Vecteurs plasmidiques

2.1.1 Vecteur pGEM-T easy

Le vecteur pGEM-T easy (Promega) est utilisé pour le clonage des produits de PCR dont certains possèdent à leur extrémité des désoxyadénylates. Ce vecteur linéaire présente en effet des résidus désoxythymidylates aux extrémités 3’OH permettant la ligature directe des produits de PCR. Ce vecteur possède un gène de résistance à l’ampicilline.

2.1.2 Vecteurs pSBet flag-gabarapl1-6his et pSBet flag-gabarap-6his

Le vecteur pSBet (Schenk et al., 1995) est un vecteur d’expression procaryote contenant un promoteur sous contrôle de l’ARN polymérase T7, un gène de résistance à la kanamycine et le gène argU codant l’ARNtArg _{(AGA/AGG) d’Escherichia coli permettant un haut niveau}

d’expression protéique chez la bactérie (Dieci et al., 2000). Le plasmide pSBet dont nous disposons (gracieusement fourni par le Dr. Boyer-Guittaut) contient des séquences supplémentaires codant l’épitope Flag (composé de 8 résidus DYKDDDDK) et l’épitope 6his (composé de 6 résidus histidine).

Après un clonage intermédiaire dans le vecteur pGEM-T easy, des inserts de 351 pb, correspondant à la partie codante de l’ADNc gabarapl1 de cobaye et à la partie codante de l’ADNc gabarap humain, sont clonés dans ce plasmide, au niveau des sites de restriction

XbaI et BamHI/BglII pour gabarapl1 et XbaI et BamHI pour gabarap, permettant ainsi

l’expression de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS et de la protéine FLAG-GABARAP- 6HIS dans des bactéries BL21-DE3 (Stratagène). Ces bactéries expriment l’ARN polymérase du phage T7 dont le gène est sous la dépendance d’un promoteur inductible par l’IPTG. Une purification des protéines FLAG-GABARAPL1-6HIS et FLAG-GABARAP-6HIS est réalisée par chromatographie d’affinité au nickel.

2.1.3 Vecteurs pcDNA 5/FRT flag-gabarapl1-6his et pcDNA5/FRT flag-gabarapl1- G116A-6his

Le vecteur pcDNA5/FRT (Invitrogen) contient un site FRT (Flp Recombination Target) issu de Saccharomyces cerevisiae, un gène de résistance à l’ampicilline et un gène de résistance à l’hygromycine non. Ce vecteur est conçu pour être utilisé avec le système Flp-in

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développé par la société Invitrogen et le gène de résistance à l’hygromycine est exprimé une fois le vecteur transfecté dans les cellules Fpl-in concues pour êtres utilisées avec ce système.

Après un clonage intermédiaire dans le vecteur pGEM-T easy, le fragment flag-

gabarapl1-6his, obtenu à partir du vecteur pSBet flag-gabarapl1-6his, est cloné dans ce

vecteur au niveau des sites de restriction NheI et NotI. Des cellules Flp-in-HEK293 sont transfectées de manière stable par le vecteur recombinant pcDNA 5/FRT flag-gabarapl1-6his afin de surexprimer la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS dans cette lignée.

Afin de créer le vecteur pcDNA5/FRT flag-gabarapl1-G116A-6his, la partie codante de l’ADNc gabarapl1 est mutée à partir du vecteur pcDNA5/FRT flag-gabarapl1-6his par mutagenèse dirigée à l’aide du kit QuickChange Site-Directed mutagenesis system (Stratagene) selon les recommandations du fournisseur. L’avant-dernier codon (GGG) de la partie codante de l’ADNc gabarapl1 codant initialement un résidu glycine est muté au niveau de la cytosine centrale pour ainsi former le codon GCG permettant la synthèse d’un résidu alanine. Ce vecteur est utilisé pour créer la lignée stable HEK293 FLAG-GABARAPL1- G116A-6HIS.

2.1.4 Vecteur pOG44

Le vecteur pOG44 (Invitrogen) code la Flp recombinase issue de Saccharomyces

cerevisiae. Il exprime un gène de résistance à l’ampicilline. Lors de la transfection des

cellules Flp-in-HEK293 par le vecteur pcDNA 5/FRT flag-gabarapl1-6his, une co- transfection avec le vecteur pOG44 est effectuée afin de permettre l’intégration du transgène au sein du génôme de ces cellules au niveau du site FRT.

2.1.5 Vecteurs pcDNA 3.1 gabarapl1 et pcDNA 3.1 flag-gabarapl1-6his

Le plasmide pcDNA 3.1 (Invitrogen) est un vecteur d’expression eucaryote possédant les gènes de résistance à l’ampicilline et à l’hygromycine.

Le vecteur pcDNA 3.1 gabarapl1 contient la partie codante de l’ADNc gabarapl1. Le vecteur pcDNA 3.1 flag-gabarapl1-6his possède le fragment flag-gabarapl1-6his suite à un sous-clonage réalisé entre les sites de restriction NheI et NotI à partir du vecteur pSBet flag-

gabarapl1-6his. Des cellules MCF-7 sont transfectées de manière stable par le vecteur

recombinant pcDNA 3.1 flag-gabarapl1-6his afin de surexprimer la protéine FLAG- GABARAPL1-6HIS dans cette lignée.

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2.1.6 Vecteurs pGEX-4T2-GABARAPL1, pGEX-4T2-GABARAPL1 (22-117) et pGEX-4T3-HSP90α

Les vecteurs pGEX-4T2 (Amhersham Pharmacia) et pGEX-4T3 (Amhersham Biosciences) possèdent le gène codant la GST (Gluthathion-S-Transférase) sous le contrôle du promoteur procaryote plac inductible par l’IPTG. Ce vecteur contient un gène de résistance à l’ampicilline. Il permet l’expression de gènes codant des protéines de fusion entre la GST et une protéine d’intérêt. Le plasmide pGEX-4T2-GABARAPL1 contenant la séquence codant la protéine GABARAPL1 et le plasmide pGEX-4T2-GABARAPL1 (22-117) contenant la séquence codant la protéine GABARAPL1 déletée des vingt-deux premiers acides aminés en position N-terminale ont été antérieurement construits au laboratoire (Mansuy et al., 2004). Le plasmide pGEXT-4T3-HSP90 contient la séquence codant la protéine HSP90α. Ce vecteur nous a été gracieusement fourni par D.C. Altieri (University of Massachusetts, Medical School, USA).

Ces différents vecteurs ont permis la synthèse des protéines recombinantes GST, GST- GABARAPL1, GST-GABARAPL1 (22-117) et GST-HSP90α.

2.1.7 Vecteurs pGFP-GABARAPL1, pGABARAPL1-GFP et pGFP-HSP90β

Les vecteurs pEGFP-C1 et pEGFP-N1 (Clontech) possèdent le gène codant la GFP en amont (pEGFP-C1) ou en aval (pEGFP-N1) du site de multi-clonage ainsi que des gènes de résistance à la kanamycine et à la néomycine. Après un clonage intermédiaire dans le vecteur pGEM-T easy, la partie codante de l’ADNc gabarapl1 de cobaye (351 pb) est sous-clonée dans le vecteur pEGFP-C1 au niveau des sites de restriction BglII et EcoRI et dans le vecteur pEGFP-N3 au niveau des sites de restriction XhoI et SacII, permettant ainsi, après transfection, l’expression des protéines GFP-GABARAPL1 et GABARAPL1-GFP dans les cellules HEK293 et MCF-7. Le vecteur pGFP-HSP90β, contenant la séquence codant la protéine HSP90β, nous a été gracieusement fourni par J. Kim (Korea University).

2.1.8 Vecteur pDsred-GABARAPL1

Le vecteur pDsred-LC3 appelé aussi pRFP-LC3 a été gracieusement fourni par J. Nowak (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Marseille). Il contient un fragment du gène lc3 de rat cloné en aval d’une séquence codant une protéine fluorescente rouge, Dsred. Il possède un site de multi-clonage en aval du gène codant la Dsred et des gènes de résistance à la kanamycine.

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La partie codante de l’ADNc gabarapl1 de cobaye (351 pb) est sous-clonée au niveau des sites de restriction BglII et EcoRI à partir du vecteur pGFP-GABARAPL1 dans le vecteur pDsred, après libération du fragment du gène lc3. La construction pDsred-GABARAPL1 a permis l’établissement des lignées cellulaires stables HEK293 Dsred-GABARAPL1 et MCF- 7 Dsred-GABARAPL1.