Localisation et expression de la protéine GABARAPL1 et de ses homologues

2.2.1 Localisation et expression de GABARAPL1

Du fait de la forte homologie existant entre les différents membres de la sous-famille GABARAP, et en particulier entre GABARAPL1 et GABARAP, peu d’études visant à localiser GABARAPL1 au niveau cellulaire ou à déterminer son profil d’expression tissulaire n’ont pu être menées jusqu’à présent. En effet, pendant longtemps, aucun anticorps n’était capable de discriminer ces deux protéines. Des anticorps polyclonaux dirigés contre GABARAPL1 commercialisés par différentes sociétés (RD-Biotech, Santa-Cruz Biotechnology, Protein Tech) ou produits au laboratoire ont été testés en western blotting à partir des protéines GST-GABARAP et GST-GABARAPL1 et en immunohistochimie à partir d’isocortex de cerveau de rat (Mansuy et al., 2004 ; Tolle et al., 2008). Il s’est révélé que ces anticorps ne discriminent pas les protéines GABARAPL1 et GABARAP dans les conditions testées. Seul l’anticorps commercialisé par la société Protein Tech semblait tout de même être plus spécifique de GABARAPL1 en immunohistochimie et en western-blotting (Tolle et al., 2008). Cet anticorps anti-GABARAPL1 est en réalité utilisé par plusieurs équipes de recherche comme étant spécifique de la protéine GABARAPL1. De nouveaux tests de spécificité de cet anticorps, selon diverses conditions, ont été depuis menés au laboratoire. Des expériences d’immunohistochimie, immunocytochimie et de western blotting ont effectivement permis de montrer une spécificité accrue de cet anticorps pour GABARAPL1, comparativement aux autres anticorps testés jusqu’à présent, mais sans pour autant être totalement spécifique (article en préparation). L’équipe de Kassiotis a montré, par western blotting à l’aide de cet anticorps, que l’expression de GABARAPL1 et de LC3 est diminuée dans le cœur de patients atteints de cardiomyopathie dilatée idiopathique bénéficiant d’un

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dispositif d’assistance ventriculaire gauche, traduisant une diminution de l’autophagie et par conséquent une diminution des besoins énergétiques du cœur ainsi assisté (Kassiotis et al., 2009). Plusieurs équipes travaillant sur les protéines FoxO ont mis en évidence par immunofluorescence, d’une part, l’augmentation de l’expression de la protéine GABARAPL1 dans des cardiomyocytes de rats nouveaux nés privés en glucose, et d’autre part, une localisation punctiforme de GABARAPL1 dans des cellules cancéreuses de colon HT29 soumises à différents traitements (Chiacchiera and Simone, 2009 ; Sengupta et al., 2009). La distribution de la protéine GABARAPL1 endogène a été recherchée, par immunofluorescence à l’aide de cet anticorps, dans des cellules rénales de singe COS M9 et cette étude a mis en évidence la présence de GABARAPL1 de manière ponctuée dans la région périnucléaire (Jiang et al., 2010b).

Toutefois, plusieurs études réalisées avec d’autres anticorps anti-GABARAPL1 ont été entreprises. L’équipe de Chen a produit un sérum anti-GABARAPL1 décrit pour être spécifique de GABARAPL1 en immunohistochimie mais pouvant reconnaître à la fois GABARAP et GATE-16 en western blotting (Chen et al., 2006 ; Wang et al., 2006). L’expression de la protéine GABARAPL1 a été recherchée chez le rat dans plusieurs organes et en particulier dans le cerveau. Par des expériences de western blotting, un fort taux d’expression de GABARAPL1 est observé dans le foie et le cerveau. Dans le cerveau, la protéine GABARAPL1 est majoritairement présente dans le putamen caudé, le noyau accumbens, l’hypothalamus, l’hippocampe et le thalamus. Des niveaux d’expression moins importants sont observés dans la moelle épinière, le pons, le bulbe olfactif. Le cervelet présente le niveau de GABARAPL1 le plus faible. Les poumons et le cœur présentent des taux plus modérés de GABARAPL1 et les taux les plus faibles sont observés dans les reins et le muscle squelettique (Wang et al., 2006). D’après cette étude, ce profil d’expression de la protéine GABARAPL1 n’est pas totalement en accord pour certains organes, en particulier pour le poumon, avec celui obtenu par analyse de l’expression du messager (Vernier-Magnin

et al., 2001). La microscopie électronique a confirmé la localisation de GABARAPL1 dans

l’appareil de Golgi et dans le réticulum endoplasmique au niveau du corps cellulaire et des dendrites de neurones hypothalamiques de rat et cette même étude a également montré une distribution de GABARAPL1 dans le cytoplasme et au niveau de la membrane plasmique de ces neurones (Wang et al., 2006). Ces derniers résultats sont toutefois à prendre avec précaution étant donné l’utilisation d’un anticorps probablement non entièrement spécifique de GABARAPL1.

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Afin de s’affranchir du problème lié à la spécificité d’anticorps anti-GABARAPL1, la fusion de GABARAPL1 à différentes étiquettes a permis de localiser de manière plus pertinente cette protéine dans la cellule. GABARAPL1 est toujours distribuée de manière punctiforme dans le cytoplasme, l’appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique ou la membrane plasmique selon le type de cellules étudiées. Les premières preuves d’une localisation cytoplasmique et punctiforme ont été rapportées par Mansuy et collaborateurs par surexpression des protéines GABARAPL1-GFP et GFP-GABARAPL1 dans des cellules CHO et IGEC (Mansuy et al., 2004). L’utilisation de protéines marqueurs de l’appareil de Golgi ou du réticulum endoplasmique a permis de démontrer la présence de GABARAPL1 au sein de ces compartiments subcellulaires dans les cellules CHO transfectées par la protéine HA-GABARAPL1, suggérant son association aux vésicules transitant par ces compartiments (Chen et al., 2006). La transfection des protéines de fusion MYC-GABARAPL1 ou GFP- GABARAPL1 et FLAG-GABARAPL1 dans des cellules cancéreuses du col de l’utérus HeLa et des cellules rénales de singe COS M9 respectivement montre également clairement une localisation de GABARAPL1 exogène au niveau de vésicules périnucléaires (Betin and Lane, 2009b ; Jiang et al., 2010b ; Nakamura et al., 2008 ; Pankiv et al., 2007) (Figure 12). Par ailleurs, en condition de stress, la protéine GFP-GABARAPL1 peut être relocalisée au niveau des mitochondries dans des cellules MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts) et dans des cellules HeLa (Novak et al., 2010).

2.2.2 Localisation et expression de Atg8, GABARAP, GATE-16 et LC3

Les autres protéines de la famille Atg8 sont elles aussi exprimées de manière ubiquitaire et présentent une distribution intracellulaire similaire à celle de GABARAPL1, en particulier pour la protéine GABARAP qui est présente dans l’appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, le cytosol et les citernes postsynaptiques dans des neurones en culture (Kittler

et al., 2001 ; Kneussel et al., 2000 ; Leil et al., 2004), au niveau de vésicules périnucléaires

dans des cellules HeLa, CHO et COS M9 (Green et al., 2002 ; Jiang et al., 2010b ; Nakamura

et al., 2008 ; Nowak et al., 2009 ; Okazaki et al., 2000 ; Pankiv et al., 2007 ; Wang and Olsen,

2000) (Figure 12) et au niveau de la membrane plasmique dans des cellules PC12 différenciées (Kneussel et al., 2000). Il est à noter que certaines de ces études ont été menées avec des anticorps anti-GABARAP, notamment dans des expériences d’immunohistochimie. Ces résultats sont donc à prendre avec précaution car on peut supposer que GABARAPL1 a pu également être reconnue dans ces études de localisation du fait de la forte homologie de

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séquence partagée avec GABARAP (Kittler et al., 2001 ; Kneussel et al., 2000 ; Nakamura et

al., 2008 ; Okazaki et al., 2000 ; Wang and Olsen, 2000).

Les protéines Atg8, GATE-16 et LC3 présentent une identité de séquence moindre avec GABARAPL1, permettant le développement d’anticorps spécifiques de ces protéines. La protéine GATE-16, initialement isolée à partir de l’appareil de Golgi de cerveau de bovin, est principalement exprimée au niveau de ce compartiment subcellulaire où elle participe au transport intra-Golgi de protéines liées à des vésicules en participant à la fusion de ces vésicules avec les saccules golgiens (Elazar et al., 2003 ; Legesse-Miller et al., 2000 ; Pankiv

et al., 2007 ; Sagiv et al., 2000) (Figure 12).

Les protéines Atg8 et LC3 sont essentiellement localisées au niveau du cytoplasme et au niveau des autophagosomes et sont ainsi largement utilisées comme marqueurs de ces vésicules chez la levure et chez les mammifères respectivement (Jiang et al., 2010b ; Kabeya

et al., 2000 ; Kirisako et al., 2000 ; Lang et al., 1998 ; Nowak et al., 2009 ; Pankiv et al.,

2007) (Figure 12). Les isoformes humaines LC3A, B et C, bien qu’étant exprimées dans tous les tissus, présentent toutefois des profils d’expression tissulaire distincts (He et al., 2003). Les protéines GABARAP et GATE-16 ont été identifiées par la suite comme étant également capables de s’associer à des vésicules autophagiques dans plusieurs lignées cellulaires (Kabeya et al., 2004 ; Nowak et al., 2009 ; Weidberg et al., 2010). Une étude récente a également permis de montrer l’association de GFP-GABARAP et GFP-LC3 aux autophagosomes chez le poisson zèbre (He et al., 2009). La co-localisation des protéines Atg8, LC3, GABARAP et GATE-16 avec des autophagosomes dans différents types cellulaires a permis de supposer un rôle de ces dernières dans le processus d’autophagie, rôle désormais clairement démontré par des études complémentaires.

Figure 12 : Localisation des protéines GFP-LC3A, GFP-LC3B, GFP-GABARAP, GFP- GABARAPL1 et GFP-GABARAPL2 au niveau de vésicules périnucléaires dans des cellules HeLa. D’après Pankiv et collaborateurs (2007).

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En conclusion, les protéines de la famille Atg8 sont exprimées dans tous les tissus et présentent une distribution cellulaire semblable, au niveau de vésicules intracytoplasmiques périnucléaires.

2.3 Les partenaires protéiques de GABARAPL1 et les fonctions cellulaires