Ainsi nous avons entrepris de caractériser ce domaine tout d’abord par homologie avec des systèmes décrits dans la littérature en recherchant des résidus conservés pour leur probable fixation d’un ligand ou leur rôle dans la signalisation entre le domaine PAS et les domaines en amont et en aval. Nous avons donc mesuré l’effet de substitutions particulières au sein du domaine PAS in bacterio par reconstitution du système BvgAS par recombinaison homologue. Des études in vitro par construction de protéines recombinantes ont aussi été conduites. Une campagne de cristallisation a été menée avec certaines de ces protéines recombinantes.
Ces résultats ont été mis en valeur par la publication d’un article dans le journal BMC Microbiology (Dupré et al., 2013).
1. Characterization of the PAS domain in the sensor-kinase BvgS: mechanical role in signal transmission
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2. Résumé
NB : Les figures citées ici sont celles de l’article ci-dessus
Dans ce travail, plusieurs protéines recombinantes ont été produites. Leurs séquences (figure 1) correspondent soit au domaine PAS isolé (N0-C0), donnant une protéine peu soluble vraisemblablement monomérique, ou à ce domaine flanqué d’extensions de différentes longueurs en positions N- et C-terminales (N1, N2 ou N3 en combinaison avec C1, C2 ou C3). J’ai pu participer à la tentative de cristallisation de plusieurs de ces protéines (N2 ou N3 combiné avec C2 ou C3, les plus stables et solubles), mais sans succès. La plus stable d’entre elles (N2-C3) a été utilisée en spectrométrie de masse non dénaturante afin de déterminer la présence d’un éventuel ligand associé et vérifier sa nature supposée dimérique comme observée au cours des étapes de purification. Aucun ligand n’a pu être identifié par cette technique mais la dimérisation du domaine PAS de BvgS a été confirmée.
Ajoutons ici que les molécules présentes dans le milieu de culture liquide Stainer-Scholte ainsi que les différents acides aminés et divers modulateurs chimiques de la virulence ont été testés quant à leur rôle potentiel de ligand du domaine PAS. Aucun de ces composés n’a montré une capacité de stabilisation significative de la protéine recombinante N2C3 par Thermal-Shift Assay (TSA) et ainsi ces résultats ne seront pas autrement détaillés.
La construction N2-C3 a aussi été utilisée afin de comparer la stabilité entre sa version sauvage et plusieurs variants où un résidu particulier du domaine PAS est substitué en alanine (Table 1). Les différents résidus substitués sont présentés ci-après, ainsi que les phénotypes de mutants pour lesquels ces substitutions ont été introduites dans BvgS complet (Fig. 4).
En absence de structure disponible pour le domaine PAS de BvgS nous avons donc travaillé sur base d’un modèle structural et par homologie avec d’autres systèmes. Différents résidus ont ainsi été remplacés sur la base d’un rôle putatif de perception ou de signalisation par le domaine PAS.
Le résidu H643 a été ciblé pour son implication potentielle dans la fixation d’un ligand de type
hème par homologie au système FixL. La mutation de ce résidu entraîne une perte de la capacité de modulation chez la bactérie et une diminution significative de la stabilité de la protéine. Il ne semblerait pas que le domaine PAS soit capable de fixer un hème mais le résidu H643, avec sa volumineuse chaîne latérale probablement orientée vers sa cavité,
permettrait une stabilisation du domaine.
Le domaine PAS de BvgS a été proposé comme possible senseur rédox, à l’instar du système ArcB, qui fait intervenir des résidus cystéine. Des résidus cystéine sont aussi impliqués dans la fixation de cofacteur dans des domaines de la sous-famille LOV de domaines PAS. Or, un seul résidu cystéine est présent dans le domaine PAS de BvgS (C607), ce résidu pourrait alors
participer à la fixation d’un ligand au sein de la cavité de ce domaine ou percevoir l’état rédox du cytoplasme. Sa substitution en alalnine entraîne la perte de sensibilité à la modulation ainsi qu’une diminution significative de la stabilité de la protéine recombinante. La capacité de
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réponse à la modulation chimique est altérée, suggérant à nouveau un rôle de la stabilité du domaine PAS dans la transmission du message négatif. En revanche, BvgS reste actif.
Un domaine PAS de Mycobacterium tuberculosis a été cristallisé avec un ligand de type acide gras C16. La fixation de ce ligand fait intervenir un résidu arginine présent dans une position similaire dans le domaine PAS de BvgS (R670). La mutation de ce résidu n’affecte pas le
phénotype de la bactérie et ne déstabilise la protéine recombinante que modérément. Il a été impossible de démontrer la fixation d’un ligand de ce type.
D’autres résidus de cavité, possiblement impliqués dans la fixation de ligands, ont été identifiés (Y596 et N631). La substitution simultanée en alanine de ces résidus dans BvgS
génère un mutant avirulent et une protéine très largement déstabilisée. Cette forte déstabilisation ne conduit cependant pas à la dégradation de BvgS chez B. pertussis, mais inactive la protéine. Ceci indique un rôle important de la cavité du domaine PAS dans le maintien de son intégrité structurale, dans sa capacité de transmission d’informations et dans le maintien de la conformation active de BvgS, bien que ceci ne dépende pas nécessairement de sa capacité de fixation d’un ligand.
Des résidus très conservés dans la famille des domaines PAS (N608 et D695) sont
respectivement impliqués dans des interactions du « noyau » avec les hélices flanquantes N- terminale et C-terminale. La substitution de chacun de ces résidus séparément entraine un phénotype avirulent in bacterio bien que BvgS soit détecté. Les protéines recombinantes résultantes sont très fortement déstabilisées et moins solubles (le variant N608A
particulièrement) mais semblent conserver leur capacité de dimérisation..
Ces résultats indiquent la nécessité d’un repliement « stable » du domaine PAS pour permettre un bon fonctionnement du système. La cavité du domaine PAS doit être intacte pour maintenir la stabilité du domaine. Autrement, en fonction de l’effet plus ou moins prononcé sur la stabilité du domaine, une substitution va entraîner la perte de sensibilité à la modulation du système ou son inactivation complète. La cavité du domaine PAS serait ainsi nécessaire à sa stabilité et donc à sa capacité de transmission et de maintien des messages perçus en amont. Le couplage du domaine PAS avec ses hélices flanquantes est aussi crucial dans ces mécanismes. Découplé de l’une d’entre elles, il ne permet plus le maintien de l’activité kinase de BvgS. Ceci indique qu’un message positif proviendrait des domaines amont et serait maintenu et transmis vers la kinase. Ce mécanisme est rendu possible par un repliement « stable » du domaine PAS, dépendant entre autres de l’état de sa cavité mais aussi du couplage avec les hélices flanquantes.
Le couplage entre le « noyau » du domaine PAS et l’hélice flanquante du côté N-terminal pourrait se faire en partie au travers de la boucle formée entre les brins Hβ et Iβ. En effet, différentes substitutions dans cette zone et dans cette hélice, donc possiblement en contact avec la boucle HI, ont été rapportées comme rendant le système insensible à la modulation (Fig. 2). Ainsi, nous suggérons que cette interaction est nécessaire à la transmission d’une information négative provenant du périplasme. Cette transmission se ferait au travers d’une augmentation de la tension du système qui permettrait le passage en conformation inactive de la kinase.
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Une tension basale, provenant vraisemblablement des domaines amont, semble nécessaire au maintien de l’activité kinase. Cette tension serait transmise au domaine PAS au travers de sa connexion à l’hélice le précédant. Un repliement stable du domaine PAS serait alors nécessaire au maintien de cette tension et donc de l’activité de la kinase. Cette stabilité dépendrait de l’état de la cavité du domaine PAS, du couplage aux hélices flanquantes et fort probablement de sa capacité de dimérisation, vu que ce domaine ne semble stable que sous forme dimérique. Le couplage du domaine PAS avec l’hélice suivante, qui précède donc la kinase, est le dernier point de contrôle dans la transmission des signaux. Il est nécessaire au maintien de l’activité kinase, ce qui indique que le domaine PAS permet bien la transmission d’un message positif à la kinase. Un message négatif peut être intégré par le domaine PAS qui va alors permettre le passage en conformation inactive (ou phosphatase) de la kinase.