Structures secondaire et tertiaire et domaines conservés

Figure 21 : Représentation schématique d'un cytochrome P450 eucaryote microsomal associé à la cytochrome P450 réductase constituée d'un domaine FAD et d'un domaine FMN (Werck-Reichhart et al., 2000).

Les CPRs présentent peu de sélectivité d’interaction avec les cytochromes P450. D’ailleurs, la diversité des CPRs est très faible par rapport au nombre de P450s présents dans chaque génome. A titre d’exemples, l’Homme et la levure n’ont qu’une seule CPR, les plantes quant à elles, ont généralement deux ou trois CPRs (Benveniste et al., 1991; Mizutani and Ohta, 1998). Ces isoformes pourraient avoir des rôles physiologiques différents chez les plantes supérieures (Ohta and Mizutani, 2004). Chez A. thaliana, AthR1 est exprimée de manière constitutive, alors que la synthèse d’AthR2 peut être induite par la lumière ou par des blessures (Mizutani and Ohta, 1998).

3.4 Structures secondaire et tertiaire et domaines conservés

Bien que les identités de séquences peptidiques entre P450s procaryotes et eucaryotes soient relativement faibles (16 % d’identité au minimum), cette famille d’enzymes présente une forte conservation de structure tertiaire. Ces résultats ont été obtenus à partir de données structurales cristallographiques de P450s cytosoliques et membranaires (Schoch et al., 2004; Scott et al., 2003; Wester et al., 2004; Williams et al., 2000a, 2000b, 2004; Yano et al., 2004, 2005). Ces protéines sont constituées par plusieurs hélices α et de quelques feuillets β qui s’associent en deux domaines globulaires α et β (Figure 22, p. 61).

Malgré l’importante diversité génétique des P450s, cette famille est caractérisée par plusieurs séquences protéiques consensus :

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 La séquence FxxGxRxCxG située du côté proximal de l’hème en amont de l’hélice L est un domaine très conservé appelé « Cys-pocket » (Figure 22, p. 61). La cystéine de cette séquence forme une liaison thio-ester avec l’atome de fer de l’hème contribuant ainsi à la fixation et au maintien de l’hème au sein de l’enzyme.

 La séquence (G/A)Gx(E/D)T située du côté proximal de l’hème au niveau de l’hélice I est moins bien conservée au sein des P450s (Figure 22, p. 61). Cette séquence est impliquée dans l’activation de l’oxygène moléculaire lors de la réaction enzymatique.

 La séquence ExxR localisée au niveau de l’hélice K est également susceptible de stabiliser la structure du noyau de la protéine en maintenant la poche de l’hème dans sa position.

Figure 22 : Représentation schématique de la structure primaire d'un P450 membranaire eucaryote. En noir : ancre membranaire ; en rouge : acides aminés basiques ; en gris : coude proline ; en violet : séquences SRSs. Les hélices α sont annotées de A à L.

Les cytochromes P450 sont localisés à différents endroits au niveau cellulaire. Chez les procaryotes, les P450s sont des enzymes solubles dans le cytosol, alors que chez les eucaryotes ce sont des protéines membranaires distribuées dans différents compartiments cellulaires. Chez les plantes, les P450s sont le plus souvent localisés sur la face cytosolique de la membrane du réticulum endoplasmique, mais ils peuvent également être ancrés dans la membrane des mitochondries ou plus rarement au niveau de la membrane des chloroplastes (Guirimand et al., 2011; Quinlan et al., 2012).

Les P450s associés à la membrane du réticulum endoplasmique disposent d’une hélice hydrophobe d’une vingtaine d’acides aminés au niveau de l’extrémité N-terminale de l’enzyme (Figure 22, p. 61). Cette région est suivie d’une région constituée de résidus basiques qui délimite l’ancre membranaire et d’une région riche en prolines qui définit le coude de l’enzyme et permet le bon repliement de la protéine (Chen and Kemper, 1996). Cette région permet également à la partie globulaire de l’enzyme de s’accoler à la membranaire du réticulum endoplasmique et de se placer correctement par rapport à la CPR qui est également membranaire (Figure 22, p. 61) (Kemper, 2004).

Les régions de l’enzyme responsables de l’entrée et du positionnement du substrat au niveau du site actif sont appelées Substrate Recognition Site (SRSs). Ces séquences ont été pour la première fois mises en

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évidence chez la famille CYP2 en comparant 51 des membres de cette famille avec 8 séquences de P450s bactériens (Gotoh, 1992). Ces SRSs, au nombre de 6, correspondent à ces régions spécifiques conservées chez tous les P450s, surtout pour les SRSs 1, 4, 5 et 6 (Figure 23, p. 62) (Williams et al., 2000a). L’obtention de structures cristallographiques et de modéles moléculaires ont permis de mettre en évidence plusieurs acides aminés déterminants pour l’activité de l’enzyme. L’arginine 104 du SRS 1 de CYP71AJ1 semble interagir avec l’arginine 434 pour stabiliser l’hème du site actif (Larbat et al., 2007).

Suivant les P450s, l’accès du substrat au site actif s’effectue par deux canaux différents. Le premier est définit par la boucle F-G qui fait intervenir les SRSs 2 et 3 (Chen and Kemper, 1996) (Wilmouth et al., 2002), le deuxième implique la boucle B-C. Une étude effectuée dans notre laboratoire a montré que la séquence HPP du SRS 5 est conservée chez de nombreux membres de la famille CYP71, mais elle est remplacée par YFT chez la psoralène synthase (CYP71AJ1-3) et par YIT chez l’angélicine synthase (CYP71AJ4) et semble déterminante pour l’activité de ces deux enzymes (Larbat et al., 2007, 2009). De plus, la modélisation de CYP71AJ1 semble montrer que la thréonine 479 du SRS 6 est essentielle à l’activité catalytique de l’enzyme (Larbat et al., 2007). Les fonctions de ces gènes sont uniquement connues pour CYP71AJ1-4 et correspondent à la psoralène synthase et à l’angélicine synthase.

Figure 23 : Représentation de la structure tridimensionnelle de CYP2D6 complexé avec du dextrométhorphane (en vert) obtenues à partir des modèles cristallographiques de CYP101, 102, 107A, 108 et 2C5 (de Graaf et al., 2005).

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A ce jour, tous les P450s identifiés sont des hémoprotéines d’un poids moléculaire compris entre 45 et 60 kDa. Ces hémoprotéines sont caractérisées par un groupe prosthétique central, l’hème, qui catalyse la réaction enzymatique. Le plan de l’hème définit la face proximale et la face distale contenant le site actif du P450. L’hème est relié au reste de la protéine au niveau d’une cystéine située dans la région C terminale de l’enzyme. Cette liaison thio-ester est non-covalente et complexe l’atome de fer du groupe prosthétique. L’hème est constitué d’un noyau protoporphyrine IX identique chez tous les P450s (Figure 24, p. 63). Ce noyau est caractérisé par 4 cycles pyroles qui renferment à leur centre un atome de fer capable d’effectuer 6 liaisons de coordinence. Quatre d’entre elles relient cet atome avec le tétrapyrole, une cinquième liaison permet de stabiliser le noyau protoporphyrine dans le site actif via la liaison thio-ester décrite précédemment et la dernière liaison peut être établie avec une molécule d’H2O, d’O2 ou de CO (Figure 24, p. 63).

Figure 24 : Structure chimique développée d’un hème de type protoporphyrine IX.