résolu. Dans [26], une méthode d’interpolation bilinéaire est utilisée et dans [40], le sous-échantillonnage est choisi en prenant un point sur z, où z est le facteur de zoom entre l’image caméra et l’image super-résolue. Dans notre cas, on verra que le fait que le signal créé soit bande limitée permet un

(27)

sous-échantillonnage sans perte d’information, en “coupant” l’image du spectre dis-cret, la fréquence de coupure étant donnée par la valeur discrète de fmax.

Il est important de noter que les techniques de super-résolution citées ci-avant s’appuient sur l’aliasing, c’est-à-dire le mélange des hautes et basses fréquences de l’image recherchée, obtenu en choisissant un pas d’échantillonnage trop grand (par rapport à celui requis par le théorème de Shannon), comme expliqué par Simp-kins et Stevenson dans [107]. En microscopie, au contraire, le pas d’échantillonnage est choisi de manière à éviter de phénomène d’aliasing. Cette hypothèse de bon échantillonnage nous a motivés à choisir l’interpolation de Shannon pour modéliser le lien entre l’image continue et sa discrétisation ; cette interpolation proposée par Abergel et Moisan [3] découle directement du théorème de Shannon, supposant que l’image super-résolue à retrouver est à bande limitée. Ce formalisme nous permet, puisque la PSF ϕ et les illuminations Ds _{sont à bande limitée, de définir la}

dis-tance minimale nécessaire entre deux points de scan. De plus, une définition des opérations de type translation (nécessaire car les distributions lumineuses ne sont pas nécessairement projetées au même endroit de la caméra), zoom et zoom arrière, dans le cas de signaux à bande limitée, dérive de la définition de l’interpolée de Shannon. Il faut néanmoins se rappeler que l’utilisation de la transformée de Fourier discrète induit une hypothèse de périodicité implicite qui requiert d’être attentif aux opérations de convolution (qui avec l’utilisation de la DFT est par définition une convolution périodique) et de multiplication (puisqu’il s’agit d’une convolution dans le domaine de Fourier). Un algorithme complet est donc proposé dans le chapitre 3.

Parmi les m´ethodes ISM les plus connues, on peut citer

— l’imagerie conventionnelle : l’image obtenue par ce système est créée en som-mant les images obtenues sur la caméra ; on démontre dans le chapitre 3 que la PSF d’un tel système est en fait la même que celle du microscope ;

— le pixel-reassignement : consiste à assigner le signal enregistré pour une acquisi-tion à une posiacquisi-tion entre la posiacquisi-tion laser et la posiacquisi-tion caméra, le plus sou-vent au milieu. Cette technique est aujourd’hui utilisé par le système Airyscan [61], [62]. Depuis 2017, [68], [67], ce module est utilisé sur des cellules vivantes et a montré sur des mitochondries ses performances en terme de résolution, sans altérer ni tuer la cellule. Dans [62], une comparaison entre le SIM et le système Airyscan est effectuée ; dans les meilleures conditions, le SIM semble plus performant en terme de résolution. Cependant les “meilleures conditions” ne sont pas toujours réunies en microscopie (échantillon fin, bien marqué, avec

(28)

1.3. Techniques de super-résolution en microscopie à fluorescence 27 un nombre de photons assez élevé etc), et dans ce cas le système AiryScan reconstruit des images plus précises, avec moins d’artefacts ;

— l’imagerie confocale : un faisceau laser scanne l’échantillon et filtre la lumière renvoyée au moyen d’un sténopé, c’est-à-dire un trou de très faible diamètre. Comme présenté sur la figure1.10, la tache d’Airy est très concentrée spatia-lement au plan focal et s’étale dans les plans suivants ; les photons capturés assez loin du rayon d’Airy proviennent alors vraisemblablement des plans défocalisés et sont donc éliminés grâce au diaphragme.

z = 0 nm z = 400 nm z = 700 nm

Figure 1.10:Sections xy normalisées de la tache d’Airy, modélisant la tache optique du microscope optique, pour 3 valeurs de z : 0, 400 et 700 nanomètres ; en dessous, on peut voir les profils verticaux des 3 taches. Les images étant normalisées, la différence entre 0 et 400 nanomètres est peu visible à l’œil nu, mais le profil montre la différence de répartition de l’énergie ; à 700 nanomètres, la forme même de la tache est modifiée. Les profils défocalisés, à 400 et 700 nanomètres, ont une plus grande proportion d’énergie en dehors du cercle centré sur le milieu de l’image et de rayon ra.

Remarque. Le diaphragme du confocal est placé devant le détecteur créant l’image, ce qui signifie que la quantité de lumière projetée sur l’échantillon est la même qu’avec l’utilisation d’un système conventionnel.

Plus le diaphragme est petit, plus l’image semble nette, mais plus l’intensité recueillie est faible. Il faut donc éclairer l’échantillon avec un laser plus fort pour obtenir une même intensité finale. Sur la figure 1.11, on peut voir une

(29)

comparaison entre les systèmes widefield et confocal, avec un diaphragme égal à 1.3 fois le rayon d’Airy. Sans nul doute la résolution obtenue est meilleure.

(a) Widefield (b) Confocal (c) Profil du “donut”

Figure 1.11: Comparaison entre widefield et confocal : (a) image obtenue par un microscope optique widefield en plein champ, dont la résolution est définie par la limite de Abbe (1.1), (b) même image obtenue grâce à un système confocal. Le gain obtenu par le confocal est indéniable : sur le canal vert les filaments sont plus fins, mieux séparés, sur le canal rouge, la forme “donut” d’un des éléments apparaˆıt (dont le profil est représenté en (c)). Le confocal est aujourd’hui une des techniques les plus répandues en microscopie à fluorescence.

Image obtenue sur un ´echantillon de type FluoCells de ThermoFisher, le canal rouge repr´esente les mitochondries et le vert l’actine.

1.3.5 Comparaison des m´

ethodes ISM

Pour comparer les méthodes, dans le chapitre 2, on compare les Fonctions de Transfert Optiques, notées OTF, des systèmes associés à ces méthodes, c’est-à-dire les transformées de Fourier des PSF équivalentes. En particulier, on s’intéresse aux valeurs des OTF autour de la fréquence±2fmax: plus ces coefficients sont élevés, plus

les composantes fréquentielles de l’échantillon autour de 2fmax sont capturées dans

les acquisitions produites par la technique. Le calcul des OTFs pour les 3 méthodes est détaillé dans le chapitre 3, on présente ici simplement les profils du module des OTF, sur la figure 1.12, avec une comparaison avec un (hypothétique) conventionnel de double résolution ; deux tailles de diaphragme pour le confocal sont présentées. On peut voir que les coefficients des OTF autour de 2fmax sont bien moins bons

que ceux de ce conventionnel hypothétique à résolution double. Les méthodes du confocal et du pixel-reassignement présentent néanmoins un réel gain par rapport au conventionnel réel.

(30)

1.4. Résolution de problèmes inverses par méthodes non linéaires 29

Figure 1.12: Comparaison des profils des OTF pour les trois reconstructions linéaires : conven-tionnelle, confocale (pour deux valeurs de diaphragme), pixel-reassignement ainsi que celui d’un hypothétique système conventionnel de résolution doublée. Pour le conventionnel, on a exactement la PSF, donc le signal est limité à fmax; pour les autres techniques, des fréquences entre fmax et

2fmax sont non nulles. Les meilleurs r´esultats sont obtenus pour le pixel-reassignement ; quant au

confocal, plus le diaphragme se réduit, plus le support des coefficients fréquentiels non nuls s’agran-dit, mais on rappelle que plus le diaphragme se réduit, plus le nombre de photons compté est faible, ce qui peut nécessiter d’éclairer l’échantillon plus intensément. On note cependant qu’on n’atteint pas les performances d’un conventionnel de fréquence maximale 2fmax.

Ces techniques sont des techniques de reconstruction linéaire. D’autres types de reconstructions peuvent être obtenues en considérant le problème ISM comme un problème inverse.

1.4 R´

esolution de probl`

emes inverses par m´

ethodes

non lin´

eaires

´

Etant donn´e un signal x : Ω → R, avec card(Ω) = p, on observe y : Ω′ _{→ R,}

avec card(Ω′_{) = n. Formellement, on définit un problème inverse linéaire par}

Hx = y, (1.6)

— y ∈ Cy ⊂ Rn les donn´ees observ´ees,

— H ∈ Mp,n un op´erateur lin´eaire connu,

— x _{∈ C}x ⊂ Rp le vecteur inconnu que l’on cherche `a retrouver.

Les problèmes inverses sont très présents autour de nous : par exemple en géophysique pour chercher l’origine d’un séisme grâce aux ondes émises lors de ce dernier, en

(31)

chimie pour déterminer des constantes de réactions, en météorologie pour prédire le temps, etc. On rappelle qu’un problème inverse est bien posé au sens d’Hadamard si la solution existe, est unique et dépend continûment de la donnée y [49] ; ce n’est, en général, pas le cas de la déconvolution ; en particulier, la solution n’est pas toujours stable par rapport à de légères perturbations du signal de départ y.

Remarque. Dans (1.6), le problème est considéré en une dimension ; dans cette thèse on s’intéresse plus particulièrement aux images, en deux dimensions. Le pas-sage d’une image x à un vecteur équivalent se fait en concaténant les lignes ou les colonnes de l’image x. On notera parfois x ∈ RΩ_{, o`}_{u R}Ω _{représente les fonctions de}

Ω dans R, avec Ω =_{{0, . . . , p}x− 1} × {0, . . . , py− 1}, et card(Ω) = px× py = p ; les

notations Rp _{et R}Ω _{sont alors ´equivalentes.}

Dans le cas de la super-résolution et des méthodes à balayage laser, le problème inverse est le suivant : retrouver la distribution des marqueurs fluorescents placés sur le spécimen biologique à partir d’images acquises en scannant l’échantillon (avec éventuellement un faisceau projetant une distribution lumineuse particulière). Les images d’entrée y sont enregistrées sur une caméra dont les pixels forment ce que l’on appelle la grille “sous-résolue”, alors que l’image super-résolue x est calculée sur une grille plus fine, afin de pouvoir reconstruire des structures à plus petite échelle. Dans cette thèse, on considère uniquement une grille k fois plus fine que celle de la caméra, avec k ∈ N∗_{. L’ensemble C}

x auquel appartient la solution est Cx = Rp+.

L’opérateur H, dans la définition du problème inverse (1.6), modélise toutes les étapes permettant de passer de l’image x super-résolue aux images scannées y, c’est-à-dire les Ix de la Formule (1.4) ; il doit modéliser notamment la multiplication avec la

distribution de lumière projetée par le faisceau laser, la convolution par la PSF et le changement de résolution.

Afin de tester les méthodes proposées sur un problème plus simple, on s’intéresse également dans cette thèse au problème de déconvolution sous contrainte de posi-tivité, dans les chapitres 4 et 5. On rappelle donc la définition de la convolution. L’opérateur H représente dans ce cas le noyau de convolution uniquement, y est une version convoluée et bruitée de x, l’image recherchée. L’écriture du problème est cependant identique ; c’est pourquoi dans la suite (hormis sur la figure 1.14 où l’on traite de la déconvolution), l’opérateur H peut représenter de la même manière l’opérateur de déconvolution ou de super-résolution, sauf si précisé autrement. Remarque. Le modèle utilisé dans cette thèse est le modèle “complet”, c’est à dire que toutes les images mesurées sont utilisées et intégrées dans le modèle. D’autres

(32)

1.4. Résolution de problèmes inverses par méthodes non linéaires 31 techniques utilisent les images mesurées pour, dans un premier temps, créer une image de la zone complète scannée (image équivalente à un système conventionnel ou confocal par exemple), puis cette image est déconvoluée en utilisant des méthodes de déconvolution traditionnelles. En particulier, on peut noter l’utilisation de la méthode de Richardson-Lucy [77][95], qui date des années 70 mais qui est très utilisée dans le domaine de la microscopie, principalement car elle a été développée pour des images bruitées par bruit de Poisson. En 1990, Bertero l’utilise sur l’image d’un système confocal [13] avec la régularisation de Tikhonov, et plus récemment, en 2006, on peut noter son utilisation avec la régularisation par variation totale dans [32].

En traitement d’image, les problèmes inverses sont également nombreux : le débruitage, l’inpainting, l’estimation du flou de bougé etc. Dans cette thèse, on s’intéresse particulièrement à la déconvolution. Soit h un noyau de convolution (géné-ralement positif et à support limité), la formulation continue de ce problème inverse est donnée sur Rd_{, avec d = 2 dans le cas des images, par}

∀t ∈ Rd_{, y(t) =}

Z

Rd

x(s)h(t− s)ds (1.7)

et sa formulation discr`ete par

∀m ∈ Zd_{, y(m) =} X

n∈Zd

x(n)h(m− n).

Un exemple d’image convoluée avec un noyau gaussien est présenté sur la fi-gure 1.13. L’effet de cette opération est de flouter l’image. L’image convoluée est la somme pondérée des noyaux recentrés en chaque pixel de l’image originale, la pondération étant la valeur initiale du pixel. Les détails vraiment fins de l’image sont donc perdus, comme la séparation de certains filaments (en vert) ou de certaines billes (en bleu). Dans cette configuration, le problème inverse est : étant donnés l’image floutée et le noyau de flou, retrouver l’image originale. Dans le cas de la déconvolution, la transformée de Fourier joue un rôle très important car le problème (1.7) peut s’exprimer (en gérant correctement le calcul au bord du domaine de l’image) dans l’espace de Fourier comme une simple multiplication. Puisque les noyaux (gaussiens ou la tâche d’Airy) sont des noyaux passe-bas, l’image convoluée contient essentiel-lement les basses fréquences de l’image originale, ce qui explique le résultat cohérent avec la figure 1.5.

Une approche très utilisée pour résoudre un problème inverse de type (1.6), avec H connu, consiste à lui associer une énergie, que l’on cherche à minimiser. Cette

(33)

∗ =

(a) Image originale (b) Noyau (c) Image convolu´ee

Figure 1.13: Illustration de la convolution : (a) image originale, représentant des fibroblastes, (b) noyau de convolution gaussien d’écart type σ = 3 (représenté avec des pixels plus gros pour plus de visibilité), (c) résultat de la convolution. On peut voir que la convolution a rendu l’image de départ floue ; en particulier on ne distingue plus toutes les séparations, entre les filaments sur le canal vert ou entre les billes sur le canal bleu.

Image de fibroblaste (l’image pr´esent´ee est un extrait de l’image originale) par Jan Schmoranzer pour l’Olympus BioScapes Digital Imaging Competition 2007, rendue disponible sur le site cellima-gelibrary.org, licence CC BY-NC-ND 3.0.

énergie cherche à évaluer la différence entre les données mesurées y et le modèle appliqué à l’image proposée comme solution, Hx. Son expression est directement liée au modèle de bruit considéré pour la mesure ; comme précisé avant, on s’intéresse plus particulièrement, dans cette introduction, au bruit de Poisson.

1.4.1 Estimateur MAP sous contrainte de positivit´

e

En reprenant les notations de (1.6), on considère que la valeur de y au pixel i, notée yi, est la réalisation d’une variable aléatoire Yi de Poisson de paramètre (Hx)i

(on a alors Cy = NΩ ′

, d’après la définition de la loi de Poisson), c’est-à-dire ∀i ∈ {1 . . . n}, P(Yi = yi|(Hx)i) =

(Hx)yi

i e−(Hx)i

yi!

.

L’hypothèse de bruit de Poisson induit une hypothèse de positivité sur la donnée à retrouver. Une méthode assez usuelle, appelée Maximum A Posteriori, MAP, consiste à chercher le signal (l’image en deux dimensions) le plus probable ayant engendré les données obtenues. L’estimateur MAP est alors donné par

argmax

x∈RΩ

+

(34)

1.4. Résolution de problèmes inverses par méthodes non linéaires 33 qui peut être calculé par la formule de Bayes,

xM AP = argmax x∈RΩ + p(x|y) = argmax x∈RΩ + p(x) p(y)p(y|x) (1.8)

En supposant l’ind´ependance de tous les Yi, on peut ´ecrire la log-vraisemblance

L(x) = log n Y i=1 P_(Y_i _{= y}_i_|(Hx)_i₎ ! = n X i=1 yilog((Hx)i)− (Hx)i− log(yi!), (1.9)

et on associe au probl`eme l’´energie Ey(x) =

X

i

(Hx)i− yilog((Hx)i), (1.10)

(on élimine le dernier terme log(yi!) qui ne dépend pas de x). Il y a donc équivalence

entre le calcul de l’estimateur du Maximum a Posteriori et la r´esolution d’un probl`eme variationnel, la minimisation de Ey : xM AP = argmax x∈RΩ + p(x_{|y) = argmin} x∈RΩ + Ey(x)

Un algorithme de gradient projeté, accéléré par Nesterov [87] et amélioré par Weiss [122], permet une convergence effective en pratique (contrairement à beau-coup d’autres algorithmes) tout en restant très simple d’implémentation, puisqu’il nécessite uniquement de connaˆıtre l’opérateur adjoint de H, H∗_{. Cependant,}

l’esti-mateur MAP produit un artefact appelé night sky par Bertero et al. dans [14] : toute continuité est perdue dans le signal final, constitué de points isolés. Cela est dû au fait que lors de la déconvolution, l’estimateur crée des hautes fréquences, qui, à cause de la contrainte de positivité, deviennent, dans le domaine spatial, des oscillations entre valeurs positives, plus élevées que le signal de base, et nulles. Sur la figure 1.14, ce phénomène de night sky est bien mis en évidence.

1.4.2 Algorithmes d’approximation du MAP

L’étude du night sky, présentée dans le chapitre 4, montre que cet artefact ap-paraˆıt au cours des itérations, au fur et à mesure de la convergence vers le minimum exact de la fonctionnelle ; des déformations progressives des structures continues sont visibles avant que l’image ne soit compose que de sources totalement isolées. Il est intéressant de noter que l’utilisation d’un simple algorithme de gradient projeté, qui

(35)

était pendant longtemps la technique utilisée pour résoudre ce problème, à nombre d’itérations fixé (de manière à obtenir un temps de calcul raisonnable) présente très rarement cet effet de night sky, sauf si l’image est très petite ou le nombre d’itérations très important. Cet algorithme est en fait beaucoup moins efficace pour minimiser l’énergie que l’algorithme optimisé de Nesterov, à cause de la dimension élevée du problème (donnée par le nombre de pixels de l’image), et ce manque d’efficacité a donc paradoxalement un effet positif. Ainsi, les algorithmes couramment utilisés bénéficient aussi de leur relative inefficacité à converger. Comme nous le montrons dans le chapitre 4, seule l’utilisation d’un algorithme accéléré (de type Nesterov) permet de mettre en évidence ce défaut majeur de l’estimateur MAP.

Une méthode non satisfaisante mathématiquement (car on ne sait pas décrire précisément le résultat obtenu) consiste à stopper les itérations au cours de l’al-gorithme. Cela permet d’obtenir une image sans night sky mais avec les effets de la déconvolution ; cependant, il faut trouver un critère d’arrêt de l’algorithme pour avoir une image convenable. L’algorithme de Richardson-Lucy par exemple, couram-ment utilisé en microscopie, est très souvent stoppé après une dizaine d’itérations, car ensuite il est connu pour décrire de plus en plus, au cours des itérations, le bruit altérant l’image originale que l’image elle-même. Dans le chapitre4, on propose, dans le cas du bruit additif Gaussien, un critère d’arrêt qui soit cohérent avec les statis-tiques de ce bruit.

De nos jours, les algorithmes d’approximation du MAP sont le plus souvent uti-lisés avec une régularisation, permettant d’ajouter une contrainte sur la solution, et par là même, de limiter le night sky.

1.4.3 R´

egularisation

Dans ce cas, on minimise l’´energie Ey, mais en y ajouttant un terme, appel´e prior,

caractérisant une propriété de l’image x à retrouver. On présente 2 priors assez connus et utilisés en microscopie, comme précisé avant, Tikhonov et la Variation Totale (TV en anglais). On cherche alors à résoudre le problème suivant

argmin

x∈C

Ey(x) + λR(x),

le second terme R(x) étant le terme de régularisation, pondérée par un paramètre λ > 0. Une régularisation de type Tikhonov [115] consiste à prendre la fonction R(x) égale à la norme ℓ2 _{du vecteur recherché}

Algorithmes de super-résolution pour la microscopie à balayage laser avec modelage de faisceau par diffraction conique

HAL Id: tel-02468152

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02468152

balayage laser avec modelage de faisceau par diffraction

conique

Anne-Sophie Mace

To cite this version:

Algorithmes de super-r´

esolution pour la

microscopie `

a balayage laser avec modelage de

faisceau par diffraction conique

Super-resolution algorithms for laser scanning

microscopy with illumination patterns shaped by

conical diffraction

Par Anne-Sophie Mac´

e

Thèse de doctorat de Mathématiques Appliquées

R´

esum´

e

Contents

Chapitre 1

Introduction

1.1

Formation de l’image et mod´

elisation du bruit

li´

e `

a la mesure

1.1.1

Formation de l’image sur le capteur

1.1.2

Analyse des bruits pr´

edominants

1.2

Limitation fr´

equentielle d’un syst`

eme optique

1.3

Techniques de super-r´

esolution en

microsco-pie `

a fluorescence

1.3.1

STED

1.3.2

Microscopie `

a mol´

ecule unique

1.3.3

Structured Illumination Microscopy - SIM

1.3.4

Interpr´

etation des m´

ethodes ISM

1.3.5

Comparaison des m´

ethodes ISM

1.4

R´

esolution de probl`

emes inverses par m´

ethodes

non lin´

eaires

1.4.1

Estimateur MAP sous contrainte de positivit´

e

1.4.2

Algorithmes d’approximation du MAP

1.4.3

R´

egularisation