TECHNIQUES POUR L’EXPRESSION, LA PURIFICATION ET L’ANALYSE DES PROTEINES

6.1 Extraction des protéines

Les lysats protéiques totaux de cerveau de rat et de cellules en culture sont obtenus suite à l’incubation des tissus homogénéisés par passages successifs au potter ou des cellules pendant 30 min sur glace dans un tampon de lyse spécifique au type d’expérience réalisé. Un tampon de lyse constitué de 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 1% Triton X100, inhibiteurs de protéases (104 mM AEBSF, 1,5 mM

pepstatine A, 1,4 mM E-64, 4 mM bestatine, 2 mM leupeptine, 80 µM aprotinine ; 1/1000 ; Sigma-Aldrich) est utilisé pour les expériences de GST pull-down (§ 6.3.1) et un tampon de lyse composé de 50 mM HEPES, pH 7,6, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40, inhibiteurs de protéases (104 mM AEBSF, 1,5 mM pepstatine A, 1,4 mM E-64, 4 mM bestatine, 2 mM leupeptine, 80 µM aprotinine ; 1/1000 ; Sigma-Aldrich) est utilisé pour les expériences d’immunoprécipitation (§ 6.3.2). La lyse est suivie d’une étape de centrifugation (16000 g, 30 min, 4°C) puis le surnageant correspondant au lysat protéique est conservé à - 80°C jusqu’à utilisation.

6.2 Expression et purification des protéines de fusion

Les bactéries E. coli BL21-DE3 transformées par les plasmides d’expression codant la protéine GST et les protéines de fusion GST-GABARAPL1, GST-GABARAPL1 (22-117), GST-HSP90α sont cultivées dans 10 ml de milieu LB (Tryptone 1%, d’extrait de levure 0,5%

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et de NaCl 1%) additionné d’ampicilline (0,1 mg/ml) à 37° C sous agitation jusqu’à une absorbance de 0,6 à 600 nm. L’expression des protéines est induite pendant 2 h par 0,5 mM d’IPTG. Les bactéries sont ensuite centrifugées (5000 g, 10 min, 4°C) et le culot est repris dans 800 µl d’un tampon de lyse PBS (0,137 M NaCl, 3,3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8

mM KH2PO4)-1% Triton X100 en présence d’inhibiteurs de protéases (104 mM AEBSF, 1,5

mM pepstatine A, 1,4 mM E-64, 4 mM bestatine, 2 mM leupeptine, 80 µM aprotinine ; 1/1000 ; Sigma-Aldrich). Une sonication 3 fois 15 sec sur glace permet d’augmenter l’efficacité de la lyse. Après centrifugation, (10000 g, 20 min, 4°C), les surnageants contenant la GST ou les protéines fusionnées à la GST sont incubés avec 100 µl d’une suspension de billes de glutathion agarose (Sigma-Aldrich) pendant 2 h à 4°C sous agitation rotative. Après trois lavages avec du PBS enrichi en NaCl (0,5 M NaCl, 3,3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8

mM KH2PO4), les protéines de fusion fixées aux billes de glutathion agarose sont prêtes pour

être utilisées par la technique de GST pull-down. De plus, l’expression des différentes protéines de fusion est contrôlée par coloration au bleu de Coomassie.

La protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS est purifiée par chromatographie d’affinité au nickel grâce à sa queue histidine (Qiagen). Après culture des bactéries E. coli transformées par le plasmide d’expression codant la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS dans 100 ml de LB, l’induction de l’expression de la protéine de fusion par l’IPTG est réalisée dans les mêmes conditions que précédemment. Le culot de bactéries est incubé dans 5ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl, 20% glycérol, 0,2 mM EDTA, 500 mM KCl, 10 mM imidazole, 10 mM β-mercaptoéthanol, 1 mg/ml lysozyme) pendant 30 min sur glace. Après sonication (3 fois 15 s sur glace), le lysat bactérien est ensuite centrifugé (16000 g, 30 min, 4°C) et le surnageant est incubé avec la résine de nickel (500 µl pour 500 ml de culture bactérienne) pendant 2 h à 4°C. Après centrifugation, (5000 g, 5 min, 4°C), la résine est lavée 3 fois dans le tampon de lavage (20 mM Tris-HCl, 20% glycérol, 0,2 mM EDTA, 100 mM KCl, 20 mM imidazole, 10 mM β-mercaptoéthanol, 0,5 mM PMSF). La protéine FLAG-GABARAPL1- 6HIS est ensuite éluée par des concentrations croissantes d’imidazaole (50 à 250 mM).

6.3 Techniques d’étude d’interactions protéiques

6.3.1 GST pull-down

• Principe

La technique de GST-pulldown permet l’étude d’interactions protéiques in vitro. Elle est basée sur l’utilisation de protéines fusionnées à la protéine GST. Ces protéines sont tout

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d’abord incubées avec des billes de glutathion-agarose pour permettre leur fixation sur ces billes par liaison de la GST au glutathion. Par la suite, un lysat protéique ou une protéine purifiée sont incubés avec les complexes protéines de fusion/billes de glutathion-agarose. Après plusieurs lavages successifs, les protéines ayant interagi avec la protéine fusionnée à la GST sont éluées soit de manière compétitive à l’aide de glutathion, soit par des conditions dénaturantes à l’aide de tampon de charge. Une centrifugation permet de séparer le culot de billes du surnageant contenant la protéine de fusion en interaction avec un partenaire potentiel. Après électrophorèse SDS-PAGE suivie d’un électrotransfert sur une membrane de PVDF, l’interaction de la protéine fusionnée à la GST avec le partenaire protéique potentiel est ainsi mise en évidence. L’illustration de cette technique est décrite ci-dessous.

• Protocole

Après expression dans les bactéries E. coli et fixation sur des billes de gluthathion agarose (protocole décrit précédemment), les protéines GST, GST-GABARAPL1, GST- GABARAPL1 (22-117) et GST-HSP90α sont utilisées dans des expériences de GST pull- down. Les lysats totaux contenant les partenaires protéiques potentiels sont préparés par incubation des cellules ou des tissus homogénéisés dans les conditions décrites dans le paragraphe 6.1.

Les protéines GST, GST-GABARAPL1 et GST-GABARAPL1 (22-117) sont incubées avec 5 mg d’un lysat protéique de cerveau de rat ou 1 mg d’un lysat de cellules HEK293 transfectées transitoirement par le vecteur GFP-HSP90β alors que la protéine GST-HSP90α est incubée avec 500 ng de la protéine purifiée FLAG-GABARAPL1-6HIS. Ces incubations sont réalisées pendant une nuit à 4°C sous agitation rotative. Après trois lavages avec du PBS enrichi en NaCl (0,2 M NaCl, 3,3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), les

protéines sont éluées dans du tampon de charge (78 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, 12,5% glycérol, 6,25% β-mercaptoéthanol, 0,025% bleu de bromophénol) puis séparées sur gel SDS- PAGE. Les gels sont soit colorés au bleu de Coomassie et utilisés pour l’identification de nouveaux partenaires de GABARAPL1 par spectrométrie de masse, soit soumis à Western blotting pour l’étude des interactions entre GABARAPL1 et HSP90α/β. Les conditions des différentes expériences de GST pull-down réalisées sont répertoriées ci-dessous (Tableau XII).

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Interactions étudiées Tampon de GST pull-down Quantité de protéines utilisées

Technique d’analyse des protéines

GST-GABARAPL1 +

lysat protéique de cerveau de rat 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 1% Triton X100, inhibiteurs de protéases (1/1000) 5 mg de lysat protéique de cerveau de rat Coloration au bleu de Coomassie puis spectrométrie de masse ou

Western blotting anti- HSP90α/β (TebuBio) GST-HSP90α + FLAG-GABARAPL1- 6HIS PBS (0,137 M NaCl, 3.3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) 50 ng de FLAG- GABARAPL1- 6HIS

Western blotting anti- GABARAPL1 (Chemicon Millipore)

GST-GABARAPL1/GST- GABARAPL1 (22-117)

+

lysat de cellules HEK293 GFP-HSP90β 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 1% Triton X100, inhibiteurs de protéases (1/1000) 1 mg de lysat de cellules HEK293 GFP-HSP90β

Western blotting anti- GFP

(Chemicon Millipore)

Tableau XII : Différentes expériences de GST pull-down réalisées.

6.3.2 Immunoprécipitation

• Principe

La technique d’immunoprécipitation permet l’étude d’interactions protéiques in vivo. Cette technique est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques d’une protéine dans le but d’isoler cette protéine en interaction avec un ou plusieurs partenaires des autres protéines présentes en solution. Les protéines en interaction avec la protéine d’intérêt captée par l’anticorps sont de cette manière co-immunoprécipitées. Pour isoler le complexe anticorps- protéine formé, des protéines d’origine bactérienne, telles que les protéines A ou G, ayant une forte affinité pour les immunoglobulines sont utilisées. Ces protéines bactériennes sont en fait couplées à des billes d’agarose ou de sépharose qui permettent ainsi de récupérer le complexe anticorps-protéine par centrifugation ou à l’aide d’un aimant si les billes ont la particularité d’être magnétiques.

• Protocole

L’interaction entre GABARAPL1 et la protéine HSP90α/β est étudiée à partir de cellules MCF-7 FLAG-GABARAPL1-6HIS et de cerveau de rat.

Différents anticorps permettant d’immunoprécipiter la protéine GABARAPL1 sont utilisés : anti-GABARAPL1 (Protein Tech Group) ou anti-FLAG (Sigma-Aldrich). Deux µg d’anticorps anti-GABARAPL1 ou 1 µg d’anticorps anti-FLAG sont incubés avec 30 µl de