MATERIELS ET METHODES
5 TECHNIQUES D'EXTRACTION ET D'ANALYSE DES ARN TOTAU
5.1 Extraction des ARN totaux
Environ 10 millions de cellules MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, BT-549, ZR-75- 1 sont décollées suite à l’action de la trypsine. Les cellules sont centrifugées (1000 g, 5 min, 4°C), le surnageant est éliminé puis les cellules sont directement traitées pour l’extraction des ARN. Celle-ci s’effectue en ajoutant 1 ml de Trizol (Invitrogen) au culot de cellules, la solution obtenue est agitée 10 sec à l’aide d’un Vortex, refroidie dans la glace pendant 15 minutes, puis centrifugée (12 000 g, 10 min, 4°C). Le surnageant est récupéré dans un nouveau tube contenant 200 µl de chloroforme. Cette étape est suivie d'une agitation par simple inversion des tubes. Après centrifugation (12 000 g, 15 min, 4°C), la phase aqueuse contenant les ARN est transférée dans un nouveau tube de 1,5 ml puis un volume égal d'isopropanol est ajouté et les ARN sont précipités 10 min à température ambiante. La sédimentation des ARN est obtenue par une nouvelle centrifugation (15 000 g, 20 min, 4°C). Le culot d'ARN obtenu est lavé par un volume d'éthanol à 75%, centrifugé, séché et repris par 100 µl d'eau ultra-pure stérile. Pour éliminer toute trace d’ADN génomique, les échantillons d’ARN sont traités par 1 U/µl de DNase I (Fermentas) pendant 30 min à 37°C. La réaction est arrêtée à l’aide d’EDTA 2,5 mM suivie d’une étape de chauffage à 65 °C pendant 10 min. Les échantillons d’ARN sont quantifiés à 260 nm puis stockés à -20°C jusqu'à utilisation.
5.2 Analyse par RT-PCR semi-quantitative
Suite à l’extraction des ARN totaux, les ARNm sont rétrotranscrits. Le mélange réactionnel, composé d’1 µg d’ARN totaux, de 1,35 µM d’oligo (dT)12-18 et de 1,35 mM de
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placé dans la glace pendant 10 min puis incubé 10 min à 37°C. Après ajout de 4 µl de tampon 5X (Promega), le volume de la réaction est ajusté à 19,5 µl d’eau ultra-pure. La réaction de transcription inverse est alors réalisée par ajout de 100 U de M-MLV RT (Promega) puis chauffage à 42°C pendant 1 h. La transcriptase inverse est inactivée par chauffage 15 min à 70°C.
Les ADNc gabarapl1 et gapdh (glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase) ainsi obtenus à partir de cellules MCF-7 traitées ou non par du 17-AAG et/ou du MG132, dans les conditions décrites dans le paragraphe 4.5, sont amplifiés par PCR. Le mélange réactionnel est le même que celui décrit dans le paragraphe 3.1 à l’exception de l’ADN plasmidique remplacé par 1 µl d’ADNc. Les différentes amorces utilisées sont décrites dans le Tableau XI. La PCR est réalisée d’après le protocole suivant : 3 min de dénaturation à 92°C suivie de 30 cycles composés d’une étape de dénaturation pendant 30 s à 92°C, d’une étape d’hybridation pendant 30s à 60°C et d’une étape d’élongation pendant 1 min à 72°C.
Amorces Séquences
hum gabarapl1 sens 5’CCCTCCCTTGGTTATCATCCA 3’
hum gabarapl1 rev 5’ACTCCCACCCCACAAAATCC3’
gapdh sens 5’ CATGAGAAGTATGACAACAGCCT 3’
gapdh rev 5’ AGTCCTTCCACGATACCAAAGT 3’
Tableau XI: Séquences des différentes amorces utilisées pour les réactions de PCR.
5.3 Analyse par RT-PCR en temps réel
• Principe
Le SYBR Green est un fluorophore capable de se lier à l'ADN double brin. En solution, le SYBR Green n'est pas fluorescent lorsqu'il est sous sa forme libre, alors qu'il est très fluorescent lorsqu'il est lié à l'ADN. L’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun des cycles par un système de lecture intégré à l’appareil (Applied Biosystems, StepOne).
En PCR, que celle-ci soit quantitative ou non, seule la phase exponentielle est représentative de la quantité initiale d’ADNc et donc du messager d’intérêt. Le cycle de PCR significatif est celui où le signal sort du bruit de fond, ce cycle est appelé Ct (Cycle Threshold). Le Ct est déterminé par l’appareil et correspond au cycle pour lequel le niveau de fluorescence est au-dessus du bruit de fond et au début de la phase exponentielle.
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Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de laquelle 50 % de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin. Après le dernier cycle de PCR, la température est rapidement élevée à 95°C pour dénaturer l'ADN double brin puis elle est abaissée jusqu'à la température d’hybridation ce qui provoque la réhybridation des deux brins d’ADN. La température est ensuite élevée lentement à 95°C. La fluorescence est lue tous les 0,6°C pendant cette élévation progressive de température. Le SYBR Green est fluorescent tant qu'il est lié à l'ADN double brin. Lorsque la température augmente, l'ADN double brin se dissocie, ce qui entraîne le relargage du SYBR Green et une diminution de la fluorescence. La température à laquelle 50 % de l'ADN double brin sont dissociés est appelée température de fusion du produit synthétisé. La température de fusion est obtenue en traçant la dérivée première négative de la fluorescence en fonction de la température : elle correspond au maximum de la courbe. Cette courbe permet de vérifier qu’il n’y a qu’un seul produit de PCR amplifié. Si plusieurs pics sont obtenus à des températures différentes ou des pics décalés par rapport au Tm attendu, cela signifie que nous sommes en présence d’amplicons ayant une taille différente.
Des PCR effectuées en utilisant différentes dilutions d’ADNc (pur, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000) permettent d’obtenir la pente de la courbe Ct = f (dilution d’ADNc) donnée par l’appareil. La formule E = 10(–1/pente) permet de calculer l’efficacité de la PCR pour chaque gène étudié. La méthode de calcul utilisée est la suivante:
Normalisation par le contrôle endogène (gapdh) :
Ct gène cible contrôle – Ct endogène contrôle = ∆Ct contrôle Ct gène cible échantillon – Ct endogène échantillon = ∆Ct échantillon
Normalisation par le contrôle endogène (lignée ZR-75-1) :
∆Ct échantillon - ∆Ct contrôle = ∆∆Ct
La formule 2-∆∆Ct permet d’obtenir le ratio d’expression du gène cible. • Protocole
Les ADNc gabarapl1, gabarap et gapdh humains sont obtenus à partir des cellules MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, BT-549 et ZR-75-1 en suivant les différentes étapes décrites dans les paragraphes 5.1 et 5.2 puis sont amplifiés par PCR en temps réel. Le mélange réactionnel est composé de 1 µl d’ADNc dilué au 1/10, 10 µl de Mix 2X (MasterMix SYBR Green, Applied Biosystems), 500 nM de chaque amorce dans un volume final de 20 µl.
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Les amorces spécifiques sont choisies à l’aide du logiciel Primer Express 3.0. Les différentes amorces utilisées pour amplifier les ADNc gabarapl1 et gapdh sont décrites dans le Tableau XI. Les amorces utilisées pour amplifier l’ADNc gabarap sont les suivantes :
hum gabarap sens : 5’ GCCTTTCCCATCCTGCTGTA 3’ hum gabarap rev : 5’ AGGAAGGGATTGCTGGGTTCT 3’
Le protocole d’amplification est le suivant : 10 min de dénaturation à 95°C suivie de 40 cycles composés d’une étape de dénaturation pendant 30 s à 95°C et d’une étape d’hybridation-élongation pendant 1 min à 60°C. Des triplicats sont réalisés pour chaque échantillon puis les calculs sont ensuite effectués à l’aide du système Applied Biovision 2.1 en tenant compte de l’efficacité de chaque couple d’amorces.