Objectifs de la thèse

BvgS est un capteur-kinase hybride, prototype d’une grande famille de système à deux composants possédant des domaines VFT périplasmiques. BvgS contient aussi un domaine PAS qui ne semble pas présent dans tous les membres de cette famille, créant possiblement une distinction entre des sous-familles de ce type de capteurs-kinases. Cependant, et bien que la présence de ces trois domaines senseurs putatifs soit reconnue depuis plusieurs années, très peu d’informations structurales et mécanistiques sont disponibles.

Notamment, le système BvgAS semble actif dans des conditions normales de culture, alors qu’aucun ligand activateur du système n’est connu. Il existe différentes molécules capables d’induire un état d’avirulence chez les Bordetellae, particulièrement du complexe bronchiseptica. A nouveau, aucune information n’est disponible sur le site d’action de ces molécules, ni sur les mécanismes permettant leur perception. La seule hypothèse formulée est celle d’une interaction des modulateurs de la famille du nicotinate avec les domaines périplasmiques.

Par ailleurs, la fonction du domaine histidine-kinase nécessite une interaction dimérique, des domaines DHp particulièrement, pour maintenir l’activité et aussi permettre sa régulation. Or, il n’existe pas de description de l’état oligomérique de BvgS au niveau de ses domaines senseurs. Cependant, les domaines VFT et PAS sont reconnus comme possédant une faculté de dimérisation dans divers systèmes indépendants.

Ainsi, nous proposons d’étudier les caractéristiques des différents domaines senseurs afin de déterminer les mécanismes de perception et de transduction des signaux qui pourraient être intégrés au niveau de ces domaines. Pour ce faire, nous allons étudier ces trois domaines senseurs dans l’ordre de l’organisation de BvgS de ses portions N- vers C-terminales afin de répondre à certaines questions.

Les domaines VFT sont connus pour leur capacité de fixation spécifique d’un ligand dans leur cavité induisant un mouvement de fermeture entre leurs deux lobes. Quelles sont les molécules perçues par les domaines VFT de BvgS ? Comment se définit l’état actif de la protéine face aux conformations de ces domaines ? Une famille de systèmes bien étudiés comportant deux domaines VFT en tandem, les iGluR, a démontré une organisation dimérique (et même tétramérique) de ces canaux ioniques. Cet agencement est permis, entre autres, par des interactions dimériques entre les domaines VFT1 et entre les domaines VFT2. Ces interfaces entre domaines sont très importantes dans la régulation du système. Les VFT 1 et 2 sont-ils en interaction au sein d’un dimère supposé de BvgS ? Si tel est le cas, quelle est l’importance des interactions dimériques entre ces domaines VFT pour la perception et la transduction du signal ?

Les domaines PAS cytoplasmiques sont très souvent capables de fixer une molécule ou un cofacteur pour la perception d’un signal particulier, bien qu’un ligand ne soit pas décrit pour tous les domaines PAS étudiés. Dans de très nombreux cas, particulièrement lors de l’association de ces domaines à un capteur-kinase, la capacité de dimérisation des domaines PAS est un point crucial dans la régulation du système associé. Le domaine PAS de BvgS

71 est-il capable de fixer un ligand ? De quelle nature ? Comment s’organise le domaine PAS de BvgS ? Ce domaine est par ailleurs le dernier domaine senseur avant le domaine histidine-kinase. Il doit donc être capable d’intégrer les signaux provenant des domaines en amont pour les transmettre à l’histidine-kinase. Il pourrait percevoir un signal propre qui permettrait de contrebalancer les signaux amont comme point de contrôle ultime de l’activité de la kinase sous-jacente. Comment les signaux amont peuvent-ils être intégrés par le domaine PAS ? Comment sont-ils retransmis vers le domaine histidine-kinase ?

Enfin, BvgS est sensible à la température. La zone de perception de ce facteur reste inconnue et ainsi nous nous sommes intéressés à la perception de ce facteur et sa capacité de modulation de la virulence de la bactérie.

Pour répondre à ces diverses questions, nous avons mené des études in vitro sur les domaines de perception de BvgS isolés sous forme de protéines recombinantes. La résolution de la structure de ces différents domaines permettrait d’identifier des caractéristiques particulières qui pourraient être nécessaires à la fonction du système. Ces protéines recombinantes ont aussi été utilisées dans diverses techniques, particulièrement des expériences de Thermal Shift Assay, afin d’identifier un ligand putatif.

Nous nous sommes aussi basés sur des connaissances acquises sur d’autres systèmes, et par homologie nous avons cherché à vérifier si ces mécanismes peuvent s’appliquer à BvgS. Nous avons donc aussi entrepris des travaux in bacterio, en substituant des résidus possiblement impliqués dans les mécanismes de perception et/ou de transduction dans la protéine BvgS complète afin de vérifier le phénotype de mutants de ces résidus. Ceci est possible par suivi d’une activité enzymatique reflétant l’activité d’un promoteur d’un gène de la virulence, particulièrement d’un gène vag tardif, la toxine pertussique ou d’un gène vag précoce, la FHA.

Figure 58 Représentation schématique de BvgS et sa composition en domaine. Le nom de chaque domaine est noté en noir sur la gauche, HisK représente le domaine histidine-kinase. La membrane externe (ME) est figurée ainsi que la membrane interne (MI). Les points d’interrogation rouges représentent des ligands putatifs. Les points d’interrogation et doubles flèches bleus indiquent des interactions possibles. En vert, les zones possibles de perception des modulateurs.

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