• Evaluation de l’expression de gabarapl1 et de gabarap dans différents tissus
cancéreux
En plus des tissus de sein, le système en macro-array que nous avons utilisé était composé de tissus normaux (134 ADNc) et tumoraux (134 ADNc) provenant de 18 autres organes ainsi que d’ADNc issus de 9 lignées cancéreuses. L’expression des gènes gabarapl1 et gabarap a été recherchée par utilisation de sondes ADNc spécifiques s’hybridant au niveau des UTR-3’ sans aucune identité de séquence entre elles. Les résultats obtenus ont été normalisés à l’aide d’une sonde ubiquitine. L’ensemble des résultats de cette étude est présenté dans la Figure 26.
Nous avons d’abord remarqué une expression ubiquitaire des gènes gabarapl1 et
gabarap. De plus, des différences d’expression sont observables selon les tissus considérés
mais globalement gabarap semble plus exprimé dans la majorité des tissus comparé à
gabarapl1. Concernant gabarapl1, des variations d’expression ont été observées dans d’autres
tissus que le sein entre certains tissus normaux et cancéreux correspondants. En effet,
gabarapl1 est surexprimé dans les testicules et la prostate mais est en revanche sous-exprimé
dans plusieurs tissus dont le pancréas, la peau et la vessie (Figure 26A). En revanche, concernant gabarap, peu de variations d’expression entre tissus normaux et tumoraux correspondants sont observées (Figure 26B). En particulier, il n’y a pas de diminution de l’expression de gabarap dans les tissus cancéreux de sein. De plus, les messagers gabarapl1 et gabarap sont faiblement exprimés dans les 9 lignées cancéreuses testées.
Nous ne pouvons donc pas conclure à une diminution ubiquitaire de gabarapl1 dans les tissus cancéreux ce qui suggère que la régulation du gène gabarapl1 est différente selon l’organe considéré.
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Figure 26 : Analyse par macro-array de l’expression de gabarapl et gabarap dans des tissus normaux et tumoraux correspondants provenant de 19 organes différents. Les résultats ont été normalisés à l’aide d’une sonde ubiquitine. A. Hybridation de la sonde gabarapl1. B. Hybridation de la sonde gabarap. C. Hybridation de la sonde ubiquitine. 1 : sein ; 2 : ovaire ; 3 : colon ; 4 : estomac ; 5 : poumon ; 6 : rein ; 7 : vessie ; 8 : vulve ; 9 : prostate : 10 : trachée : 11 : foie ; 12 : utérus ; 13 : col de l’utérus ; 14 : rectum ; 15 : thyroïde ; 16 : testicules ; 17 : peau ; 18 : intestine grêle ; 19 : pancreas ; 20 : lignées cellulaires (de haut en bas : HeLa, Daudi, K562, HL-60, G-361, A549, MOLT- 4, SW480, Raji). N : tissu normal : ORF : Open Reading Frame ; T : tissu tumoral ; UTR : UnTranslated Region.
L’ensemble de ces résultats indique une expression différente de gabarapl1 dans certains tissus cancéreux par rapport aux tissus normaux correspondants. Dans le sein, l’expression de
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telles que le statut hormonal, la taille de la tumeur ou l’atteinte ganglionnaire. Le mécanisme moléculaire mis en jeu dans le sein est probablement complexe dans la mesure où l’ARNm
gabarapl1 n’est déjà pas exprimé de façon homogène selon les différentes lignées
cancéreuses humaines de sein utilisées. Les caractéristiques propres à ces lignées sont à prendre en considération pour l’étude de gabarapl1. Toutes ces données suggèrent que le rôle de gabarapl1 dans les cancers est dépendant du tissu, des propriétés spécifiques des différents types de tumeurs et du stade d’avancement de la tumeur.
• Evaluation de l’expression de gabarapl1 et gabarap dans différentes lignées de
cancer du sein humain
L’expression de gabarapl1 et de gabarap a été évaluée dans différentes lignées de carcinome de sein humain (MCF-7, MDA-MB231, BT-549, MDA-MB-436, ZR-75-1), par RT-PCR quantitative à l’aide d’amorces s’hybridant au niveau des UTR-3’. Gabarapl1 et
gabarap sont relativement faiblement exprimés dans les différentes lignées de cancer du sein
à l’exception des cellules MDA-MB-436 (Figure 27A). En western blotting, la protéine GABARAPL1 est uniquement détectée dans les cellules MDA-MB-436 alors que la protéine GABARAP est exprimée dans toutes les lignées. Ces deux protéines sont effectivement visibles en western blotting sous forme de deux bandes différentes, GABARAPL1 migrant légèrement moins loin que GABARAP (Figure 27B).
Ces résultats confirment la faible expression de gabarapl1 dans différentes lignées de cancer du sein humain mis à part dans les cellules MDA-MB-436.
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Figure 27 : A. Profil d’expression des ARNm gabarapl1 et gabarap dans différentes lignées cellulaires humaines par RT-PCR quantitative. Les résultats ont été normalisés par le gène gapdh. Les valeurs sont exprimées par rapport au taux des ARNm gabarapl1 et gabarap dans la lignée ZR- 75-1. B. Expression des protéines GABARAPL1 et GABARAP dans les cellules MCF-7, MDA- MB-231 et MDA-MB-436 par western-blotting. L’anticorps anti-GABARAPL1/GABARAP (Chemicon, Millipore) a été utilisé pour détecter les protéines GABARAPL1 et GABARAP à partir de 40 µg de lysats protéiques issus des cellules MCF-7, MDA-MB-231 et MDA-MB-436.
• Evaluation de la prolifération clonale en milieu semi-solide (agar mou) des
cellules MCF-7 FLAG-GABARAPL1-6HIS
La caractérisation fonctionnelle de la lignée MCF-7 FLAG-GABARAPL1-6HIS a été poursuivie en réalisant un test permettant d’évaluer la croissance de cellules cancéreuses sur un milieu semi-solide qui est l’agar mou. Des cellules MCF-7 parentales, transfectées par le vecteur vide et transfectées par le vecteur exprimant FLAG-GABARAPL1-6HIS ont été ensemencées, puis les clones dont la taille était supérieure ou égale à 100 µm ont été comptabilisés 21 jours après ensemencement. Le nombre de clones surexprimant FLAG- GABARAPL1-6HIS était deux fois moins important par rapport au cellules parentales ou transfectées par le vecteur vide (Figure 28). Par conséquent, la surexpression de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS conduit à une diminution de la croissance en agar mou des cellules cancéreuses MCF-7.
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Figure 28 : Mise en évidence de la diminution de la croissance en agar mou des cellules MCF-7 surexprimant FLAG-GABARAPL1-6HIS. Ce résultat est représentatif de deux expériences indépendantes. * : p< 0,05, significitavité par rapport aux deux autres lignées.
• Evaluation de la croissance tumorale suite à l’injection de cellules MCF-7
FLAG-GABARAPL1-6HIS chez des souris immuno-déficientes
En collaboration avec le Docteur Christophe Borg appartenant à l’équipe « Interaction Hôte-Greffon et Ingénierie Cellulaire et Génique » de l’IFR133 à Besançon, nous avons tenté de confirmer ces résultats in-vivo chez des souris immuno-déficientes en suivant l’évolution de tumeurs suite à l’injection de cellules cancéreuses. Plusieurs souris ont subi une injection, en sous-cutané au niveau du flanc, de cellules MCF-7 parentales, transfectées par le vecteur vide ou transfectées par le vecteur exprimant FLAG-GABARAPL1-6HIS. Malheureusement, malgré de nombreuses tentatives réalisées dans différentes conditions, aucune tumeur ne s’est développée, quelque soit la nature de l’injection.
La surexpression de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS dans les cellules MCF-7 pourrait permettre la restauration d’un phénotype normal mais ces résultats encourageants restent encore à confirmer in vivo. L’utilisation d’autres lignées de cancer du sein humain est également nécessaire afin de conclure sur l’effet positif de la surexpression de GABARAPL1.
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