Les vecteurs pN3-βArr1(ou2)-TAP et pEF-neo(ou bsd)-βArr1-TAP permettent l’expression des β-arrestine 1 humaine ou β-arrestine 2 de rat fusionnées à l’étiquette TAP sous le contrôle du promoteur CMV ou pEF-1α, respectivement.
Le fragment de 560 bases codant le TAP-TAG en entier a été amplifié par PCR à partir du vecteur pZome1C®, grâce aux oligonucléotides Tag-S et Tag-AS introduisant les sites de restriction SalI et NotI. Après digestion, le fragment SalI / NotI a été introduit dans le vecteur pEGFP-N3-βArr1 en remplacement du fragment SalI / NotI codant l’EGFP pour donner le vecteur pN3-βArr1-TAP. La même stratégie appliquée avec les oligonucléotides Tag-S et EM4 a permis la construction du vecteur pN3-βArr1-CBP.
La construction du vecteur pN3-βArr2-TAP n’a pas pu être réalisée de la même manière que pN3-βArr1-TAP car le vecteur pEGFP-N3-βArr2 dont nous disposions ne présente pas de site SalI entre les séquences codant la β-arrestine et l’EGFP. La technique utilisée a été la fusion de gènes par PCR développée par Yon & Fried (Yon et Fried, 1989). Un fragment PCR1 codant la β-arrestine 2 de rat a été amplifié à partir de pEGFP-N3-βArr2, grâce aux oligonucléotides N3-S et EM7. Un fragment PCR2 codant l’étiquette TAP a été amplifié à partir de pZome1C, grâce aux oligonucléotides EM5 et Tag-AS. Les fragments PCR1 et PCR2 se chevauchent à raison de 37 bases correspondant à une partie des oligonucléotides EM7 et EM5. Un dernier fragment PCR3 a pu être amplifié à partir de la matrice composée des fragments PCR1 et PCR2 se chevauchant, grâce aux oligonucléotides extrêmes N3-S et Tag-AS. Ce dernier fragment a été digéré par SacI et inséré dans le vecteur pN3-βArr1-TAP coupé par SacI en remplacement de la β-arrestine 1 et d’une partie de l’étiquette TAP.
Les mutations R394A et R396A ont été introduites dans le vecteur pN3-βArr2-TAP par fusion de gènes par PCR. Les deux premiers fragments PCR1 et PCR2 ont été amplifiés à partir du plasmide pN3-βArr2-TAP avec les couples d’oligonucléotides N3-S / EM12 et EM11 / EGFP-AS. Les oligonucléotides EM11 et EM12 portent les mutations désirées et sont complémentaires. Une dernière étape de PCR a permis d’amplifier le fragment βArr2R394-396A- TAP à partir du couple d’oligonucléotides N3-S / EGFP-AS et de la matrice composée des fragments PCR1 et PCR2. Après digestion de ce fragment par PstI / NotI, la séquence codant
une partie de la β-arrestine 2-TAP mutée a été réintroduite dans le plasmide pN3-βArr2-TAP pour obtenir le plasmide final pN3-βArr2R394-396A-TAP.
Pour obtenir les vecteurs pEF-neo-βArr1-TAP ou pEF-bsd-βArr1-TAP, le fragment HindIII (transformé en bout franc par l’enzyme klenow) / NotI de pN3-βArr1-TAP codant la β-arrestine 1 étiquetée TAP a été inséré dans pEF-neo entre les sites SmaI et NotI ou dans le vecteur commercial pEF6-bsd-MycHisA entre EcoRV et NotI.
Le vecteur pEF-bsd-βArr1-CBP a été obtenu par clonage du fragment NheI / NotI du vecteur pN3-βArr1-CBP codant la β-arrestine 1 étiquetée CBP dans le vecteur pEF6-bsd- MycHisA ouvert par SpeI (compatible avec NheI) et NotI.
Les vecteurs pEF-neo(ou bsd)-βArr1-TAP-IRES-EGFP permettent la transcription d’un ARN messager bicistronique et une expression couplée de la β-arrestine 1 étiquetée et de la protéine fluorescente EGFP. Pour obtenir ces vecteurs, le fragment IRES-EGFP à bouts francs a été excisé du vecteur pTet-bsd-IRES-EGFP par les enzymes EcoRV et NheI (transformé en bout franc par l’enzyme klenow), puis inséré dans les vecteurs pEF-neo- βArr1-TAP ou pEF-bsd-βArr1-TAP ouverts au niveau du site NotI (transformé en bout franc par l’enzyme klenow).
Pour obtenir pEF-neo-FPRL1-Tev-ProtA :
- le fragment Tev-ProtA, flanqué des sites de restriction XbaI et NotI, issu d’une PCR menée sur pZome1C avec les oligonucléotides EM3 et TAG-AS,
- et l’ADN codant FPRL1, flanqué du site XbaI de part et d’autre du fragment, issu d’une PCR menée sur pEF-neo-FPRL1 avec les oligonucléotides pEF6-S et EM2
ont été clonés séquentiellement et dans cet ordre dans le vecteur commercial pBluescript SK+. Le fragment EcoRI / NotI codant FPRL1-Tev-ProtA a été extrait de ce vecteur intermédiaire et finalement inséré dans pEF-neo.
Le vecteur pEF-neo-FPRL1-TAP permet l’expression, sous contrôle du promoteur pEF, du récepteur FPRL1 fusionné en position C-terminale à l’étiquette TAP. Pour obtenir ce vecteur, les fragments suivants ont été nécessaires :
- le fragment BstEII/XbaI de pEF-neo-FPRL1, codant la partie C-terminale de FPRL1 - et le fragment PCR obtenu à partir de pZome1C et les oligonucléotides TAG-SX et
Ils ont été insérés simultanément, par ligation à 3 fragments, dans pEF-neo-FPRL1-Tev-ProtA délété, par digestion par BstEII et NotI, de la séquence codant la partie C-terminale de FPRL1 avec l’étiquette Tev-ProtA.
RESULTATS
&
Ce travail de thèse s’est particulièrement attaché à l’étude de la régulation des récepteurs de chimioattractants de la famille des récepteurs des peptides N-formylés. Il est retranscrit ici en quatre volets :
A/ l’activation des récepteurs, avec l’identification de nouveaux agonistes des récepteurs de la famille FPR
B/ la signalisation enclenchée par ces récepteurs, avec un travail centré sur le rôle des β- arrestines dans la régulation des voies de signalisation
C/ la régulation des récepteurs, avec une étude de la phosphorylation de FPRL1 et du rôle des β-arrestines dans l’internalisation de FPRL1
D/ l’utilisation d’une approche globale basée sur l’étude protéomique pour appréhender les partenaires des β-arrestines dans l’ensemble de ces processus.
A/ Identification de nouveaux agonistes des récepteurs de la
famille FPR
Les protéines bactériennes et mitochondriales sont les seules sources naturelles de peptides N-formylés. Les récepteurs des peptides N-formylés (récepteurs de la famille FPR, N-Formyl Peptide Receptor) jouent un rôle essentiel dans la réponse inflammatoire et anti- infectieuse. Leur stimulation par les peptides N-formylés provoque la migration des phagocytes vers les sites d’invasion bactérienne ou de dommages tissulaires. Les peptides N- formylés induisent également la production d’ions superoxyde et la libération de peptides anti-microbiens par les phagocytes. De plus, les souris déficientes en FPR font preuve d’une sensibilité accrue aux infections par la bactérie Listeria monocytogenes (Gao et al., 1999). L’accumulation de phagocytes sur les lieux de dommages tissulaires pourrait résulter de la lyse des cellules et de la libération de protéines mitochondriales. Il a en effet été montré que des extraits de mitochondries humaines ou des protéines mitochondriales peuvent exercer un effet chimiotactique sur des neutrophiles in vitro (Carp, 1982).
Une collection de 17 peptides N-formylés synthétiques d’origine bactérienne ou mitochondriale a été mise à disposition par le professeur Francis Loor de l’Université Louis Pasteur de Strasbourg. Ces peptides ont été testés pour leur capacité à stimuler les récepteurs de chimioattractants de la famille FPR et à induire des réponses cellulaires (signalisation intracellulaire, chimiotactisme et activation de la NADPH oxydase phagocytaire). Le Tableau 6 présente les séquences de ces peptides, quatre sont dérivés de la bactérie Listeria monocytogenes et treize de protéines codées par le génome mitochondrial humain (la NADH déshydrogénase, la cytochrome c oxydase, le cytochrome b et l’ATP synthase).
Type Séquence Origine
formyl-MIVIL protéine inconnue formyl-MIVTLF AHM polypeptide
formyl-MIGWI protéine membranaire LemA Peptides dérivés de
Listeria monocytogenes
formyl-MIGWII protéine membranaire LemA formyl-MPMANL ND1 formyl-MNPLAQ ND2 formyl-MNFALI ND3 formyl-MPLIYM ND4 formyl-MLKLIV ND4 formyl-MTMHTT ND5 formyl-MMYALF ND6 formyl-MFADRW COX I formyl-MAHAAQ COX II
formyl-MTHQSH COX III
formyl-MTPMRK Cytochrome b
formyl-MNENLF ATP synthase sous-unité 6 Peptides dérivés de
protéines mitochondriales humaines
formyl-MPQLNT ATP synthase sous-unité 6 Tableau 6 : Liste des peptides synthétiques testés
NDx : sous-unité x de la NADH déshydrogénase, COX : cytochrome c oxydase
Les récepteurs FPR, FPRL1 et FPRL2 ont été exprimés séparément et de façon stable dans les cellules HL-60 (Christophe et al., 2001; Dahlgren et al., 2000). L’expression est assurée par des plasmides portant les ADNc codant les récepteurs humains sous le contrôle du promoteur du facteur d’élongation humain (pEF1-α), l’un des rares promoteurs efficace dans ce type cellulaire.
Le modèle cellulaire HL-60 est un modèle de choix pour cette étude. En effet, ce sont des cellules de type promyélocytaire qui, bien que n’ayant pas atteint le stade final de différenciation, présentent un certain nombre de caractéristiques des cellules myéloïdes granulocytaires. A l’état non différencié, elles possèdent des protéines G hétérotrimériques susceptibles d’interagir avec les récepteurs de chimioattractants et les composants cytoplasmiques nécessaires à la signalisation intracellulaire conduisant à la mobilisation du calcium et à l’activation des MAP kinases. Toutefois, la surface des cellules non différenciées ne présente pas de récepteurs de chimioattractants. Ces récepteurs doivent être introduits par expression d’un transgène, ce qui confère l’avantage de pouvoir les introduire
individuellement et donc d’en étudier la spécificité. Après différenciation vers un phénotype de type neutrophile, les cellules HL-60 présentent à leur surface des récepteurs chimiotactiques, notamment FPR et FPRL1, et possèdent tous les composants d’une NADPH oxydase fonctionnelle.