CYP71AZ3 et CYP71AZ4 : analyse fine des séquences protéiques

2.2 CYP71AZ3 et CYP71AZ4 : analyse fine des séquences protéiques

Les 2 séquences codantes complètes identifiées dans la banque de panais ont été soumises au comité de nomenclature qui leur a attribué les codes CYP71AZ3 (P_sat_rep_c729) et CYP71AZ4 (P_sat_rep_c588). La comparaison des pourcentages d’identité et d’homologie de séquences peptidiques entre les différents membres de cette sous-famille indique que CYP71AZ1 est plus proche de CYP71AZ3 (81 % d’identité) que de CYP71AZ4 (71 %) (Tableau 14, p. 151). Il en est de même lorsque l’on compare les pourcentages d’identités nucléotidiques entre les différents membres de CYP71AZ (Tableau 14, p. 151). Ces résultats suggèrent que les différents membres de CYP71AZ dérivent d’un même gène ancestral qui pourrait être CYP71AZ1. Il est de fait possible que les enzymes correspondantes aient acquis de nouvelles fonctions par des phénomènes de duplications géniques et de mutations.

A CYP71AZ1 CYP71AZ3 CYP71AZ4

CYP71AZ1 87 % 81 %

CYP71AZ3 87 % 83 %

CYP71AZ4 81 % 83 %

B CYP71AZ1 CYP71AZ3 CYP71AZ4

CYP71AZ1 81 % 71 %

CYP71AZ3 96 % 73 %

CYP71AZ4 84 % 85 %

Tableau 14 : Comparaison des pourcentages d’identité (en vert) et d’homologie (en violet) nucléotidiques (A) et peptidiques (B) entre CYP71AZ3 et CYP71AZ4 identifiés dans la banque d’ADNc de P. sativa et CYP71AZ1 isolé chez A. majus.

Nous avons généré un arbre phylogénétique à partir d’un alignement réalisé par ClustalX et en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance (maximum likelihood). Nous avons intégré dans cet arbre les différentes séquences peptidiques des P450s de la sous-famille CYP71AZ ainsi que les P450s de la sous-famille CYP71AJ dont le rôle dans la synthèse des furanocoumarines a déjà été démontré. Cet arbre indique que les deux gènes CYP71AZ1 et CYP71AZ3 se regroupent (ce qui est cohérent avec les pourcentages d’identité décrit précédemment) et que CYP71AZ4 est un peu plus éloigné (Figure 41, p. 152). Si on compare les résultats obtenus avec ceux de la sous-famille CYP71AJ on peut constater une certaine analogie de structure de l’arbre. Pour rappel, CYP71AJ1-3 ont été identifiées comme ayant des activités psoralène synthases tandis que CYP71AJ4 est une angélicine synthase (Figure 41, p. 152). Basé sur cette observation, on ne peut s’empêcher de faire le parallèle et d’émettre l’hypothèse (qui n’est

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qu’une hypothèse de travail à ce stade) que certains CYP71AZ pourraient jouer un rôle dans la synthèse de furanocoumarines linéaires et que d’autres seraient plutôt dédiés à la synthèse de furanocoumarines angulaires. Comme CYP71AZ1 a été identifié chez A. majus, une plante qui ne produit que des furanocoumarines linéaires, nous pouvons alors imaginer que CYP71AZ1 et 3 pourraient être liés à la synthèse de ce type de molécules.

Figure 41 : Arbre phylogénétique des différents membres de CYP71AJ et CYP71AZ. Alignement de séquences peptidiques réalisé avec ClustalX et arbre phylogénétique construit avec MEGA6 en utilisant la méthode

de maximum likelihood. Les numéros d’accession sur GenBank/EMBL/DDBJ des gènes caractérisés sont les

suivants : CYP71AJ1 (psoralène synthase) A. majus (Q6QNI4), CYP71AJ2 (psoralène synthase) A. graveolens (C0SJS4), CYP71AJ3 (psoralène synthase) P. sativa (C0SJS2), CYP71AJ4 (angélicine synthase) P. sativa (C0SJS3).

En 1992, Gotoh et ses collaborateurs ont identifié des régions importantes chez les cytochromes P450, régions qui, dans la structure tertiaire de la protéine, interagissent directement avec le substrat. Une modification des acides aminés présents dans ces séquences SRSs peut générer une altération ou un changement de spécificité de l’enzyme vis-à-vis d’un substrat. En effet, l’encombrement stérique des chaînes latérales ainsi que les propriétés physico-chimiques des acides aminés peuvent être totalement différentes. Nous avons prêté attention aux différences existant entre CYP71AZ1, 3 et 4 au niveau des 6 SRSs potentiels (Gotoh, 1992; Larbat et al., 2007). Dans ce cas, nous considérons que les structures tertiaires des protéines sont superposables et que, de fait, les SRSs sont localisés dans les mêmes régions de la structure primaire des 3 P450s (Figure 42, p. 153).

CYP71AJ1 CYP71AJ2 CYP71AJ3 CYP71AJ4 CYP71AZ4 CYP71AZ1 CYP71AZ3 CYP73A1 90 100 100 100 100 0.2

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Figure 42 : Alignement des séquences peptidiques de CYP71AZ1 (A. majus), CYP71AZ3 (P. sativa)

et CYP71AZ4 (P. sativa).Les six séquences potentielles de reconnaissance du substrat (SRSs) sont encadrées en rouge.

L’analyse comparative des différents SRSs des membres de CYP71AZ, indique qu’apriori, CYP71AZ1 est plus proche de CYP71AZ3 (entre 50 et 95 % d’identité) que de CYP71AZ4 (entre 20 et 75 % d’identité) (Tableau 15-A, p. 154). Ces résultats vont dans le sens des comparaisons de séquence globale des séquences protéiques décrites précédemment. Cependant, une analyse plus détaillée des identités de séquences restreintes à l’un ou l’autre SRS donnent des informations nouvelles. Les travaux de Larbat et de ses collaborateurs indiquent que les SRS2 et SRS3 pourraient former un canal permettant l’entrée du substrat dans l’enzyme (Larbat et al., 2007). Au niveau du SRS2, CYP71AZ3 et CYP71AZ4 présentent une grande différence par rapport à CYP71AZ1 (60 % d’identité avec CYP71AZ3, 20 % d’identité avec CYP71AZ4) (Tableau 15-A, p. 154). Par ailleurs, l’analyse détaillée de ce SRS2 montre que la leucine 218 de CYP71AZ1 est remplacée par une phénylalanine chez CYP71AZ3 et CYP71AZ4 (Figure 42, p. 153). Ces 2 types d’enzymes ont des encombrements stériques très différents. Il est donc

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très probable que cet accès au site actif laisse passer des molécules très différentes. De même, la thréonine 368 et l’alanine 370 présentes chez CYP71AZ1 sont remplacés par des prolines chez CYP71AZ3 et CYP71AZ4 (Figure 42, p. 153). Or, ces deux acides aminés sont connus pour introduire des modifications de structure secondaire comme l’interruption d’une hélice ou la destabilisation d’un feuillet β. Au niveau du SRS3, l’arginine 242 de CYP71AZ1 est remplacée par une valine ayant un encombrement stérique beaucoup plus faible chez CYP71AZ4 (Figure 42, p. 153). Enfin, au niveau du SRS5, la thréonine 368 et l’alanine 370 de CYP71AZ1 sont remplacés par des prolines chez CYP71AZ3 et 4, ce qui peut également provoquer d’importantes modifications de structure secondaire des protéines (Figure 42, p. 153). L’ensemble de ces résultats semble donc jouer en faveur d’une fonction différente de CYP71AZ1 par rapport à CYP71AZ3 ou 4.

A SRS 1 SRS 2 SRS 3 SRS 4 SRS 5 SRS 6 Complet CYP71AZ3 95 60 82 81 50 77 81 CYP71AZ4 70 20 55 65 75 62 71 B SRS 1 SRS 2 SRS 3 SRS 4 SRS 5 SRS 6 Complet CYP71AZ1 35 20 18 31 58 38 36 CYP71AZ3 35 20 9 35 75 23 34 CYP71AZ4 30 0 18 23 58 31 32 C SRS 1 SRS 2 SRS 3 SRS 4 SRS 5 SRS 6 Complet CYP71AZ1 50 0 27 35 50 38 36 CYP71AZ3 50 0 27 42 58 23 36 CYP71AZ4 35 10 36 35 42 23 34

Tableau 15 : Pourcentages d'identité des séquences peptidiques codant pour les potentiels SRSs et les séquences complètes des membres de CYP71AJ et CYP71AZ. Les séquences SRSs ont été identifiées sur la Figure 42. Ce tableau présente les pourcentages d’identité entre CYP71AZ3 et 4 et CYP71AZ1 d’A.majus (A).

Les tableaux B et C représentent respectivement le pourcentage d’identité entre les membres de CYP71AZ et la psoralène synthase (CYP71AJ3), et l’angélicine synthase (CYP71AJ4).

Enfin, pour compléter cette étude, nous avons comparé les SRSs et les séquences complètes des CYP71AZ avec ceux qui ont été décrits pour CYP71AJ3 (Tableau 15-B, p. 154) et CYP71AJ4 (Tableau 15-C, p. 154). Dans ce cas, les différences se révèlent être très importantes (25 à 100 %). Ces analyses

in silico semblent donc indiquer très clairement que malgré des identités de séquences assez importantes, il est fort probable que ces enzymes ne soient pas impliquées dans la synthèse des mêmes types de molécules.

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