IV-2-1 Internalisation du récepteur FPRL1-TAP et interaction avec les β- arrestines
Des travaux préliminaires ont été menés pour vérifier que le trafic du récepteur FPRL1 n’était pas affecté par la présence de l’étiquette TAP placée en position C-terminale. Cette étiquette présente en effet une taille approximative de 20 kDa qui, lorsqu’elle est placée à l’extrémité de la queue cytosolique du récepteur, pourrait entraver les interactions protéiques requises pour son internalisation, notamment l’interaction avec les β-arrestines.
La cinétique d’internalisation du récepteur étiqueté et son interaction concomitante avec les β-arrestines ont été examinées par microscopie de fluorescence. Les cellules HEK293- FPRL1-TAP ont été transfectées de manière transitoire avec le vecteur pEGFP-N3-βArr1 ou 2. Ces vecteurs permettent l’expression de l’une ou l’autre des β-arrestines fusionnée en
position C-terminale avec l’EGFP. Le récepteur a été visualisé par immuno-marquage à l'aide d'un anticorps polyclonal commercial anti-FPRL1 et d’un anticorps secondaire couplé à l'Alexa 568 qui émet une fluorescence rouge.
Les résultats obtenus pour les deux isoformes de β-arrestine sont très similaires, aussi, seuls les résultats relatifs à l’une des isoformes (en l’occurrence la β-arrestine 2) sont présentés en Figure 65A. En l’absence d’agoniste, FPRL1-TAP est localisé à la surface cellulaire, comme illustré par le marquage fluorescent intense de la membrane plasmique (Figure 65A). La β-arrestine 2 est distribuée uniformément dans le cytoplasme. L’addition du peptide WKYMVM mène rapidement à la formation de petites vésicules intracellulaires contenant le récepteur et à la redistribution de la β-arrestine2-EGFP. L'association de la β- arrestine avec le récepteur étiqueté dans les vésicules d'endocytose est clairement visible dès 5 minutes de stimulation. La couleur jaune après la superposition des images dénote une co- localisation des deux protéines. L'association de la β-arrestine avec le récepteur est prolongée puisque on retrouve la co-localisation des deux protéines à 30 minutes dans de grosses vésicules périnucléaires.
L’internalisation du récepteur FPRL1-TAP et sa co-localisation avec les β-arrestines présentent un profil similaire à ce qui a été observé pour le récepteur FPRL1 non étiqueté (cf. section C/II-1). Ces expériences montrent donc que la présence de l'étiquette n'influe pas sur le trafic intracellulaire du récepteur FPRL1 après stimulation et que la présence de l'étiquette n’inhibe pas l’interaction avec les β-arrestines.
Dans la perspective d’identifier les protéines associées au récepteur FPRL1 aux différentes étapes de son trafic intracellulaire, il était nécessaire d'établir avec précision la nature des différents compartiments d’endocytose du récepteur FPRL1-TAP et la cinétique de son passage dans ces compartiments.
Certaines protéines ont été décrites comme des marqueurs des différents compartiments d'endocytose des récepteurs. Par exemple, la détection de la protéine EEA1 (Early Endosome Antigen 1) identifie les endosomes précoces, la protéine Rab11 les endosomes de recyclage et la protéine LAMP2 les lysosomes. La co-localisation intracellulaire du récepteur FPRL1-TAP avec ces marqueurs a été examinée par immunofluorescence après stimulation des cellules avec le peptide WKYMVm. Le récepteur est visualisé comme précédemment, les marqueurs des endosomes sont révélés par immuno-marquage à l'aide d'anticorps monoclonaux couplés
au FITC ou d'anticorps spécifiques révélés par des IgGs de souris conjuguées à l’Alexa 488. FITC et Alexa 488 émettent une fluorescence verte.
Figure 65 : Images d’immunofluorescence relatives à l’internalisation du récepteur FPRL1-TAP dans les cellules HEK-293
Les cellules HEK-293 exprimant FPRL1-TAP et la protéine hybride β-arrestine 2-EGFP (A), sont cultivées sur des chambres de culture Lab-Tek® et sont activées avec 100 nM de peptide WKYMVM à 37°C. Après stimulation, les cellules sont fixées à la PFA, perméabilisées et marquées avec des anticorps anti-FPRL1 (A) et anti-EEA1 (B), anti-Rab11 (C) ou LAMP2 (D).
Aux temps courts de stimulation, il existe un co-marquage de petites vésicules avec le récepteur et EEA1, marqueur des endosomes précoces (Figure 65B). Aux temps plus longs de stimulation, on observe un co-marquage de grosses vésicules périnucléaires avec le récepteur FPRL1-TAP et Rab11, marqueur des endosomes de recyclage (Figure 65C). Le fait qu’aucun co-marquage de vésicules avec le récepteur et LAMP2 ne soit détectable même après 45 minutes de stimulation (Figure 65D) suggère que FPRL1-TAP n’est pas aiguillé vers les lysosomes. Ce résultat corrobore une étude présentée par l’équipe de Rescher (Ernst et al., 2004) qui montre, sur la base de données d’immunofluorescence, que FPRL1, exprimé dans les cellules Hela, co-localise avec Rab11 après 15 minutes d’activation par le peptide WKYMVM.
IV-2-2 Tentatives d’étude protéomique sur les complexes formés autour du récepteur FPRL1
La purification des complexes formés autour du récepteur FPRL1-TAP a été conduite dans les mêmes conditions que pour la β-arrestine étiquetée TAP, pour laquelle des résultats satisfaisants avaient été obtenus quant à la technique de purification. Il n’a pas été possible de suivre par Western blot la quantité de récepteur au cours des étapes de purification car des immunoglobulines détachées des billes d’IgG-agarose lors de la première colonne d’affinité migrent sur gel SDS-PAGE à la même hauteur que le récepteur étiqueté clivé (~50 kDa) et masquent l’immunodétection de ce dernier.
Pour visualiser uniquement le récepteur, un marquage métabolique des cellules a été réalisé avec de l’acide orthophosphorique 32P. Après stimulation des cellules avec le peptide WKYMVM, le signal de radioactivité correspondant au récepteur phosphorylé a servi d’indicateur de présence du récepteur lors de la purification.
Le résultat de cette analyse est présenté en Figure 66. Après la première étape de purification sur les billes d’IgG-agarose, le récepteur étiqueté peut être visualisé par le marquage d’une bande de forte intensité à 64 kDa (Figure 66, piste 1). Le récepteur FPRL1- TAP phosphorylé est donc bien extrait des membranes, récupéré dans le lysat cellulaire et capable de se fixer aux billes d’IgG-agarose. La diminution de la masse moléculaire du récepteur (Figure 66, piste 2) montre que le clivage par la protéase TEV se fait correctement. Cependant, une quantité non négligeable de récepteur clivé reste associée aux billes d’IgG- agarose (piste 3). De plus, aucune trace du récepteur n'est retrouvée dans l'éluat final (Figure 66, piste 5) ni même sur les billes de calmoduline (Figure 66, piste 4). L’absence de signal radioactif à la seconde étape de purification peut s’expliquer de deux façons :
- soit le récepteur a connu une déphosphorylation durant le processus de purification malgré la présence d’inhibiteurs de phosphatases. Auquel cas, même si il est présent en fin de purification, il ne peut plus être détecté.
- soit il ne parvient pas à se lier aux billes de calmoduline malgré la présence en position C-terminale du peptide liant la calmoduline (CBP), probablement par inaccessibilité conformationnelle.
Figure 66 : Purification par affinité en tandem du récepteur FPRL1-TAP exprimé dans les cellules HEK-293 marquées métaboliquement au 32P
Les cellules HEK-293-FPRL1-TAP ont été métaboliquement marquées avec de l’acide orthophosphorique [32P] puis stimulées avec 5 µM du peptide WKYMVM pendant 10 min à 37°C. Après lyse des cellules, la purification en tandem est réalisée en prélevant un échantillon après chaque étape : extraction des billes IgG avant clivage par la TEV (1), surnageant après clivage (2), extraction des billes IgG après clivage (3), extraction des billes calmoduline après élution par l’EGTA (4), éluat EGTA (5). Les échantillons sont analysés par SDS-PAGE et autoradiographie.
Des purifications à grande échelle ont néanmoins été réalisées à partir de cellules HEK- 293 ou HL-60 exprimant FPRL1-TAP. Ces analyses protéomiques ont malheureusement confirmé l’absence totale de récepteur et de complexe protéique en fin de purification. La méthode TAP telle qu’elle a été conduite avec succès dans le cadre des β-arrestines-TAP a donc été un échec pour la protéine FPRL1.