Caractérisation fonctionnelle de CYP71AZ3 et CYP71AZ4 in vivo

Les premiers résultats obtenus « in vitro» indiquent que CYP71AZ4 est impliqué dans l’hydroxylation de plusieurs substrats (psoralène, scopolétine, 6-méthoxycoumarine, 7-méthoxycoumarine et 7-méthoxy 3-méthylcoumarine), alors que CYP71AZ3 est capable d’hydroxyler uniquement l’esculétine. Afin de démontrer que ces fonctions ne sont pas artéfactuelles, mais bien représentatives de ce qui se passe in planta, CYP71AZ3 et CYP71AZ4 a été exprimé chez N. benthamiana, une plante qui, à l’état naturel, n’est pas capable de synthétiser du psoralène, de la 6-méthoxycoumarine, de la 7-méthoxycoumarine et de la 7-méthoxy 3-méthylcoumarine.

2.5.1 Expression transitoire de CYP71AZ3 et CYP71AZ4 dans un système

d’expression in planta : N. benthamiana

Le système d’expression transitoire chez N. benthamiana, déjà décrit dans la littérature (Sparkes et al., 2006), est utilisé et a été optimisé au sein de notre laboratoire pour l’expression de prényltransférases et de dioxygénases. Des tests préliminaires ont été réalisés au laboratoire par le Dr Alexandre Olry pour tenter d’exprimer des enzymes de la famille des P450s.

2.5.1.1 Test préliminaire avec CYP71AJ1 et l’ATR1 d’A. thaliana

Le P450 utilisé pour optimiser la méthode d’expression transitoire chez le tabac est CYP71AJ1, isolé chez A. majus et qui code la psoralène synthase. Dans un premier temps, la séquence codante de CYP71AJ1 contenue dans le pCR8/TOPO/GW a été transférée par LR recombinaison dans le plasmide binaire pBIN_GW® comme cela est décrit dans le chapitre « Matériel et méthodes ». Des agrobactéries ont ensuite été transformées avec le plasmide recombinant, sélectionnées sur milieu sélectif contenant

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de la kanamycine et de la rifampicine, puis mises en culture pendant 24 heures. En parallèle, des agrobactéries exprimant la protéine p19 ont également été mises en culture pendant 24 h. Les faces abaxiales des deuxième et troisième feuilles les plus jeunes de N. benthamiana ont été co-infiltrées avec les inocula bactériens exprimant CYP71AJ1 et la protéine p19. Quatre jours après l’inoculation, les feuilles ayant été infiltrées ont subi une deuxième infiltration avec une solution contenant de la marmésine à 100 µM. Trois heures après la deuxième infiltration, les feuilles infiltrées sont broyées à l’azote liquide et les phénylpropanoïdes sont extraits comme décrit dans le chapitre « Matériel et Méthodes » et les extraits sont analysés en LC-MS/MS. Les résultats obtenus en LC-MS/MS permettent de confirmer la présence de marmésine dans les feuilles de tabac, néanmoins la production de psoralène par CYP71AJ1 n’a pas été mise en évidence.

Une optimisation de l’expression transitoire de P450s chez le tabac a été initiée en co-exprimant le P450 avec l’ATR1 d’A. thaliana afin de restaurer la stœchiométrie entre l’expression du P450 et de la CPR. Pour cela, le gène codant pour l’ATR1 a été cloné dans le sens direct dans le plasmide pCR8/TOPO/GW, puis transféré dans le pBIN_GW® par LR recombinaison et les plasmides recombinants ainsi obtenus ont été utilisés pour transformer des agrobactéries. Le gène CYP71AJ1 a été co-exprimé chez N. benthamiana avec la protéine p19 et l’ATR1 d’A. thaliana. Pour cela, trois inocula d’agrobactéries recombinantes ont été préparés : le premier contient le gène codant de la protéine p19, le deuxième avec l’ATR1 et le troisième contenant CYP71AJ1. Un premier lot de plantes de tabac a été co-infiltré avec la protéine p19 et CYP71AJ1 et un deuxième lot de N. benthamiana a été co-infiltré avec la protéine p19, l’ATR1 et CYP71AJ1 suivant le protocole décrit dans le chapitre « Matériel et Méthodes ». Quatre jours après la première inoculation, les feuilles des deux lots de plantes ont été infiltrées avec une solution de marmésine à 100 µM. Trois heures après la deuxième inoculation, les feuilles ont été broyées à l’azote liquide et une extraction de polyphénols a été réalisée. La formation de psoralène a uniquement été détectée par LC-MS/MS chez les plantes co-exprimant la protéine p19, l’ATR1 et CYP71AJ1. La co-expression de l’ATR1 avec un P450 permet donc d’améliorer la fonctionnalité du P450 en assurant un meilleur transfert d’électron entre la CPR et le P450.

2.5.1.2 Infiltration de CYP71AZ3 et CYP71AZ4

En se basant sur ces résultats préliminaires, nous avons réalisé l’expression de CYP71AZ3 et CYP71AZ4 chez le tabac. Les gènes codants pour CYP71AZ3 et CYP71AZ4 contenus initialement dans le plasmide pCR8/TOPO/TA/GW, ont été introduits dans le plasmide pBIN_GW® par LR recombinaison. Des agrobactéries A. tumefaciens ont été transformées avec les plasmides recombinants

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obtenus selon le protocole décrit dans le chapitre « Matériel et Méthodes ». Des agrobactéries ont également été transformées avec le vecteur pBIN_GW® vide afin de constituer un témoin négatif. A l’image des expérimentations préliminaires, j’ai donc choisi de co-exprimer CYP71AZ3 et CYP71AZ4 avec les gènes codants pour la protéine p19 et l’ATR1. Pour cela, cinq inocula bactériens différents ont été préparés : un premier inoculum d’agrobactéries exprimant CYP71AZ3, un deuxième exprimant CYP71AZ4, un troisième inoculum exprimant la protéine p19, un quatrième exprimant l’ATR1 et un dernier correspondant au vecteur vide. Puis, j’ai réalisé la co-infiltration de trois lots de plantes de N. benthamiana selon le protocole décrit dans le chapitre « Matériel et Méthodes ». Le premier lot de plantes a été co-infiltré avec des agrobactéries exprimant CYP71AZ3, l’ATR1 et la protéine p19. Le deuxième lot de plantes a été co-infiltré avec des agrobactéries exprimant CYP71AZ4, l’ATR1 et la protéine p19. Enfin un dernier lot a été co-infiltré avec des agrobactéries exprimant l’ATR1, la protéine p19 et le vecteur pBIN_GW® vide afin de constituer un contrôle négatif.

Nous avons décidé d’utiliser deux approches différentes afin de caractériser in planta la fonction de ces deux enzymes. Dans un premier temps, nous avons réalisé une préparation de microsomes de tabac à partir des plantes agro-infiltrées et nous avons ensuite effectué un criblage métabolique in vitro. Dans un second temps, nous avons réalisé une deuxième infiltration des plants de tabac en utilisant un mélange de différents substrats, puis nous avons extraits les polyphénols.

Préparation de microsomes de tabac et criblage métabolique :

Après quatre jours de co-infiltration, les feuilles des lots de N. benthamiana co-infiltrées avec CYP71AZ4, l’ATR1 et la protéine p19, avec CYP71AZ3, l’ATR1 et la protéine p19 ainsi que les feuilles du lot de tabac constituant le contrôle négatif sont prélevées, broyées à ultraturax et une préparation de microsomes est ensuite effectuée selon la méthode décrite dans le chapitre « Matériel et Méthodes ». Des incubations dans du tampon NaPi 0,1 M pH 7,5 ont par la suite été effectuées pendant 30 min avec les trois lots de microsomes avec les différents substrats de ces deux enzymes à 200 µM en présence et en absence de NADPH. Les réactions ont été stoppées par l’addition de 37,5 µl d’acétonitrile/HCl (99/1). Les mélanges réactionnels sont ensuite centrifugés pendant 30 minutes à 10 000 g et les surnageants sont prélevés et placés dans des vials en vue d’être analysés en LC-MS/MS.

Co-infiltration avec un mélange de substrats :

En parallèle, après quatre jours de co-infiltration, les feuilles du lot de N. benthamiana co-infiltrées avec CYP71AZ4, l’ATR1 et la protéine p19 ainsi que les feuilles du lot de tabac constituant le contrôle négatif sont à nouveau infiltrées avec un mélange de substrats potentiels (psoralène, scopolétine,

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méthoxycoumarine, 7-méthoxycoumarine et 7-méthoxy 3-méthylcoumarine) de CYP71AZ4 à 100 µM. Trois heures après la seconde infiltration, les feuilles ont été prélevées et broyées à l’azote liquide en vue de réaliser une extraction des composés phénylpropanoïdes.

2.5.2 Extraction des polyphénols et identification par spectrométrie de masse

Les polyphénols ont été extraits à partir des feuilles de tabac agro-infiltrées selon le protocole décrit dans le chapitre « Matériel et Méthodes », puis analysés par spectrométrie de masse. Plusieurs molécules ont été recherchées en utilisant un filtre de masse : les différents substrats utilisés ainsi que les masses des molécules hydroxylées.

Concernant les expériences réalisées à partir de la préparation de microsomes, les cinq substrats de CYP71AZ4 ainsi que le substrat de CYP71AZ3, l’esculétine, ont été clairement identifiés dans les échantillons. Néanmoins, cette approche n’a pas permis de détecter une métabolisation que ce soit pour CYP71AZ3 ou pour CYP71AZ4.

La deuxième expérience réalisée en co-inflitrant les substrats de CYP71AZ4 dans des tabacs co-infiltrés avec CYP71AZ4, l’ATR1 et la protéine p19 n’a pas non plus abouti à une métabolisation. Cette expérience d’expression transitoire de P450s chez le tabac a été répétée deux fois en utilisant CYP71AJ1 comme contrôle positif, sans plus de succès. Ce protocole reste donc à être optimiser.

Cette approche n’a donc pas permis de déterminer si les substrats de ces deux enzymes identifiés in vitro

étaient représentatifs de la réalité physiologique chez le panais ou artéfactuels. J’ai donc décidé de réaliser une extraction de polyphénols à partir de feuilles de P. sativa âgés de 2 à 3 mois. Les extraits ainsi obtenus ont été analysés en LC-MS/MS afin de rechercher les différents substrats identifiés. Les résultats obtenus indiquent que seuls l’esculétine et le psoralènesont produits dans des feuilles de

P. sativa.