Méthodes d’analyses biochimiques

une deuxième infiltration avec des mélanges de 5 à 6 substrats à 100 µM ou utilisées pour effectuer une préparation de microsomes. Après la deuxième infiltration, les feuilles sont soient coupées au niveau du pétiole et placées dans le reste de la solution de substrats (Photographie 3, p. 119) pendant 3 h avant de réaliser une extraction de phénylpropanoïdes, soit laissées directement sur la plante et broyées au bout de trois heures.

Photographie 3 : Expression transitoire de P450s chez N. benthamiana avec co-infiltration de substrats.

5.2.4 Préparation de microsomes de plantes

Quatre jours après l’infiltration par des agrobactéries, les feuilles sont pesées afin d’avoir le même poids total pour chaque mélange infiltré. Les feuilles sont placées dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de tampon Kpi 0,1 M à pH 7 et une tablette d’inhibiteur de protéases (complete Mini, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets, Roche). Les feuilles sont broyées à l’ultraturax (Polytron® PT 2100, agrégats PT-DA 2112/2EC et PT-DA 2105/EC, Kinematica) jusqu’à obtention d’une solution homogène. 0,1 % de poly(vinylpolypyrrolidone) (p/p) par gramme de feuille ainsi que 1 ml de DTT sont ajoutés à la solution. Le mélange est centrifugé 30 min à 7 000 g et le surnagent est filtré sur du papier Whatman® (grade 2V, 8 µm) et réparti dans deux tubes prévus pour l’ultracentrifugeuse. Les microsomes sont culottés à 100 000 g pendant 1 h à 4 °C. Les microsomes sont repris dans 600 µl de tampon Kpi, aliquotés par 200 µl, congelés dans de l’azote liquide et stockés à -20 °C.

6 Méthodes d’analyses biochimiques

6.1 Extraction de composés polyphénoliques

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Le même protocole est utilisé pour réaliser toutes les extractions de composés polyphénoliques à partir des feuilles, de tiges et de racines issues des différentes plantes de cette étude. 50 à 100 mg de matériel végétal frais sont congelés et broyés dans de l’azote liquide à l’aide d’un mortier en céramique et d’un pilon au préalablement refroidis. 1 ml d’une solution de méthanol à 80 % contenant ou non le standard interne à 5 µM (pimpinelline) est ajouté à la poudre ainsi obtenue. L’ajout de l’étalon interne permet de s’affranchir des pertes engendrées par la préparation de l’échantillon, mais également des volumes injectés en chromatographie liquide. Le mélange est homogénéisé à l’aide d’un vortex pendant 1 min, puis centrifugé pendant 30 min à 10 000 g. Le surnageant est prélevé et évaporé dans un nouveau tube en utilisant une centrifugeuse sous vide (Concentrator Plus, Eppendorf). Les résidus sont resuspendus dans 300 µl de méthanol, puis la solution est centrifugée pendant 30 min à 10 000 g avant d’être placée dans des vials. Les échantillons sont conservés à -20 °C avant d’être analysés par chromatographie.

6.1.2 Protocole utilisé lors de la deuxième expérience d’élicitation

50 à 100 mg de racines fraîches sont lyophilisés puis broyés pendant 2 min à l’aide d’un broyeur à bille (MM 400, Retsch®). 500 µl d’une solution de méthanol à 80 % contenant le standard interne à 5 µM (pimpinelline) est ajouté à la poudre ainsi obtenue. Le mélange est homogénéisé à l’aide d’un vortex pendant 1 min, puis centrifugé pendant 30 min à 10 000 g. Le surnagent est prélevé et mis à évaporer dans un nouveau tube en utilisant une centrifugeuse sous vide (Concentrator Plus, Eppendorf). Les résidus sont resuspendus dans 150 µl de méthanol, puis la solution est centrifugée pendant 30 min à 10 000 g avant d’être placée dans des vials. Les échantillons sont conservés à -20 °C avant d’être analysés par chromatographie.

6.2 Mesure d’activités enzymatiques

6.2.1 Substrats

La liste de la totalité des molécules utilisées pour le criblage métabolique comportant les informations telles que le poids moléculaire ou le numéro CAS se trouve en Annexe 2 (p. 284-287). Les solutions stocks sont préparées à 10 mM ou à 1 mg/ml dans du DMSO ou de l’éthanol et stockées à -20 °C.

6.2.2 Détermination des constantes cinétiques

Les réactions sont conduites dans un volume réactionnel de 100 µl comprenant 20 µl de microsomes de tabac ou de levure, 200 µM de substrat, 1 mM de NADPH (Sigma) et du tampon phosphate de sodium

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NaPi 0,1 M pH 7,5. De la même manière, les microsomes sont incubés en absence de cofacteur afin de constituer un contrôle négatif. L’incubation est réalisée pendant 1 min 30 à 30 min à 28 °C sous agitation (160 rpm) à l’aide d’un Thermomixer (Eppendorf). La réaction est stoppée par l’ajout de 37,5 µl d’acétonitrile/HCl (1%). La solution est ensuite centrifugée à 8 000 g pendant 30 min. Le surnagent est prélevé afin d’être analysé par HPLC ou LC-MS/MS.

Afin de déterminer les constantes cinétiques, l’incubation est réalisée avec des concentrations croissantes en substrat (de 0,1 µM à 200 µM). Les expériences sont répétées trois fois et le temps de la réaction est adapté pour que la conversion du substrat n’excède pas 50 % pour les concentrations les plus faibles. Les constantes cinétiques apparentes sont déterminées par le logiciel Sigmaplot (Systat Software Inc., http://www.sigmaplot.com/). La représentation en double inverse de Lineweaver-Burk qui exprime l’inverse de l’activité enzymatique en fonction de l’inverse de la concentration en substrat permet d’obtenir les constantes d’affinités Kmde l’enzyme.

6.2.3 Test de l’inhibition par des furanocoumarines

Les réactions enzymatiques effectuées pour les tests d’inhibitions des P450s sont réalisées exactement dans les mêmes conditions que pour la détermination des constantes cinétiques. L’inhibiteur est ajouté au milieu réactionnel à la concentration de 100 µM.

6.3 Détection des produits formés par HPLC

Les échantillons issus du criblage métabolique sont analysés sur une colonne C18 en phase inverse (LiChrospher RP-18, 250x4.6, 5 µm) équipée d’une précolonne (LiChroCART® 250-4) par HPLC (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). 50 µl de l’échantillon sont injectés. La séparation est réalisée à un débit de 0,7 ml/min à l’aide d’un solvant A (eau ultrapure, acide formique 0,1 %) et d’un solvant B (méthanol, acide formique 0,1 %). Les composés sont séparés à l’aide d’un gradient de phase mobile (A : B ; v/v), (90 : 10) jusqu’à 3 min, (1 : 99) à 34 min, (1 : 99) à 37 min, (90 : 10) à 38 min, (90 : 10) à 43 min. Une détection de longueur d’onde entre 200 et 600 nm est réalisée et les chromatogrammes sont extraits à la longueur d’onde maximale du composé (en général entre 280 nm et 350 nm). L’identification des produits formés se fait par recoupement des temps de rétention et des spectres d’absorbance par rapport à ceux des molécules standards. Les résultats sont confirmés grâce aux spectres de fragmentations obtenus par LC-MS/MS. Lorsque les standards ne sont pas disponibles dans le commerce, les fractions correspondantes aux produits formés sont collectées et les molécules sont analysées par RMN du proton.

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6.4 Identification des produits formés par spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse (MS) est une technique de détection performante qui permet d’identifier les molécules d’intérêts par comparaison des spectres de fragmentation avec une grande précision par mesure des intensités associées à leurs masses. Les molécules chargées sont séparées suivant leur rapport masse/charge (m/z).

Le système LC-MS/MS disponible au Laboratoire Commun d’Analyses de l’ENSAIA (Vandœuvre -lès-Nancy) est équipé d’une pompe binaire et d’un spectromètre de masse à trappe ionique (LTQ-MS, Thermo Scientific, San Jose, CA, USA). La séparation des molécules se réalise par chromatographie liquide (Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, USA) avec une colonne C18 en phase inverse (C18 Alltima revrese phase column 150 x 2.1mm, 5µm, Grace/Alltech, Darmstadt, Germany). La méthode de séparation utilisée dure 36 minutes avec un débit de 0,2 ml/min et utilise les mêmes mélanges de solvants que ceux décrits précédemment. La méthode de séparation est la suivante : (100 : 0) à 0 min, (90 : 10) à 25 min, (100 : 0) à 30 min, (90 : 10) à 36 min. 20 µl de l’échantillon à analyser sont injectés. L’ionisation des molécules est réalisée par électronébulisation (ESI) en mode positif. Le champ électrique de nébulisation est de 4,5 kV et la température du capillaire maintenue à 300 °C. Les débits du gaz coaxial, du gaz auxiliaire et du gaz barrière sont paramétrés respectivement à 40, 10 et 10 (unité arbitraire.min -1). Le voltage du capillaire de transfert, du split lens et du front lens sont respectivemet de 36 V, -44V et -3,5V. L’identification des composés se fait grâce à la réalisation d’un scan complet entre 50 et 1000 m/z et d’une recherche spécifique de la masse du substrat et de ses produits attendus. L’analyse des données est réalisée à l’aide du logiciel Xcalibur (version 2.1).

6.5 Dosage de furanocoumarines par LC-MS/MS

Le dosage des furanocoumarines dans les extraits de panais est réalisé par rapport à un étalon interne (pimpinelline) lors des expériences d’élicitation. L’absence de pimpinelline dans les extraits réalisés à partir de feuilles, de tiges et de racines de panais a été vérifiée au préalable et a permis d’utiliser cette molécule comme étalon interne dans les expériences d’élicitation.