Nous avons donc vu qu’un repliement « stable » du domaine PAS semblait nécessaire au bon fonctionnement du système. En effet, le phénotype de mutants dont le domaine PAS semble déstabilisé est toujours altéré par rapport au sauvage. Ainsi, la stabilité, ou la rigidité, de ce domaine est une caractéristique nécessaire à l’intégration de signaux provenant des domaines en amont, positif (conformation basale de BvgS) comme négatif (perception du nicotinate par VFT2). Par ailleurs, un couplage entre l’hélice amont et le domaine PAS au travers de sa boucle HI semble aussi un point critique dans l’intégration du message négatif. La cavité du domaine PAS joue un rôle déterminant dans sa stabilité et donc, un défaut « léger », déstabilisant le domaine relativement modérément, va nuire à la transmission du signal négatif.
Les domaines périplasmiques semblent aussi fournir un message positif définissant l’activité basale du système. Le couplage du domaine PAS avec l’hélice le précédant est nécessaire au maintien de ce message positif périplasmique, comme le montrent les mutants de N608.
Ce message positif nécessite lui aussi que le domaine PAS soit relativement stable, et par exemple une trop forte perturbation de sa cavité empêche la transmission des signaux positifs. On peut supposer que, dans ces conditions, le domaine PAS ne soit plus capable de maintenir les signaux provenant des domaines en amont ; il serait intégré au niveau de la connexion avec l’hélice précédente mais serait dissipé par manque de stabilité du domaine PAS et ainsi ne pourrait plus être transmis vers l’hélice Jα.
La stabilité du domaine PAS pourrait aussi être liée à sa capacité de dimérisation. En effet, toutes les protéines recombinantes du domaine PAS générées sont dimériques, et la dimérisation semble nécessaire au maintien d’un domaine soluble et dans une conformation convenable, lui conférant une stabilité suffisante pour l’intégration des signaux. D’autre part, le fonctionnement dimérique des différents domaines de BvgS semble aujourd’hui certain, et donc les interfaces dimériques semblent importantes dans l’activité du système. Ainsi, entre les domaines PAS, une interface dimérique stable semble nécessaire au maintien du niveau d’activité de l’histidine-kinase, comme suggéré par l’obtention de mutants ne possédant plus ce domaine et ne conservant qu’une faible activité de virulence. Cette baisse du niveau d’activité tendrait à suggérer que les positionnements des hélices en amont et en aval du domaine PAS définissent l’activité du système. Les interfaces du dimère de BvgS entre ses domaines PAS seraient alors nécessaires au maintien de la position de ces hélices, particulièrement l’hélice Jα, qui va déterminer l’activité kinase. Le bon positionnement des interfaces du dimère va alors maintenir l’activité kinase. Une modification de cette interface, provoquée par exemple par un changement conformationnel transmis par l’hélice amont du domaine PAS, entraînerait alors une modification de la position des hélices Jα et ainsi du domaine DHp de la kinase. L’histidine kinase serait alors en conformation inactive (ou phosphatase).
Nous n’avons pas pu mettre en évidence la fixation d’un ligand ou d’un cofacteur dans le domaine PAS. Cependant il n’est pas exclu qu’un ligand puisse se fixer dans le domaine PAS au vu de la grande conservation de la cavité. De plus, l’intégrité de sa cavité est
183 indispensable à la bonne transmission des signaux amont, qui seraient autrement dissipés. Dans un tel contexte, on peut supposer que la présence d’un ligand, probablement un petit métabolite, contribue à la stabilité du domaine dans BvgS complet et permette la transduction des signaux positifs de par cette stabilité. En absence de ce ligand, le signal positif provenant des domaines amont serait alors dissipé dans un domaine PAS devenu plus lâche. Cette hypothèse d’un ligand activateur semble la plus plausible dans la mesure où la fixation d’un ligand entraîne généralement une augmentation de la stabilité d’une protéine donnée, qui semble être le point clé de la capacité de transmission de signaux par le domaine PAS de BvgS. Cependant, on ne peut exclure l’hypothèse d’un ligand qui serait capable d’inactiver le système. Sa fixation entraînerait alors un changement de conformation du domaine PAS, modifiant probablement aussi l’interface dimérique et ainsi l’organisation des hélices Jα qui maintiendraient alors la kinase dans une conformation inactive.
Un modèle schématique représentant les phénotypes de nombre des différents mutants de BvgS est présenté en appendice. Les différentes données générées par la caractérisation de ces mutants suggèrent qu’une tension basale serait générée par les domaines périplasmiques, et qu’elle serait nécessaire au maintien de l’activité kinase. Cette tension serait transmise au domaine PAS au travers de sa connexion à l’hélice le précédant. Le domaine PAS doit alors être suffisamment stable pour transmettre ce signal activateur et ainsi maintenir l’activité de la kinase. Cette stabilité dépendrait de l’état de la cavité du domaine PAS (particulièrement par sa composition mais possiblement la présence ou l’absence d’un ligand), de son couplage aux hélices flanquantes et fort probablement de sa capacité de dimérisation (fig. 84).
Figure 84 Modèle de l’implication du domaine PAS dans la régulation de l’activité kinase de BvgS. Les domaines périplasmiques sont figurés par un cercle et les différentes hélices par des barres. Le domaine PAS est en bleu et l’interface dimérique est représentée par un rectangle plein. Les domaines suivant le DHp ne sont pas représentés et seul les états actif et inactif de la kinase sont mentionnés. La couleur rouge indique une conformation « activatrice » des domaines et une couleur verte une conformation « inactive ». L’étoile rouge représente un ligand activateur possible (ou l’absence de ligand inhibiteur). La boucle HI, en bleu, est représentée sous forme de trait plein lorsqu’elle contribue à la signalisation, sinon le trait est discontinu. La modulation chimique correspond à la modulation par le nicotinate (représenté) mais pourrait s’appliquer de même au sulfate de magnésium, voire à la température. Les membranes interne (MI) et externe (ME) sont représentées pour refléter la compartimentation des domaines.
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IX. La perception de la température
Nous avons jusqu’ici pu déterminer en partie le mécanisme d’action des modulateurs négatifs de type nicotinate au travers du domaine VFT2. La perception du sulfate de magnésium semble quant à elle se faire en divers endroits, probablement en jouant sur la stabilité des interfaces du dimère des domaines périplasmiques. Ce modulateur pourrait aussi être perçu d’autres façons mais aucune évidence d’une zone de perception précise n’a été obtenue. Cependant, BvgS est aussi capable de percevoir un facteur physique et non chimique, la température. Bien que la sensibilité du système BvgAS à la température soit décrite depuis longtemps, les mécanismes de cette sensibilité restent entièrement incompris. La construction de nombreuses souches mutantes dans les différents domaines de perception de BvgS nous a donc amené à tester une sélection d’entre eux pour leur sensibilité à la température.