Vecteurs et plasmides recombinants

1.2.6 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404)

La souche LBA4404 a été créée par le Dr. P.J.J. Hooykaas de l’université de Leiden, Pays-Bas et est largement utilisée comme vecteur de transformation génétique de nombreuses plantes comme par exemple A. thaliana, N. benthamiana ou R. graveolens. Cette souche contient un plasmide Ti désarmé, le plasmide pAL4404 qui ne contient que les gènes responsables de l’induction des gènes vir et du transfert de l’ADN-T. Cette souche est résistante à la rifampicine et la présence du plasmide pAL4404 lui confère également la résistance à la streptomycine.

1.3 Souches de levures

1.3.1 S. cerevisiae WAT11

La souche de levure WAT11 a été construite en 1996 par le Dr Denis Pompon (Laboratoire d’Ingénierie des Protéines Membranaires LIPM, Gif-sur-Yvette, France) pour l’expression spécifique de P450s de plantes. Elle dérive de la souche W303 et le gène endogène de la P450 réductase a été remplacé par recombinaison homologue par la P450 réductase AthR1 d’A. thaliana (Urban et al., 1997). Ce gène

AthR1 est sous contrôle du promoteur GAL10-CYC1 et est réprimé par le glucose et induit par le galactose. Cette souche est ADE2 et est donc incapable de pousser sur un milieu dépourvu d’adénine.

1.3.2 S. cerevisiae WAT21

La souche S. cerevisiae WAT21 diffère de la souche S. cerevisiae WAT11 par le remplacement de la cytochrome P450 réductase AthR1par l’AthR2d’A. thaliana.

1.4 Vecteurs et plasmides recombinants

1.4.1 pCR8®/GW/TOPO® (Invitrogen)

Le pCR8®/GW/TOPO®dans sa version kit de clonage est un vecteur d’entrée de type Gateway® utilisé pour cloner rapidement des produits de PCR avec une efficacité de plus de 95%. Une topoisomérase de type I (Figure 28, p. 90) issue du virus Vaccinia est fixée de manière covalente sur un site spécifique (CCCTT) permettant une ligation rapide du produit de PCR dans le vecteur linéarisé. Ce vecteur possède deux extrémités sortantes 3’-T empêchant sa recircularisation et permettant la ligation de produits de PCR dont les extrémités 3’ ont été au préalable additionnées d’une adénine grâce à certaines Taq DNA

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polymérases. De plus, ce vecteur possède deux sites EcoRI (Figure 29, p. 90) flanquant le site d’insertion de l’amplicon permettant une vérification rapide de la présence de l’insert par digestion enzymatique. Les séquences complémentaires aux amorces universelles M13 et T7 permettent de vérifier par PCR le sens d’insertion du gène d’intérêt dans le plasmide et de réaliser des séquençages des fragments insérés. Les sites attL1 et attL2 issus du bactériophage λ sont des séquences situées à moins de 55 paires de bases du site d’insertion qui permettent une recombinaison rapide grâce à l’enzyme LR clonase (Invitrogen) vers un vecteur de destination de type Gateway®. Le vecteur pCR8®/GW/TOPO® contient un gène de résistance à la spectinomycine et une origine de réplication du plasmide pUC pour l’obtention d’un grand nombre de copies du plasmide et le maintien dans E. coli.

Figure 28 : Représentation schématique du vecteur pCR8®/GW/TOPO® (Invitrogen).

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1.4.2 pYeDP60

Le plasmide pYeDP60 a été fourni par le Dr Denis Pompon du Laboratoire d’Ingénierie des Protéines Membranaires (LIPM) du CNRS à Gif-sur-Yvette, France. Ce plasmide est un vecteur d’expression réplicatif doté d’une origine de réplication 2µ de levure (Figure 30, p. 91), d’un polylinker

BamHI/SmaI/KpnI/SacI/EcoRI encadré en amont par le promoteur GAL10-CYC1 inductible par le galactose et réprimé par le glucose, et en aval par un terminateur PGK. Une origine de réplication E. coli(ColE1) ainsi qu’un gène de résistance à l’ampicilline permettent la sélection et l’amplification du plasmide. Ce plasmide présente également deux gènes URA3 et ADE2 qui assurent la complémentation des levures pour l’auxotrophie à l’uracile et à l’adénine. Seules les levures transformées pourront se développer dans un milieu dépourvu en adénine. Le pYeDP60 est un plasmide très stable dans les milieux riches, à de fortes densités cellulaires. Ce plasmide a été spécialement conçu pour l’expression de P450s dans une série de souches S. cerevisiae (WAT11 et WAT21).

Figure 30 : Représentation schématique du vecteur d’expression dans la levure pYeDP60 (communication personnelle du Dr. Denis Pompon).

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1.4.3 pYeDP60_GW®

Ce vecteur est un plasmide de destination Gateway® qui dérive du plasmide pYeDP60. La cassette de recombinaison RfA clonée au niveau du site de restriction BamHI (rendu franc par l’utilisation du fragment de Klenow de la DNA Taq Polymérase, puis déphosphorylé) du polylinker, est encadrée en amont par le promoteur GAL10-CYC1 et en aval par le terminateur PGK. La cassette de recombinaison RfA flanquée par les sites attR1 et attR2 comporte le gène de résistance au chloramphénicol et le gène

ccdB. L’amplification de ce plasmide est réalisée par la transformation de bactéries E. coli ccdB survivalTM. Le gène de résistance à l’ampicilline permet de sélectionner les bactéries recombinantes. Les différents plasmides recombinants issus de ce vecteur seront nommés pYeDP60_GW®_X.

1.4.4 pBIN_GW®

Le plasmide pBIN_GW® a été construit par le Dr. Sébastien Doerper durant sa thèse au laboratoire Agronomie et Environnement. Ce vecteur dérive du plasmide pBIN m-gfp5-ER fourni par le Pr. Jim Haselhoff (Division of Cell Biology, MRC Laboratory of Molecular Biology, Addenbrookes Hospital, Hills Road, Cambridge, CB2 2QH, United Kingdom). Le pBIN_GW® est un plasmide de destination Gateway® à faible nombre de copies. Entre les bordures droite et gauche délimitant l’ADN-T de ce plasmide se situent le gène de sélection npt II et la cassette de recombinaison RfB flanquée par les sites

attR1 et attR2 (Figure 31, p. 93). Le gène nptII qui confère la résistance à la kanamycine est sous le contrôle du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase (Pnos et 3’nos). La cassette de recombinaison RfB qui comporte le gène de résistance au chloramphénicol et le gène ccdB est encadrée en amont par le promoteur 35S et en aval par le terminateur 3’nos. L’amplification de ce plasmide est réalisée par la transformation de bactéries E. coli ccdB survivalTM. Le gène de résistance à la kanamycine permet de sélectionner les bactéries recombinantes.

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Figure 31 : Représentation schématique du vecteur pBIN_GW® (Biteau, 2009).