VFT2, un domaine atypique

Ces travaux ont été valorisés par la publication d’un article dans le journal PNAS présenté ci- après (Herrou et al., 2010) dans lequel je suis second auteur co-équivalent avec les Drs. Coralie Bompard et René Wintjens.

a. Periplasmic domain of the sensor-kinase BvgS reveals a new paradigm for the Venus flytrap mechanism.

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b. Résumé

NB : les figures et tableaux mentionnés correspondent à celles de l’article ci-dessus.

Dans ce travail, des protéines recombinantes correspondant à chacun des domaines VFT1 et VFT2 ont été produites afin de déterminer leur capacité de fixation de ligands en utilisant la technique du Thermal Shift Assay (TSA) et j’ai pu participer au criblage des molécules par cette technique. Selon ce test, qui consiste à mesurer la température de dénaturation thermique d’une protéine seule ou en présence d’un ligand potentiel, la protéine recombinante VFT2 semble beaucoup plus stable que celle de VFT1 qui a été plus difficile à travailler. Cette technique n’a pas permis la mise en évidence d’un ligand potentiel pour VFT1. Au contraire, VFT2 s’est avéré être stabilisé par des molécules comme le nicotinate et des analogues de cette molécule, possédant un cycle aromatique et un groupement carboxylate, à des concentrations millimolaires relativement élevées de ces composés (Table 1). Ces composés ont tous été décrits comme modulateurs de la virulence chez B. pertussis. Ainsi, il semblerait que le VFT2 soit le site de fixation des modulateurs négatifs de la virulence de ce type. En revanche, le sulfate de magnésium n’a pas eu d’effet stabilisateur sur VFT2. Ceci n’exclut cependant pas qu’il puisse se fixer à VFT2 sans le stabiliser de façon détectable dans les conditions testées. Ceci serait d’ailleurs suggéré par la réponse de BvgSF317A aux deux types

de modulateurs (voir ci-dessous).

La protéine recombinante VFT2 a pu être cristallisée et sa structure a été résolue. Ceci a révélé un repliement classique de VFT de type 2, avec 2 lobes séparés par une charnière de deux brins béta délimitant une cavité. Au sein de cette cavité, deux molécules d’acétate et une molécule de glycérol, venant certainement du milieu de cristallisation, sont piégées. Cependant, ces molécules interagissent avec un seul lobe à la fois et majoritairement par l’intermédiaire de molécules d’eau. Ainsi, il semblerait que ces ligands soient fortuits et non spécifiques. Ainsi, de façon intéressante, le domaine VFT2 a cristallisé sous forme fermée en absence d’un ligand véritable qui stabiliserait cette forme par des interactions avec les deux lobes (Fig. 1). Ceci s’écarte du paradigme de fonctionnement de ces domaines avec une forme ouverte non ligandée et une forme fermée ligandée.

Grâce à la résolution de cette structure, nous avons pu nous intéresser à la cavité de ce domaine. Cette cavité possède un potentiel électrostatique fortement positif (Fig. S3), ce qui est assez inhabituel dans la famille des VFT. Une substitution simultanée de deux résidus de cette cavité en résidus glutamate (chargés négativement) dans BvgS a donc été entreprise afin de dissiper ce potentiel électrostatique (F375E + Q461E). Le mutant de BvgS ainsi obtenu chez

B. pertussis était incapable de répondre à la modulation négative (Fig. 2). Ces substitutions ont alors été introduites dans la protéine recombinante. J’ai donc pu participer à sa production puis aux expériences menées avec cette protéine. La capacité de fixation des modulateurs négatifs a été testée par TSA et a montré l’incapacité de cette protéine recombinante à être stabilisée par ces modulateurs. En revanche, cette protéine est plus stable que la protéine sauvage dans la condition de référence, sans doute grâce à des ponts hydrogène supplémentaires créés entre les deux lobes. Le potentiel de la cavité est donc important pour la perception de ces modulateurs. En effet, il y a une certaine complémentarité entre le

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potentiel électrostatique positif de cette cavité et le groupement carboxylate des modulateurs, qui doit être chargé négativement en conditions normales. Le domaine VFT2 recombinant ainsi substitué a aussi pu être cristallisé. La résolution de sa structure a à nouveau montré un domaine fermé sans ligand spécifique dans sa cavité, mais seulement des petites molécules provenant de la liqueur de cristallisation (Fig. S4).

L’importance d’un autre résidu de la cavité a aussi pu être démontrée. En effet, la substitution du résidu F317 en une alanine génère un mutant de BvgS hypersensible à la modulation et dont

l’activité basale, en absence de modulateur, est d’environ 50% celle du sauvage. Cette substitution a aussi été réintroduite dans la protéine recombinante et ainsi j’ai participé aux différentes expériences menées avec cette construction. Les expériences de TSA ont suggéré une diminution de la stabilité de cette protéine par rapport au VFT2 sauvage dans les conditions normales. Cependant, la stabilisation par les modulateurs négatifs (nicotinate et apparentés) s’est avérée bien plus efficace sur cette protéine. Un mutant généré par substitution par une alanine d’un résidu très proche, F320, s’est avéré avirulent, et la protéine

recombinante associée est fortement déstabilisée et partiellement restabilisée par ajout des modulateurs en TSA. Ceci indique une grande importance de cette région de la protéine, caractérisée par un « β turn », dans la fixation des modulateurs et l’activité de BvgS. Nous avons alors tenté de cristalliser la protéine VFT2F317A en présence de modulateurs

négatifs stabilisant fortement la protéine. Malheureusement, aucune des conditions de cristallisation testées n’a permis d’obtenir des cristaux, ne nous permettant pas de définir le site de fixation de ces modulateurs.