Les récepteurs couplés aux protéines G peuvent être phosphorylés au niveau de leur queue cytoplasmique C-terminale et également sur la troisième boucle cytoplasmique qui sépare les domaines transmembranaires V et VI. Cette phosphorylation intervient principalement sur des sérines et thréonines mais les profils de phosphorylation varient d’un récepteur à l’autre (cf. Introduction, § B/II-5-2-1).
Il existe des similitudes fortes au niveau de l’agencement de résidus potentiellement phosphorylables des queues C-terminales des récepteurs FPR et FPRL1 (Figure 13). La queue C-terminale du FPR contient 11 sérines et thréonines dont 8 sont des sites majeurs de phosphorylation après stimulation par agoniste.
Il a été montré que le récepteur FPRL1 est, lui aussi, rapidement phosphorylé après fixation de l’agoniste (Christophe et al., 2001) mais les résidus impliqués de manière primordiale et leur nature ne sont pas encore connus. La queue C-terminale du FPRL1 contient 10 sérines et thréonines potentiellement phosphorylables. Certains de ces résidus sont conservés par rapport à la séquence de la queue C-terminale du FPR mais l’agencement des
sites potentiels de phosphorylation est quelque peu différent.
310 320 330 340 | | | | FPR 297NPMLYVFMGQDFRERLIHALPASLERALTE--DSTQTSDTATNSTLPSAEVALQAK350 | | | | | | FPRL1 298NPMLYVFVGQDFRERLIHSLPTSLERALSE--DSAPTNDTAANSASPPAETELQAM351
Figure 42 : Alignement des domaines C-terminaux des récepteurs FPR et FPRL1 Les résidus sérines et thréonines sont indiqués en gras sur fond gris.
I-1-1 Détermination de la nature des acides aminés phosphorylés du récepteur FPRL1
Pour déterminer la nature des sites de phosphorylation du récepteur FPRL1, une analyse des acides aminés phosphorylés a été menée sur le récepteur FPRL1 activé par le peptide WKYMVM. Ce peptide a été choisi car une étude antérieure avait montré qu’il est paradoxalement le plus efficace pour induire la phosphorylation de FPRL1, même si son affinité pour ce récepteur est moins bonne que celle du peptide WKYMVm (Christophe et al., 2001). Les cellules HEK-293-FPRL1 ont été marquées métaboliquement avec l’isotope 32 du phosphore puis activées par traitement avec le peptide WKYMVM. Le récepteur a été immunoprécipité et les acides aminés résultant de l’hydrolyse acide ménagée du récepteur ont été séparés par éléctrophorèse bidimensionnelle sur plaque de cellulose. La cartographie des acides aminés phosphorylés est présentée en Figure 43 et montre que le récepteur FPRL1 est phosphorylé uniquement sur des sérines et thréonines avec une forte prédominance des sérines.
Figure 43 : Cartographie des acides aminés phosphorylés du récepteur FPRL1 Révélation au PhosphorImager des acides aminés ayant incorporé l’isotope 32 du phosphore lors de la phosphorylation de FPRL1 suite à la stimulation par le peptide WKYMVM (pS : phospho-sérine, pT :
I-1-2 Identification des sites majeurs de phosphorylation du récepteur FPRL1
Il existe 6 sérines plus 4 thréonines au niveau de la queue C-terminale et 2 sérines sur la troisième boucle cytoplasmique du récepteur FPRL1 (Figure 44). Compte tenu de la prédominance des sites de phosphorylation sur la queue cytoplasmique habituellement observée pour les RCPGs, les sites potentiels de phosphorylation du domaine C-terminal ont été mutés dans un premier temps. La thréonine 346 se situe dans le site de reconnaissance de l’anticorps anti-FPRL1 préparé au laboratoire. Cette thréonine n’a pas été remplacée par une alanine afin de maintenir intact l’épitope reconnu par l’anticorps et de ne pas modifier l’efficacité d’immunoprécipitation.
Les 9 sites potentiels de phosphorylation (6 sérines et 3 thréonines) à étudier ont été mutés en alanine par groupes de trois, que nous appelons clusters A, B et C, définis selon leur position (Figure 44) :
- cluster A : T335, S339 et S341 - cluster B : S326, S329 et T332 - cluster C : S316, T319 et S320.
Figure 44 : Schématisation du récepteur FPRL1 avec ses sites potentiels de phosphorylation regroupés en clusters
Q D F R A S E D S A P T T AA N S A S P A E T E L Q A M
Cluster A
Cluster B
Cluster C
ligandFPRL1
cytosol membrane S316 T319 S320 T332, S329, S326 SS S341, S339, T335 R E R LI SL P TS E L H L N P D matrice extracellulaireDes combinaisons de clusters mutés ont été réalisées jusqu’à obtenir un mutant modifié au niveau des 9 sites potentiels de phosphorylation, l’ensemble des mutants est présenté en Tableau 8.
Mutants Séquence C-terminale
FPRL1 WT 313
LIHSLPTSLERALSEDSAPTNDTAANSASPPAETELQAM
351 FPRL1-mutA 313---
S—-TS---S—-S—-T—-A---A-A---
351FPRL1-mutB 313
---S—-TS---A—-A—-A—-T---S-S---
351FPRL1-mutC 313
---A—-AA---S—-S—-T--T---S-S---
351FPRL1-mutAB 313
---S—-TS---A—-A—-A--A---A-A---
351FPRL1-mutAC 313
---A—-AA---S—-S—-T--A---A-A---
351FPRL1-mutBC 313
---A—-AA---A—-A—-A--
T---S-S---
351FPRL1-mutABC 313
---A—-AA---A—-A—-A--A---A-A---
351Tableau 8 : Séquences C-terminales des mutants de phosphorylation de FPRL1 Les résidus potentiellement phosphorylables sont indiqués par un marquage rouge. Les mutations en alanine sont en caractères gras et noirs. Le mutant ABC ne présente plus aucun résidu phosphorylable sur le domaine C-terminal.
Pour obtenir les mutants du récepteur FPRL1, une stratégie de mutagenèse par PCR en plusieurs étapes, adaptée de la méthode de Yon & Fried (Yon et Fried, 1989), a été choisie, elle est détaillée dans le paragraphe B/III-2 des Matériels et Méthodes. Chaque mutant a été introduit dans le vecteur d’expression pcDNA3.1.
Les plasmides codant les différentes formes de FPRL1 ont été introduits dans les cellules HEK-293T qui permettent une expression forte du transgène. Comme précédemment, les cellules ont été marquées métaboliquement avec l’acide orthophosphorique 32P puis activées par traitement avec le peptide WKYMVM. Le récepteur présent dans les lysats cellulaires a été immunoprécipité et l’intensité de sa phosphorylation révélée au PhosphorImager après séparation des protéines par SDS-PAGE. Afin de déterminer l’importance de chaque cluster sur la phosphorylation de FPRL1, les intensités de phosphorylation des formes sauvage ou mutées du récepteur FPRL1 ont été comparées.
Cette comparaison ne peut être faite que si les cellules présentent un nombre équivalent de récepteurs pour chaque mutant testé. Chaque boîte de culture a été ensemencée avec le même nombre de cellules et transfectée avec la même quantité d’ADN. De plus, il a été vérifié par fixation de ligand radioactif que le nombre de récepteurs en surface était du même ordre de grandeur pour les différentes formes de récepteur transfectées.
Figure 45 : Phosphorylation des mutants du récepteur FPRL1
Les différentes formes du récepteur FPRL1 ont été exprimées de façon transitoire dans des cellules HEK-293T marquées métaboliquement au phosphore 32P et activées par le peptide WKYMVM (1 µM, 15 min). Les lysats cellulaires ont été immunoprécipités et séparés par SDS-PAGE avant révélation du signal radioactif avec un PhosphorImager.
Les essais ont été réalisés indépendamment trois fois et les résultats obtenus étaient qualitativement reproductibles. La Figure 45 en montre une image représentative. On peut tout d’abord remarquer une absence totale de phosphorylation du mutant FPRL1-mutABC (Figure 45, dernière piste), alors que le récepteur sauvage présente un signal de phosphorylation assez intense. Cette observation étaye l’hypothèse que les sites de phosphorylation du récepteur FPRL1 se trouvent exclusivement sur les trois clusters, c'est-à- dire sur la queue C-terminale, et que les deux sérines de la troisième boucle cytoplasmique ne participent pas à la phosphorylation de FPRL1 suite à sa stimulation par le peptide WKYMVM.
Les mutations des sérines/thréonines du cluster B entraînent une diminution significative du signal de phosphorylation par rapport au récepteur sauvage, alors que les mutations au niveau du cluster A n’ont aucun effet et que les mutations du cluster C n’affectent qu’assez peu l’intensité de phosphorylation du récepteur. Il semblerait donc que le cluster B comprenne les sites de phosphorylation prépondérants. De même, parmi les combinaisons de clusters mutés deux à deux, ce sont celles comprenant le cluster B muté (FPRL1-mutAB ou -mutBC) qui présentent l’effet le plus drastique sur la diminution de
phosphorylation du récepteur. La phosphorylation du mutant FPRL1-mutAC, qui possède toujours les sérines/thréonines phophorylables du cluster B, est elle aussi diminuée par rapport au récepteur sauvage, mais moins affectée que pour les mutants AB et BC. Les observations sur l’intensité de phosphorylation des mutants simples et doubles convergent donc vers une activité prépondérante des résidus du cluster B dans la phosphorylation du récepteur FPRL1. Les sérines et thréonines présentes dans les deux autres clusters A et C sont tout de même impliquées dans la phosphorylation du récepteur puisqu’il faut muter l’ensemble des trois clusters pour annihiler complètement la phosphorylation induite par la stimulation de FPRL1 par le peptide WKYMVM.
I-1-3 Perspectives
Les conclusions des travaux présentés ci-dessus sont des résultats préliminaires à une étude plus détaillée du processus de phosphorylation de FPRL1. Une telle étude a été menée au laboratoire sur le récepteur de l’anaphylatoxine C5a (Christophe et al., 2000; Giannini et al., 1995; Naik et al., 1997) et dans une autre équipe sur le récepteur FPR (Maestes et al., 1999). Il a été montré dans les deux cas que les étapes de cette phosphorylation répondent à un processus hiérarchique.
L’étude menée sur les mutants du récepteur FPRL1 suggère que les sérines de la troisième boucle cytoplasmique ne sont pas phosphorylées. Toutefois, il est possible que la phosphorylation complète du récepteur FPRL1 sauvage soit soumise à un processus hiérarchique dans lequel la phosphorylation des sérines/thréonines du domaine C-terminal serait un prérequis à la phosphorylation d’autres résidus. Dans ce cas, même si les résidus sérines de la troisième boucle intracellulaire sont des sites effectifs de phosphorylation, leur phosphorylation pourrait être empêchée par l’absence de résidus phosphorylables dans la queue C-terminale. Par conséquent, même si il est fort probable que les sites effectifs de phosphorylation de FPRL1 soient concentrés au niveau de la queue C-terminale du récepteur, on ne peut totalement exclure que les sérines de la troisième boucle intracellulaire puissent être phosphorylées.
La phosphorylation est un processus capital dans la régulation des récepteurs car elle conditionne l’interaction des récepteurs avec les β-arrestines et leur internalisation. Il a été
montré, au laboratoire, que certains résidus sérines étaient nécessaires et suffisants à l’interaction du C5aR avec les β-arrestines et à leur internalisation (Braun et al., 2003) et qu’une forme mutée du C5aR présentant un défaut total de phosphorylation n’était pas capable d’être internalisée (Naik et al., 1997). Le récepteur FPRL1 sauvage interagit avec les β-arrestines fusionnées à l’EGFP lors de la stimulation par le peptide WKYMVM (Huet et al., 2007, Cell. Signal., sous presse, et cf. § C/II-1). Des expériences similaires à celles utilisées dans le cas du récepteur C5aR pourraient être réalisées en co-exprimant de manière transitoire les différentes formes mutées de FPRL1 avec les protéines de fusion β-arrestines fluorescentes. Ainsi, il serait possible de déterminer les sites majeurs de phosphorylation impliqués dans le recrutement des β-arrestines par le FPRL1, comme cela a été fait pour les récepteurs FPR et C5aR, pour lesquels une phosphorylation partielle suffit pour que l’interaction avec la β-arrestine 1 ait lieu (Bennett et al., 2001; Braun et al., 2003).
Les résultats d’analyses préliminaires en immunofluorescence semblent montrer que les mutations affectant les sérines/thréonines du cluster B entraînent un défaut d’internalisation du récepteur. Ces observations purement qualitatives devront être étayées par des données quantitatives, par exemple grâce à des expériences d’internalisation de ligand radioactif.